肿瘤的生长离不开营养。通过抑制肿瘤血管的形成,阻断肿瘤细胞的营养供应,能有效地杀死肿瘤细胞。1997年,O'Reilly等[1]从小鼠内皮细胞瘤中分离得到一种抑制肿瘤新生血管形成的因子——内皮抑素。内皮抑素(endostatin,ES)不仅能有效抑制肿瘤血管生成,还能抑制肿瘤的浸润转移[2],显示出强大的抗肿瘤活性和低毒性,是目前作用最强、实验效果最好的肿瘤血管生成抑制剂。相关研究表明,内皮抑素联合化疗在晚期非小细胞肺癌的治疗中取得了显著的效果[3-5]。然而,内皮抑素在体内容易被代谢或分解,半衰期短,限制了其最大程度发挥抗肿瘤新生血管的作用。
目前,纳米控释体系常被用于解决药物半衰期短的问题。壳聚糖(chitosan,CS)是一种天然多糖,具有高度的稳定性、安全性、无毒性、亲水性和生物可降解性,常被用作载体材料制备载药纳米粒[6]。许向阳等[7]成功利用壳聚糖制备了载内皮抑素纳米粒,但并未对内皮抑素壳聚糖纳米粒的体内抗肿瘤活性进行评价。本研究改良了内皮抑素壳聚糖纳米粒的制备方法,建立小鼠Lewis肺癌移植瘤模型,观察内皮抑素纳米粒联合顺铂(cisplatin,DDP)对肺癌模型的治疗效果。
1 材料与方法 1.1 细胞株和动物小鼠肺癌Lewis细胞株由西南医科大学附属医院肿瘤科实验室提供。C57BL/6J小鼠购自北京华阜康生物科技有限公司,实验动物许可证编号为SCXK(京)2014-0004。本课题已通过西南医科大学动物保护和应用委员会批准。
1.2 药品、试剂和仪器内皮抑素原液(11.2 mg/mL,由江苏先声药业有限公司馈赠,批号:YY2015026);顺铂(10 mg/mL,江苏豪森药业,批号:150401);壳聚糖(脱乙酰度≥95%,黏度100~200 mPa·s,上海阿拉丁试剂有限公司);三聚磷酸钠(TPP,国药集团化学试剂有限公司);BCA增强试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司);海藻糖(美国Sigma公司);兔抗鼠CD31多克隆抗体、荧光标记山羊抗兔IgG、DAB显色液(南京巴傲得生物有限公司);小鼠VEGF、Endostatin ELISA试剂盒(美国BD公司);其余试剂均为市售分析纯。
高速冷冻台式离心机(美国Beckman公司);纳米激光粒度电位分析仪(美国Brookhaven公司);JEM-2100透射电子显微镜(日本电子公司);全波长酶标仪(瑞士Tecan公司);FD-1 冷冻干燥机(北京博医康技术公司)。
1.3 载内皮抑素壳聚糖纳米粒(ES-NPs)的制备采用离子凝胶法制备内皮抑素壳聚糖纳米粒,药物用量参考文献[7-8]。将160 mg壳聚糖溶于1%醋酸溶液中,制成壳聚糖水溶液(pH=5,1 mg/mL)。随后,将壳聚糖溶液平均分为4份(每份40 mL),分别加入内皮抑素原液0、250、500、1 000 μL。在室温、磁力搅拌条件下,将溶解于去离子水中的TPP 溶液(1 mg/mL)8 mL分别逐滴加入上述溶液中。持续搅拌2 h,形成带有蓝光的纳米粒胶体溶液。
将制得的四胶体溶液分别在4 ℃下高速离心(13 000 r/min)30 min,收集沉淀物,加入去离子水复溶,用海藻糖作为冻干保护剂,在冷冻干燥机中(-55 ℃)干燥48 h,即得内皮抑素壳聚糖纳米粒(endostatin-loaded chitosan nanoparticles,ES-NPs)冻干粉。每个样本重复3次。
1.4 ES-NPs形态及包封率、载药量测定室温条件下,取ES-NPs适量,加入蒸馏水稀释,滴加在铜网上。用2%的磷钨酸溶液负染2 min,自然干燥后于透射电镜下观察纳米粒形态并拍照。
将各样本纳米粒溶液用蒸馏水稀释到适宜浓度,超声分散,纳米激光粒度电位分析仪测定各样本粒径分布及Zeta电位。
