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水通道蛋白亚型3在脓毒症肺血管通透性中的作用及SS-31对其的影响
王平, 吴惠玲, 朱娱, 李涛, 刘良明     
400042 重庆, 第三军医大学大坪医院野战外科研究所第二研究室, 创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室
[摘要] 目的 探讨水通道蛋白亚型3(aquaporin 3,Aqp3)在脓毒症肺血管通透性中的作用及SS-31 对其的影响。 方法 采用SD大鼠盲肠结扎穿孔复制脓毒症模型。在整体动物水平上分为假手术组,脓毒症6、12 h组,在离体细胞水平分为空白对照组,LPS刺激6、12 h组,分别观察脓毒症和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激6、12 h后肺静脉Aqp3的表达和血管通透性的变化,以及干扰Aqp3后内皮细胞通透性的变化。进一步观察抗氧化剂SS-31对Aqp3的表达与血管通透性的作用。 结果 脓毒症和LPS刺激内皮细胞后Aqp3表达和肺血管通透性均明显增加,与假手术组和空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。用RNAi抑制Aqp3的表达,可明显拮抗由LPS刺激引起的内皮细胞通透性增加,与LPS刺激组相比差异有统计学 意义(P<0.05)。在整体动物和离体细胞水平应用抗氧化剂SS-31均可降低由脓毒症和LPS刺激引起的Aqp3表达和血管通透性的增加,与脓毒症和LPS刺激组比较差异有统计学意义(P<0.05)。 结论 Aqp3参与了脓毒症肺血管通透性的调节,抗氧化措施可降低脓毒症肺血管通透性及下调Aqp3的表达。
[关键词] 脓毒症     水通道蛋白亚型3     SS-31     血管通透性    
Role of aquaporin 3 in pulmonary vascular leakage after sepsis and effect of SS-31 in the process in vitro and in vivo
Wang Ping , Wu Huiling , Zhu Yu , Li Tao , Liu Liangming     
State Key Laboratory of Trauma, Burns and Combined Injury, Department 2, Institute of Surgery Research, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400042, China
Supported by the General Program of National Natural Science Foundation of China(81570441)
Corresponding author: Liu Liangming, E-mail:liangmingliu@yahoo.com
[Abstract] Objective To investigate the role of aquaporin 3 (Aqp3) in pulmonary vascular leakage in rats after sepsis and determine the effect of antioxidant SS-31 in the process. Methods Cecal ligation and puncture were adopted to induce sepsis rats, and then the rats were divided into sham group, sepsis 6-h group and sepsis 12-h group. Pulmonary vein endothelial cells (VECs) were cultured in vitro, and divided into blank control, group treated with lipopolysaccharide (LPS) for 6 h, and group treated with LPS for 12 h. The changes of Aqp3 and vascular permeability were observed, and the effect of Aqp3 inhibition based on RNAi on vascular permeability was further investigated. Effect of antioxidant SS-31 on the expression of Aqp3 and vascular permeability were also measured. Results Aqp3 expression and pulmonary vascular permeability were significantly increased in the sepsis rats and LPS-stimulated VECs (P<0.05). Inhibition of Aqp3 via RNAi could antagonize LPS-induced vascular permeability increase (P<0.05). Meanwhile, antioxidant SS-31 could abolish the sepsis or LPS-induced increase of Aqp3 expression and vascular permeability (P<0.05). Conclusion Aqp3 participates in the regulation of pulmonary vascular permeability in sepsis, and antioxidant can reduce sepsis pulmonary vascular permeability and down-regulate Aqp3 expression.
[Key words] sepsis     aquaporin 3     SS-31     vascular permeability    

