急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是临床上常见的急危重症,救治水平亟待提高。在我国,AKI院内发病率为11.6%,死亡率为8.8%,是住院患者最常见的并发症之一[1-2]。而在危重症患者中AKI发病率可超过30%,死亡率甚至可高达50%~80%[3]。肾脏是高灌注器官,在休克、心力衰竭、体外循环或肾移植后常导致肾脏发生缺血再灌注(ischemia reperfusion,I/R)损伤,是引起AKI的最主要原因之一。AKI是慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)的重要危险因素,AKI后35%~71%的患者肾功能不 能完全恢复[4]。存活的AKI患者将来进展为CKD或终末期肾脏病(end stage renal disease,ESRD)的风险分别升高8.8倍和3.3倍[5]。在AKI发生发展过程中,肾小管间质损伤发挥了关键性作用,决定肾脏预后。
诱骗受体2(decoy receptor 2,DcR2)是肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand,TRAIL)的受体之一,与TRAIL结合后可发挥凋亡抵抗作用。研究发现DcR2可在肿瘤细胞中高表达,并可作为肿瘤分化程度及治疗效果的评价指标。我们前期研究发现DcR2在IgA肾病中特异性表达于肾小管上皮细胞,并且肾组织DcR2表达量与肾间质损伤程度呈正相关,但DcR2在缺血再灌注肾损伤中的表达与意义目前尚不清楚[6-7]。DcR2作为跨膜受体,胞外段可被剪切且能在血清中被检测到,但在缺血再灌注大鼠尿液中能否被检测到尚少见文献报道。本研究通过观察大鼠缺血再灌注肾损伤模型中肾组织DcR2及尿DcR2的表达变化,探究其与肾功能及肾组织损伤的关系,以期为下一步研究其在肾组织损伤中的作用奠定基础。
1 材料与方法 1.1 实验动物与材料取清洁级雄性SD大鼠40只,体质量180~200 g,由第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供。将实验动物饲养于动物中心恒温、恒湿、自然光照周期环境中适应1周后进行实验,术前禁食不禁水10 h。兔抗人DcR2单克隆抗体、人DcR2 Elisa试剂盒(英国Abcam公司),EnVision免疫组化试剂盒(丹麦DAKO公司),山羊封闭血清(北京中杉金桥生物技术有限公司)。
1.2 动物模型制备及标本采集实验动物使用完全随机方法分为假手术组(n=5),I/R 60 min组(n=35,按取材时间分为5个时间点:1、3、7、21、35 d,每个时间点7只)。参照文献[6]制作缺血再灌注肾损伤模型。实验中保持体温维持在36.5~37.0 ℃。2%戊巴比妥钠(15 mg/kg)腹腔内注射麻醉大鼠,无菌条件下打开腹腔,充分暴露肾蒂,用微型无创动脉夹夹闭双侧肾蒂,肾脏由鲜红逐渐变为暗红色时提示夹闭成功,I/R 60 min组夹闭60 min。夹闭完成后,松开动脉夹对肾脏进行再灌注,肾脏由暗 红渐变为红色时提示再灌注成功,逐层缝合关闭腹腔,置于常规环境中饲养。假手术组充分暴露肾蒂但不夹闭,60 min后逐层缝合关闭腹腔,置于常规环境中饲养。
再灌注后1、3、7、21、35 d采集血、尿及肾组织标本。2%戊巴比妥钠(15 mg/kg)麻醉模型大鼠,腹部正中切口打开腹腔,经腹主动脉采血2 mL,3 000 r/min离心30 min(室温),留取血清。膀胱穿刺取尿2 mL,3 000 r/min离心15 min(室温),留取上清。使用苦味酸法检测血清肌酐(serum creatinine,Scr),速率法检测尿NAG水平,ELISA测定尿DcR2水平。肾脏去包膜后,部分以4%中性甲醛固定,用于肾组织病理学观察及免疫组化等检测,部分存入-80 ℃冰箱用于后续检测。
1.3 肾组织病理学观察肾组织经4%中性甲醛固定24 h后常规石蜡包埋,分别行PAS、Masson染色观察肾组织病理学改变。对皮髓交界区进行肾小管间质损伤评分,按照肾小管上皮细胞坏死、肾小管扩张和/或萎缩、炎细胞浸润、细胞水肿面积进行评分:0分,无损伤;1分,<25%;2分,25%~50%;3分,51%~75%;4分>75%[8-9]。肾间质纤维化评分依据Masson染色,按阳性区域面积评分:0分,无;1分,<25%;2分,25%~50%;3分,51%~75%;4分,>75%[10]。200倍光学显微镜下每张切片随机观察10个不重叠视野,取平均值作为衡量肾小管损伤的指标。采用盲法,由两名医师共同实施。