采用BCA法检测各样本内皮抑素壳聚糖纳米粒混悬液高速离心后上清液中的内皮抑素含量[9-10],即游离药量,检测波长562 nm。纳米粒冷冻干燥后精确称量,即得纳米粒总质量。各样本ES-NPs载药量(LE%)及包封率(EE%)按公式计算。根据各样本的包封率、载药量以及粒径分布等综合分析,选出最佳的样本用于后续实验。
载药量=(投药量-游离药量)/纳米粒总质量×100%
包封率=(投药量-游离药量)/投药量×100%
1.5 ES-NPs体外释放研究精密称取一定量的ES-NPs冻干粉并溶于2 mL PBS溶液中,充分分散,形成纳米粒溶液。随后将纳米粒溶液置于水浴振荡器中,37 ℃,100 r/min下持续震荡。在一定间歇时间后(0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7 d),4 ℃下高速离心(13 000 r/min)30 min,采用BCA法测上清液游离内皮抑素浓度,同时补充2 mL新鲜释放介质。计算各个时间点的平均累积释放量,并作出释放曲线。
1.6 体内抗肿瘤研究 1.6.1 小鼠Lewis肺癌移植瘤模型建立将Lewis肺癌细胞快速解冻复苏,培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液中,置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。取对数生长期的细胞,于体外传代3次后,消化计数,调整细胞数为1×107/mL,取细胞液0.1 mL/只接种于小鼠右侧腋窝。2周后,待小鼠右侧腋窝形成体积约200 mm3的质硬肿块待用。
1.6.2 实验分组及给药方式90只荷瘤小鼠按随机数字表法分为6组,每组15只。①对照组:腹腔注射0.9%氯化钠注射液,第1~14天;②DDP组:腹腔注射DDP,第1、8天;③ES组:腹腔注射ES,第1~14天;④ES-NPs组:腹腔注射ES-NPs,第1~14天;⑤ES+DDP组:腹腔注射ES(第1~14天)+DDP(第1、8天);⑥ES-NPs+DDP组:腹腔注射ES-NPs(第1~14天)+DDP(第1、8天)。药物用量参照文献[11-12]:ES,10 mg/(kg·d);DDP,4 mg/(kg·d);0.9%氯化钠注射液,0.2 mL/d;ES-NPs的用量依据所载入的ES量确定,保证注入小鼠内的ES为10 mg/(kg·d)。
1.6.3 肿瘤体积及肿瘤生长曲线从用药第1天开始,每2天用游标卡尺测量肿瘤的最长径(a)以及其垂直径(b),计算肿瘤体积(V),直至第21天观察结束。V=ab2/2,取各组平均值,绘制肿瘤生长曲线。第21天观察结束时,各组老鼠分别眼球取血后,以颈椎脱臼法处死,完整剥离肿瘤块,称量计算抑瘤率。
抑瘤率=(1-实验组瘤体质量/对照组瘤体质量) ×100%
1.6.4 ELISA检测小鼠血清中VEGF和内皮抑素水平各组小鼠眼球取血后,血清在室温下静置1 h,4 ℃、1 800×g离心10 min,收集上清液,于-80 ℃冰箱中保存。采用ELISA法检测各组血清中的VEGF和内皮抑素的质量浓度,具体操作参见ELISA试剂盒说明书进行。
1.6.5 免疫组化法检测微血管密度(MVD)观察结束后剥取的肿瘤块,用中性甲醛溶液固定,石蜡包埋切片。参照试剂盒方法步骤,行二甲苯脱蜡,水化,3%H2O2阻断10 min,组织抗原修复,正常山羊血清封闭10 min,加入1:100体积比稀释的兔抗鼠 CD31多克隆抗体,4 ℃反应过夜;再加入荧光标记的山羊抗兔IgG,室温孵育15 min;DAB显色,苏木精复染,中性树胶封固。
肿瘤微血管的计数参照Weidber等[13]的方法,每组选取5张切片,先在低倍镜下扫视整个切片,选取5个热点(血管染色最多的区域),再在高倍镜(400倍)下计数CD31阳性表达的微血管数目,取平均值。