脓毒症是由感染引起的全身炎症反应综合征,可导致组织和器官发生严重损伤,死亡率很高。研究证实脓毒症后血管通透性显著增加[1],是导致脓毒症器官功能损伤的重要因素之一。水通道蛋白(aquaporins,Aqps)是一组与水通透性有关的膜转运蛋白。迄今在大鼠体内发现有12种Aqps。多种Aqps的表达及功能异常在疾病的发生、发展过程中有重要作用。Aqp3在血管组织中有大量表达,前期研究显示脓毒症后肺血管Aqp3表达明显升高,其是否参与脓毒症肺血管通透性的调节尚不清楚。氧化应激是脓毒症重要的病理生理过程,Szeto-Schiller-31 (SS-31,H-D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2)是一种新型的抗氧化肽,对多种疾病具有保护作用。SS-31能否通过Aqp3改善脓毒症肺血管通透性未见相关研究。因此,本研究从整体动物和离体细胞水平探讨Aqp3在脓毒症肺血管通透性中的作用及SS-31对其的影响,为临床脓毒症血管通透性的治疗提供全新的思路。

1 材料与方法 1.1 实验动物及主要试剂

成年SPF级SD大鼠,12周龄,雌雄各半,体质量180~220 g,由第三军医大学野战外科研究所实验动物中心提供,实验动物生产许可证号:SCXK(渝)2012-0005,实验动物使用许可证号:SYXK(渝)2012-0010。内皮细胞培养基DMEM-F12购自HyClone公司;胎牛血清(FBS)购自Science-cell公司;FITC标记牛血清白蛋白(FITC-BSA)购自Sigma-Aldrich公司;Aqp3多克隆兔抗大鼠抗体购自Abcam公司;β-actin山羊抗大鼠抗体购自美国Life technologies公司;SS-31购自杭州中肽生化有限公司;Transwell 6孔板购自美国Costar公司。

1.2 方法

1.2.1 脓毒症模型制备

参考本实验室已建立的盲肠结扎穿孔术(cecal ligation and puncture,CLP)复制脓毒症模型。SD大鼠以30 mg/kg戊苯巴比妥钠进行腹腔麻醉。开腹,暴露盲肠,排除盲端气泡,距盲端3 cm处结扎,用棱形针穿孔,穿孔大小约为0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm,使粪便自由流入腹腔,引起感染。假手术组仅进行开腹及关腹,不进行处理盲肠。模型成功率85%以上[2]

1.2.2 肺静脉原代内皮细胞准备

3%戊巴比妥钠麻醉、固定大鼠后,暴露肺脏,取肺左右侧肺静脉,切成小块,均匀铺于培养瓶中,3 d后去组织培养细胞,细胞用Ⅷ和CD31鉴定,阳性率90%以上。培养至3~5代用于实验。

1.2.3 脓毒症肺血管通透性和Aqp3表达的变化

SD大鼠48只,分为3组(每组16只):假手术组、脓毒症6 h组、脓毒症12 h组。其中24只大鼠(每组8只)用于检测肺血管通透性,24只大鼠(每组8只)用于提取肺静脉组织蛋白检测Aqp3的蛋白变化。采用CLP复制脓毒症模型,在CLP后6、12 h麻醉固定大鼠,经颈静脉注射荧光白蛋白(9 mg/kg),0.5 h后冲洗肺部,取左肺上叶,称量,记录肺干质量,剪碎,匀浆后离心取上清液,使用500 nm波长检测荧光强度。以上清液荧光强度/肺干质量代表肺血管通透性。同时取相应各时相点大鼠肺静脉,采用Western blot检测Aqp3的蛋白表达,分析Aqp3表达与肺血管通透性之间的关系。

1.2.4 脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对肺静脉内皮细胞通透性和Aqp3表达的影响及Aqp3干扰后内皮细胞通透性的变化

实验分3组:取肺静脉原代内皮细胞,用1 μg/mL浓度的LPS刺激细胞6、12 h为LPS刺激6、12 h组,以未经LPS刺激的正常细胞作为空白对照组。取1×105/孔细胞接种于Transwell,培养48 h后,上腔加入10 μL 2 mg/mL FITC-BSA,4 h后从下室取200 μL培养基至96孔板测荧光量,将下腔实际透过的荧光量占10 μL荧光白蛋白总荧光量比率作为 FITC-BSA透过率,以反映肺静脉内皮细胞的通透性[3]。同时提取LPS刺激内皮细胞后的相应时相点细胞总蛋白,用Western blot检测Aqp3蛋白表达。为进一步验证Aqp3对肺静脉内皮细胞通透性的影响,在RNA水平上用PCR检测3个RNAi片段(RNAi 1~3)处理Aqp3,选择有效的RNAi片段(LipofectamineTM2000转染 siRNA,50 nmol/L),24 h后观察其对通透性的影响。