1.4 免疫组织化学染色DcR2检测采用EnVision二步法。将肾组织固定包埋,切片厚度2 μm,脱蜡水化,抗原修复,0.3% H2O2甲醇溶液除去内源性过氧化物酶,山羊血清封闭,一抗使用兔抗人DcR2单克隆抗体(1 :500),标本均在同一条件下检测。细胞膜和/或细胞质呈棕黄色为DcR2表达阳性细胞。结果判读使用半定量评分,计算阳性区域占视野的百分比:0分,0%~5%;1分,6%~25%;2分,26%~50%;3分,51%~75%;4分,≥76%[11]。在200倍显微镜下每张切片观察连续10个视野,取其平均值作为衡量指标。采用盲法,由两名医师共同实施。
1.5 ELISA法检测尿DcR2水平按说明书采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测大鼠尿DcR2水平。尿DcR2使用尿肌酐矫正以排除尿液浓缩或稀释的影响,结果使用ng/mmol表示。
1.6 统计学处理采用SPSS 19.0统计软件,实验数据以x±s表示,组内比较使用单因素方差分析、Dunnett’s T3检验,相关性分析使用Pearson检验,以P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组大鼠肾功能变化与假手术组比较,I/R 60 min组大鼠Scr、尿NAG水平于再灌注1 d显著升高并持续上升至第3天达到峰值,随后逐渐下降,但再灌注35 d时仍有80%的大鼠未恢复至正常水平(图 1)。
2.2 各组大鼠肾脏病理学改变
假手术组肾小管上皮细胞形态规则,细胞连接紧密,刷状缘完整。缺血再灌注后皮髓交界区域可见明显的肾小管上皮细胞坏死、脱落,基底膜裸露,细胞管型形成,肾间质水肿,单个核细胞浸润等病理表现。I/R 60 min组第3天病理损伤最重,再灌注后逐渐恢复,至21 d时部分区域出现肾小管萎缩、基底膜增厚、间质纤维化等慢性化表现(图 2~3)。对肾组织进行肾小管间质损伤评分,与假手术组(0分)相比,缺血再灌注 1、3、7、21、35 d损伤评分(分别为12.1±0.6、13.2± 0.7、8.3±0.9、5.5±0.5、5.4±0.5)明显升高(P<0.05)。Masson染色可见缺血再灌注后期肾组织出现明显纤维化(P<0.05),对纤维化区域面积进行评分,分别为7 d(0.3±0.6)、21 d(2.3±0.6)、35 d(3.0±1.0)。
2.3 各组大鼠肾组织DcR2表达与分布
肾组织中DcR2仅在肾小管上皮细胞表达,正常肾组织DcR2低表达。缺血再灌注后肾小管上皮细胞DcR2表达明显增加,与假手术组相比差异有统计学意义(P<0.05)。于缺血再灌注后不同时间点获取双侧肾组织行二步法免疫组化检测可见,再灌注1、3、7 d皮髓交界区域的肾小管管腔中可见大量DcR2阳性的脱落肾小管上皮细胞。I/R 60 min组再灌注第1天DcR2表达明显增加,再灌注第3天DcR2表达进一步升高并到达峰值,至第7天肾小管管腔中仍可见少量DcR2阳性的肾小管上皮细胞,同时在部分肾小管上可见DcR2阳性的肾小管上皮细胞。再灌注第21、35天几乎无脱落的肾小管上皮细胞,但肾小管上可见大量DcR2阳性的肾小管上皮细胞,且DcR2高表达主要见于修复不良的区域,而DcR2低表达部位肾组织修复良好(图 4~5)。
2.4 各组大鼠尿DcR2水平变化
假手术组尿DcR2水平低下,缺血再灌注后尿DcR2水平显著高于假手术组(P<0.05)。I/R 60 min组再灌注第1天尿DcR2水平明显升高,再灌注第3天尿DcR2水平进一步升高并到达峰值,随着再灌注时间延长尿DcR2水平逐渐降低但仍明显高于假手术组(P<0.05,图 6)。
2.5 各组大鼠肾组织及尿液中DcR2表达变化与肾功能及肾损伤评分相关性分析
缺血再灌注后大鼠肾组织DcR2表达量及尿DcR2水平与肾功能及肾损伤评分的相关性分析表明,I/R 60 min大鼠肾组织DcR2表达量、尿DcR2水平均分别与Scr、尿NAG及肾间质损伤评分呈正相关(表 1)。
项目 | 肾组织DcR2 | 尿DcR2 | ||
r值 | P值 | r值 | P值 | |
Scr(μmol/L) | 0.857 | <0.05 | 0.920 | <0.05 |