1.7 统计学方法采用SPSS 23.0统计软件进行数据处理和分析。数据以x±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验(方差齐)或Dunnett T3检验(方差不齐),P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 ES-NPs的形态及相关性质成功制备出包载不同浓度内皮抑素的壳聚糖纳米粒。由表 1可知,空载的壳聚糖纳米粒的粒径为(211.50±1.58)nm;载药后,纳米粒的粒径相应增加,载药越多,粒径越大。同时发现,随着加入的内皮抑素原液量的增加,纳米粒的载药量也随之增加,但包封率却逐渐下降。因此,综合以上因素,我们选择样本3为最适ES-NPs,用于后续实验研究。
样本号 | 加入ES剂量(μL) | 粒径(d/nm) | 多分散系数 | Zeta电位(mV) | 包封率(%) | 载药量(%) |
1 | 0 | 211.50±1.58 | 0.223±0.005 | -38.36±0.11 | - | - |
2 | 250 | 227.31±2.64 | 0.238±0.017 | -38.17±0.41 | 78.25±2.10 | 6.08±0.16 |
3 | 500 | 246.89±3.50 | 0.285±0.008 | -36.34±0.16 | 74.81±4.23 | 10.74±0.16 |
4 | 1 000 | 247.91±2.38 | 0.289±0.001 | -32.21±0.32 | 62.42±2.90 | 11.46±0.54 |
样本3的粒径为(246.89±3.50)nm,包封率为(74.81±4.23)%,载药量为(10.74±0.16)%,分散较为均匀,体系较为稳定(图 1A)。同时,透射电镜结果表明ES-NPs外观呈球形,大小均匀(图 1B)。
组别 | 肿瘤质量 (m/g) | 抑瘤率(%) |
对照组 | 9.86±0.32 | - |
ES组 | 5.65±0.35a | 42.70 |
DDP组 | 5.31±0.48a | 46.15 |
ES-NPs组 | 3.71±0.38ab | 62.37 |
ES+DDP组 | 3.49±0.36ab | 64.60 |
ES-NPs+DDP组 | 2.32±0.21abc | 76.47 |
a:P<0.05,与对照组比较:b:P<0.05,与ES组比较;c:P<0.05,与ES+DDP组比较 |
2.4 各组小鼠血清中内皮抑素和VEGF的水平比较
与对照组相比,各实验组血清中内皮抑素水平均明显提高,差异具有统计学意义(P<0.05)。ES-NPs+DDP组血清中内皮抑素的含量为(165.086±9.103)pg/mL,明显高于ES组、ES+DDP组和DDP组(P<0.05),但与ES-NPs组之间的差异无统计学意义(P=0.928,图 3A)。
和内皮抑素的水平相反,对照组血清VEGF水平明显高于其余各组(P<0.05)。由图 3B可知,ES-NPs组血清VEGF水平明显低于ES组和ES+DDP组(P<0.05),而ES-NPs+DDP组的VEGF水平明显低于其余各组(P<0.05)。
2.5 各组小鼠肿瘤组织中MVD比较免疫组化结果提示:ES-NPs和ES-NPs+DDP组的MVD计数明显低于其他各组(P<0.05)。与ES-NPs 相比,ES-NPs+DDP组的MVD计数更低,差异具有统计学意义(P=0.008,图 4)。
3 讨论