1.2.5 SS-31对脓毒症肺血管通透性和Aqp3的影响

复制脓毒症模型时,经尾静脉注射0.5、1、3 mg/kg SS-31,观察CLP 12 h后大鼠肺血管通透性和Aqp3表达的变化。离体细胞水平以0.1 μg/mL SS-31预处理后,观察LPS刺激后Aqp3和内皮细胞通透性变化。

1.3 统计学分析

采用SPSS 13.0统计软件,数据以x±s表示,多组比较采用方差分析,两组均数比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 脓毒症肺血管通透性和Aqp3表达的变化

与假手术组相比,CLP后不同时相点的肺血管通透性均有明显升高(P<0.05),脓毒症6、12 h组的肺血管通透性分别增加28.61%、78.14%(图 1A)。同时,Western blot检测结果显示脓毒症6、12 h大鼠肺血管中Aqp3表达水平明显升高(P<0.05,图 1BC)。表明Aqp3表达和肺血管通透性有关。

a:P<0.05,b:P<0.01,与假手术组比较 1:假手术组;2:脓毒症6 h组;3:脓毒症12 h组;A:脓毒症不同时相点肺血管通透性变化;B:Western blot检测各组Aqp3的表达;C:半定量分析各组Aqp3相对表达量 图 1 脓毒症不同时相点大鼠肺血管通透性及Aqp3表达变化

2.2 LPS刺激肺静脉内皮细胞后通透性和Aqp3的变化以及Aqp3干扰后内皮细胞通透性影响

与空白对照组相比,LPS刺激6、12 h组肺静脉内皮细胞的通透性均有升高(P<0.05,图 2A)。同时LPS刺激肺静脉内皮细胞后Aqp3蛋白水平也明显升高(P<0.05,图 2BC)。为进一步验证Aqp3对通透性的作用,采用RNAi处理Aqp3,干扰片段1、2效果明显(图 2DE)。选用片段2干扰Aqp3可明显拮抗由LPS刺激引起的单层内皮细胞FITC-BSA透过率的增加(P<0.05,图 2F)。

a:P<0.01,与空白对照组比较;b: P<0.05,与LPS刺激组比较 1、4、5:空白对照组;2:LPS刺激6 h组;3:LPS刺激12 h组;6:LPS刺激组;7:LPS+Aqp3干扰组;RNAi1~3:分别为采用RNAi片段1~3处理组;A:LPS刺激肺静脉内皮细胞不同时相点内皮细胞通透性变化;B、C: Western blot检测LPS刺激后Aqp3表达变化;D、E:PCR检测Aqp3干扰片段效果及半定量分析结果;F:Aqp3干扰后内皮细胞通透性的变化 图 2 LPS刺激不同时相点对肺静脉内皮细胞通透性的影响及Aqp3表达变化

2.3 SS-31对脓毒症肺血管通透性和Aqp3的影响

脓毒症模型经尾静脉注射SS-31 0.5、1、3 mg/kg后,脓毒症肺血管的通透性降低。与脓毒症组相比,各组分别降低14.08%(0.5 mg/kg)、19.01%(1 mg/kg)、41.25%(3 mg/kg),见图 3A。同时发现给药后大鼠肺静脉Aqp3的蛋白表达较脓毒症大鼠明显下降(P<0.05,图 3BC)。

a:P<0.01,与假手术组比较;b:P<0.05,c: P<0.01,与脓毒症组比较 A:不同浓度的SS-31处理脓毒症大鼠后肺血管通透性变化 1:假手术组;2:脓毒症组;3~5:分别为0.5、1、3 mg/mL SS-31处理组;B、C:SS-31处理后大鼠肺静脉Aqp3表达变化 1:假手术组;2:脓毒症组;3:SS-31处理组 图 3 不同浓度的SS-31对脓毒症大鼠肺血管通透性及Aqp3表达的影响