尿NAG(U/mmol) | 0.909 | <0.05 | 0.847 | <0.05 |
肾间质损伤评分 | 0.888 | <0.05 | 0.792 | <0.05 |
2.6 各组大鼠肾组织DcR2表达与肾小管间质纤维化程度的关系
Masson染色结果显示I/R 60 min组大鼠再灌注第21天时出现明显肾小管间质纤维化表现;Pearson相关性分析表明缺血再灌注慢性期(>7 d),肾组织DcR2表达量与肾小管间质纤维化程度呈显著正相关(r=0.885,P<0.05),提示DcR2可能在肾小管间质纤维化中具有重要作用。
3 讨论AKI主要表现为肾功能短时间内迅速下降,是临床上常见的危重疾病。AKI不仅具有高发病率、高死亡率的特点,与CKD进展也具有密不可分的关系。因此,了解缺血再灌注后肾脏病理损伤过程及机制对改善AKI不良预后至关重要。
肾小管富含丰富的线粒体,代谢活跃,在缺血、缺氧等应激因素刺激下肾小管细胞可发生严重的、广泛的损伤[12]。主要表现为皮髓交界区域尤其是肾小管外髓S3段细胞发生坏死、脱落[13],阻塞肾小管导致肾小球滤过率降低[14-15]。肾小管上皮细胞受到缺血、缺氧等应激刺激后可以发生坏死、凋亡、衰老等改变,细胞凋亡对于维持稳定的组织结构和功能至关重要,但是凋亡失衡又与多种疾病的发生、发展密切相关。凋亡水平过高,可能导致器官萎缩、纤维化,而凋亡水平过低可能又会导致肿瘤的发生[16]。TRAIL是死亡信号途径的重要分子,在人体内正常表达,属于肿瘤坏死因子超家族。TRAIL受体有5个:死亡受体(DR4和DR5)、诱骗受体(DcR1和DcR2)、骨原壳蛋白(osteoprotegerin,OPG)。TRAIL通过与DR4和DR5结合发挥促凋亡效应,而DcR1和DcR2因缺少完整的死亡结构域与TRAIL结合,导致凋亡抵抗。DcR2是凋亡抵抗的重要原因[17]。研究证明,DcR2高表达可使暴露于TRAIL的前列腺癌细胞、大肠癌细胞以及宫颈癌细胞等肿瘤细胞发生凋亡抵抗,而下调DcR2则促进细胞凋亡[18]。
缺血再灌注后,肾小管上皮细胞发生坏死或凋亡,从基底膜脱落后阻塞肾小管管腔,导致肾小球滤过率降低,肾损伤加重。残存的肾小管上皮细胞可以发生去分化、迁移、再分化为正常的肾小管上皮细胞,有助于肾组织结构和功能的恢复。DcR2作为TRAIL的诱骗受体具有凋亡抵抗作用。研究表明DcR2也可作为细胞衰老的标志,在衰老的肿瘤细胞和成纤维细胞以及体外高糖培养的HK-2细胞中高表达[18]。由于衰老细胞具有凋亡抵抗的特性使得肾缺血再灌注后发生衰老的肾小管上皮细胞不断积聚,并通过分泌大量促炎因子、促纤维化因子等衰老相关分泌表型(senescence associated secretory phenotype,SASP)引起局部炎症反应和肾小管间质纤维化[19- 20]。研究[18]发现,DcR2可以作为肿瘤分化程度及治疗效果的指标。另有研究通过干预DcR2表达后发现肝脏纤维化程度减轻[21]。提示DcR2可能在疾病进展过程中发挥重要作用。本研究发现,缺血再灌注后肾组织损伤部位DcR2表达显著增加,并且与肾功能及组织损伤程度具有明显相关性。因此,我们推测,肾脏缺血再灌注后DcR2阳性的细胞发挥了凋亡抵抗效应,滞留于损伤部位并持续分泌大量促炎因子和促纤维化因子等SASP,可能与疾病进展有关。
此外,DcR2是TRAIL的Ⅱ型跨膜受体,胞外段可被蛋白酶剪切并能在体液中被检测到[17]。既往研究发现血清DcR2水平可用于评估心脏移植后的排异反应。本研究发现,尿DcR2水平在I/R 60 min组明显升高,并且尿DcR2水平分别与Scr(r=0.920,P<0.05)、尿NAG(r=0.847,P<0.05)及肾间质损伤评分(r=0.792,P<0.05)明显正相关,表明尿DcR2也可以反映肾功能损害及肾组织损伤的严重程度。
本研究发现缺血再灌注后肾组织DcR2的表达量及尿DcR2水平与肾功能及肾组织损伤程度明显正相关,进一步观察发现缺血再灌注慢性期DcR2表达逐渐增加,与肾小管间质纤维化程度明显正相关。然而,DcR2在缺血再灌注后肾小管间质纤维化进展中发挥的作用机制有待进一步研究。综上所述,DcR2表达水平可以反映AKI后肾组织损伤的严重程度,同时又具有可以通过尿液检测的优势,为无创性监测AKI患者的疾病进展提供了新的方法,并有望为延缓AKI-CKD进展提供新的思路。
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