研究表明,内皮抑素可特异性的作用于肿瘤新生血管的内皮细胞,并抑制其增殖、迁徙,诱导其凋亡,同时还可以调节肿瘤细胞表面血管生长因子的表达及蛋白酶的活性,从而多靶点的发挥抗血管生成作用[14-16]。因此,内皮抑素在肿瘤的抗血管治疗中占据着重要的地位。但内皮抑素是一种蛋白多肽类药物,在体内容易被广泛分布的蛋白水解酶降解,同时容易被肾脏清除[17],导致其半衰期过短,难以在体内长时间保留,缺乏稳定性,从而无法充分发挥抗血管作用。目前有多项研究致力于延长内皮抑素的半衰期,包括聚乙二醇(PEG)化内皮抑素[18],制备内皮抑素缓释微球[19]和内皮抑素纳米粒。与其他方法相比,纳米粒具有良好的肿瘤细胞靶向性、易被细胞摄取、并且能通过静脉给药[20],因而受到广泛关注。聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)[9]和聚乳酸(PLA)[10]等材料就曾被用于制备内皮抑素纳米粒,但在制备过程这些材料需要有机溶液的辅佐,可能对蛋白药物的活性产生影响。而壳聚糖纳米粒制备过程温和,不涉及有机溶剂,能起到很好的保护蛋白作用[21]。因此,本研究采取壳聚糖为载体制备内皮抑素纳米粒。
本结果显示,加入不同剂量的ES对ES-NPs的粒径、包封率、载药量均有影响。分析发现,在40 mL壳聚糖溶液(1 mg/mL)中加入500 μL ES(11.2 mg/mL)制成的ES-NPs在保证较高包封率的同时也具有合适的载药量和粒径,能满足治疗的需要。
为了考察ES-NPs的释药特性,我们进行了体外释放研究。ES-NPs中药物的释放存在两个明显的过程:突释期和缓慢释放期。由于部分ES只单纯地物理吸附于纳米粒表面,导致了突释期的发生[22]。其后,包裹在纳米粒内部的ES通过纳米粒孔道以扩散方式稳定释放,到了第7天,有(60.22±2.58)%的药物从纳米粒中释放出来。体外释放证明了ES-NPs的缓释性,为其体内抗肿瘤的研究奠定了基础。
随后在小鼠Lewis肺癌模型上探讨了ES-NPs的抗肿瘤活性以及联合DDP的作用效果。本实验结果显示,ES-NPs的抑瘤作用明显强于ES(P<0.05)。大量研究证实,ES联合DDP有协同抗肿瘤作用[23-25]。本研究也得出了相同的结论,ES+DDP组的抑瘤作用明显强于单独ES组和单独DDP组。在比较2个联合治疗组的作用效果时发现,治疗开始时2个联合组的治疗效果差异并不明显,可第15天以后,ES-NPs+DDP的治疗效果明显优于ES+DDP组。我们推测,这是由于ES-NPs延长了ES在体内的保留时间,起到了更长时间的抑制肿瘤血管的作用;而ES+DDP组虽然在刚开始也取得了较好的疗效,但由于ES在体内的保留时间短,给药结束后又未进行补充,部分肿瘤血管失去抑制又重新开始生长,给了肿瘤细胞重新快速增殖的机会。这在免疫组化和血清分析中得到证实。
ES-NPs+DDP组肿瘤组织的MVD明显低于ES+DDP组(P<0.05),说明对肿瘤血管作用的差别可能是导致2个联合组治疗效果不同的主要原因之一。同时,观察结束时ES-NPs组和ES-NPs+DDP组血清中的内皮抑素浓度明显高于其他各组(P值均<0.05),而促血管生长因子VEGF明显低于其他各组(P值均<0.05),表明ES-NPs明显延长了ES在体内的保留时间。给药结束后7 d,血清中仍有较高浓度,而ES又能降低VEGF蛋白的表达[26]。这就能解释ES-NPs+DDP组和ES-NPs组低MVD的原因。但ES-NPs+DDP组对肿瘤血管的作用强于ES-NPs组,我们猜测与DDP的作用有关,DDP在杀死肿瘤细胞的同时,也能使肿瘤细胞自分泌VEGF减少,从而一定程度影响到肿瘤血管生成。
综上所述,ES-NPs制备简便,具有明显的缓释性和较强的肿瘤血管抑制作用,其联合顺铂能明显抑制Lewis肺癌移植瘤生长。
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