2.4 SS-31对LPS刺激的肺静脉内皮细胞通透性和Aqp3的影响

在LPS刺激肺静脉内皮细胞的同时予以SS-31处理后,肺静脉内皮细胞的通透性降低(图 4A);与LPS刺激的肺静脉内皮细胞相比,SS-31处理的肺静脉内皮细胞Aqp3蛋白表达明显降低(P<0.05,图 4BC)。

a:P<0.01,与空白对照组比较;b:P<0.05,c:P<0.01,与LPS刺激组比较 1:空白对照组;2:LPS刺激组;3:SS-31预处理后的LPS刺激组;A:SS-31处理LPS刺激的肺静脉内皮细胞通透性变化;B、C:SS-31处理LPS刺激的肺静脉内皮细胞Aqp3表达变化 图 4 SS-31处理LPS刺激的肺静脉内皮细胞通透性及Aqp3表达变化

3 讨论

本研究通过在整体动物水平和离体细胞水平观察脓毒症和LPS刺激不同时相点肺血管通透性和Aqp3的表达变化,发现随着脓毒症肺血管通透性的增加,Aqp3的表达明显增强。进一步研究发现,在离体细胞水平干扰Aqp3后,可明显拮抗LPS刺激的肺静脉内皮细胞通透性增加。说明Aqp3参与了脓毒症肺血管通透性的调节。

Aqps是一组调控水迅速进出细胞的膜转运蛋白,主要介导自由水被动跨生物膜转运,对保持细胞内外水平衡起重要作用[4]。Aqps参与了细胞的迁移、分化等功能的调节,对脑缺血缺氧再灌注损伤[5],肿瘤的发生、侵袭[6-7],视网膜及神经脱髓鞘性疾病[8]等多种疾病有影响[9-12]。以往研究发现Aqp1、Aqp4、Aqp5等在多种因素引起的脑和肺等器官通透性增加中发挥作用[13-15]。有关Aqp3是否参与疾病后血管通透性调节,目前尚不清楚。本研究证实Aqp3在脓毒症后肺血管通透性中发挥作用,但Aqp3是否参与脓毒症后其他器官通透性的调节以及在其他疾病引起的通透性变化中起作用和其他Aqp亚型是否参与脓毒症血管通透性的调节等均需进一步证实。

氧化应激是脓毒症重要的病理生理过程。SS-31是一种新型抗氧化肽,其抗氧化作用主要针对线粒体,能减少活性氧的产生[16-17]。本实验结果发现在整体水平和离体水平应用SS-31能显著降低脓毒症肺血管的通透性,同时降低Aqp3的表达。本研究发现SS-31可改善脓毒症肺血管通透性,未来可作为一种治疗脓毒症的有效药物,其具体机制有待进一步阐明。SS-31能下调Aqp3的表达,但SS-31是否通过下调Aqp3来降低肺血管通透性,我们下一步将继续研究。

参考文献
[1] 郑丹阳, 吴惠玲, 陈晓明, 等. 血管内皮细胞微粒在脓毒症大鼠血管渗漏中的作用[J]. 第三军医大学学报,2016, 38 (8) : 787 –793. DOI:10.16016/j.1000-5404.201510053
[2] Zhang J, Yang G M, Zhu Y, et al. Role of connexin 43 in vascular hyperpermeability and relationship to Rock1-MLC20 pathway in septic rats[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2015, 309 (11) : L1323 –L1332. DOI:10.1152/ajplung.00016.2015
[3] 明佳, 袁侨英, 周艳, 等. 体外LPS诱导血管内皮细胞通透性改变及其与连接蛋白43的关系[J]. 第三军医大学学报,2010, 32 (24) : 2582 –2585. DOI:10.16016/j.1000-5404.2010.24.006
[4] Zelenina M, Zelenin S, Aperia A. Water channels (aquaporins) and their role for postnatal adaptation[J]. Pediatr Res,2005, 57 (5 Pt 2) : 47R –53R. DOI:10.1203/01.PDR.0000159572.79074.0B
[5] Wang H, Wang X, Guo Q. The correlation between DTI parameters and levels of AQP-4 in the early phases of cerebral edema after hypoxic-ischemic/reperfusion injury in piglets[J]. Pediatr Radiol,2012, 42 (8) : 992 –999. DOI:10.1007/s00247-012-2373-7
[6] Warth A, Muley T, Meister M, et al. Loss of aquaporin-4 expression and putative function in non-small cell lung cancer[J]. BMC Cancer,2011, 11 : 161 . DOI:10.1186/1471-2407-11-161
[7] Wang D, Owler B K. Expression of AQP1 and AQP4 in paediatric brain tumours[J]. J Clin Neurosci,2011, 18 (1) : 122 –127. DOI:10.1016/j.jocn.2010.07.115
[8] Wang F, Liu Y, Duan Y, et al. Brain MRI abnormalities in neuromyelitisoptica[J]. Eur J Radiol,2011, 80 (2) : 445 –449. DOI:10.1016/j.ejrad.2010.06.024
[9] 朱建国, 吴玫, 赵丹, 等. 水通道蛋白1和3在小鼠前列腺组织的表达及意义[J]. 中华男科学杂志,2011, 17 (6) : 483 –487.
[10] Xiao L, Ng T B, Feng Y B, et al. Dendrobiumcandidum extract increases the expression of aquaporin-5 in labial glands from patients with Sjogren's syndrome[J]. Phytomedicine,2011, 18 (2/3) : 194 –198. DOI:10.1016/j.phymed.2010.05.002
[11] Wu X, Ren C, Zhou H, et al. Therapeutic effect of Zeng Ye decoction on primary Sjogren's syndrome via upregulation of aquaporin1 and aquaporin5 expression levels[J]. Mol Med Rep,2014, 10 (1) : 429 –434. DOI:10.3892/mmr.2014.2208
[12] Wang Y, Bu J, Zhang Q, et al. Expression pattern of aquaporins in patients with primary nephrotic syndrome with edema[J]. Mol Med Rep,2015, 12 (4) : 5625 –5632. DOI:10.3892/mmr.2015.4209
[13] King L S, Nielsen S, Agre P, et al. Decreased pulmonary vascular permeability in aquaporin-1-null humans[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2002, 99 (2) : 1059 –1063. DOI:10.1073/pnas.022626499
[14] Yang L, Wang X, Zhen S, et al. Aquaporin-4 upregulated expression in glioma tissue is a reaction to glioma-associated edema induced by vascular endothelial growth factor[J]. Oncol Rep,2012, 28 (5) : 1633 –1638. DOI:10.1073/pnas.022626499
[15] Zhang Z Q, Song Y L, Chen Z H, et al. Deletion of aquaporin 5 aggravates acute lung injury induced by Pseudomonas aeruginosa[J]. J Trauma,2011, 71 (5) : 1305 –1311. DOI:10.1097/TA.0b013e3182128528
[16] Manczak M, Mao P, Calkins M J, et al. Mitochondria-targeted antioxidants protect against amyloid-beta toxicity in Alzheimer's disease neurons[J]. J Alzheimers Dis,2010, 20 (Suppl 2) : S609 –S631. DOI:10.3233/JAD-2010-100564
[17] Yo K, Yu Y M, Zhao G, et al. Brown adipose tissue and its modulation by a mitochondria-targeted peptide in rat burn injury-induced hypermetabolism[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab,2013, 304 (4) : E331 –E341. DOI:10.1152/ajpendo.00098.2012
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201608098
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由第三军医大学主管、主办

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王平, 吴惠玲, 朱娱, 李涛, 刘良明.
Wang Ping, Wu Huiling, Zhu Yu, Li Tao, Liu Liangming.
水通道蛋白亚型3在脓毒症肺血管通透性中的作用及SS-31对其的影响
Role of aquaporin 3 in pulmonary vascular leakage after sepsis and effect of SS-31 in the process in vitro and in vivo
第三军医大学学报, 2017, 39(2): 111-115
J Third Mil Med Univ, 2017, 39(2): 111-115
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201608098

文章历史

收稿: 2016-08-19
修回: 2016-09-24

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