脓毒症是由感染引起的全身炎症反应综合征,可导致组织和器官发生严重损伤,死亡率很高。研究证实脓毒症后血管通透性显著增加[1],是导致脓毒症器官功能损伤的重要因素之一。水通道蛋白(aquaporins,Aqps)是一组与水通透性有关的膜转运蛋白。迄今在大鼠体内发现有12种Aqps。多种Aqps的表达及功能异常在疾病的发生、发展过程中有重要作用。Aqp3在血管组织中有大量表达,前期研究显示脓毒症后肺血管Aqp3表达明显升高,其是否参与脓毒症肺血管通透性的调节尚不清楚。氧化应激是脓毒症重要的病理生理过程,Szeto-Schiller-31 (SS-31,H-D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2)是一种新型的抗氧化肽,对多种疾病具有保护作用。SS-31能否通过Aqp3改善脓毒症肺血管通透性未见相关研究。因此,本研究从整体动物和离体细胞水平探讨Aqp3在脓毒症肺血管通透性中的作用及SS-31对其的影响,为临床脓毒症血管通透性的治疗提供全新的思路。
1 材料与方法 1.1 实验动物及主要试剂成年SPF级SD大鼠,12周龄,雌雄各半,体质量180~220 g,由第三军医大学野战外科研究所实验动物中心提供,实验动物生产许可证号:SCXK(渝)2012-0005,实验动物使用许可证号:SYXK(渝)2012-0010。内皮细胞培养基DMEM-F12购自HyClone公司;胎牛血清(FBS)购自Science-cell公司;FITC标记牛血清白蛋白(FITC-BSA)购自Sigma-Aldrich公司;Aqp3多克隆兔抗大鼠抗体购自Abcam公司;β-actin山羊抗大鼠抗体购自美国Life technologies公司;SS-31购自杭州中肽生化有限公司;Transwell 6孔板购自美国Costar公司。
1.2 方法 1.2.1 脓毒症模型制备参考本实验室已建立的盲肠结扎穿孔术(cecal ligation and puncture,CLP)复制脓毒症模型。SD大鼠以30 mg/kg戊苯巴比妥钠进行腹腔麻醉。开腹,暴露盲肠,排除盲端气泡,距盲端3 cm处结扎,用棱形针穿孔,穿孔大小约为0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm,使粪便自由流入腹腔,引起感染。假手术组仅进行开腹及关腹,不进行处理盲肠。模型成功率85%以上[2]。
1.2.2 肺静脉原代内皮细胞准备3%戊巴比妥钠麻醉、固定大鼠后,暴露肺脏,取肺左右侧肺静脉,切成小块,均匀铺于培养瓶中,3 d后去组织培养细胞,细胞用Ⅷ和CD31鉴定,阳性率90%以上。培养至3~5代用于实验。
1.2.3 脓毒症肺血管通透性和Aqp3表达的变化SD大鼠48只,分为3组(每组16只):假手术组、脓毒症6 h组、脓毒症12 h组。其中24只大鼠(每组8只)用于检测肺血管通透性,24只大鼠(每组8只)用于提取肺静脉组织蛋白检测Aqp3的蛋白变化。采用CLP复制脓毒症模型,在CLP后6、12 h麻醉固定大鼠,经颈静脉注射荧光白蛋白(9 mg/kg),0.5 h后冲洗肺部,取左肺上叶,称量,记录肺干质量,剪碎,匀浆后离心取上清液,使用500 nm波长检测荧光强度。以上清液荧光强度/肺干质量代表肺血管通透性。同时取相应各时相点大鼠肺静脉,采用Western blot检测Aqp3的蛋白表达,分析Aqp3表达与肺血管通透性之间的关系。
1.2.4 脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对肺静脉内皮细胞通透性和Aqp3表达的影响及Aqp3干扰后内皮细胞通透性的变化实验分3组:取肺静脉原代内皮细胞,用1 μg/mL浓度的LPS刺激细胞6、12 h为LPS刺激6、12 h组,以未经LPS刺激的正常细胞作为空白对照组。取1×105/孔细胞接种于Transwell,培养48 h后,上腔加入10 μL 2 mg/mL FITC-BSA,4 h后从下室取200 μL培养基至96孔板测荧光量,将下腔实际透过的荧光量占10 μL荧光白蛋白总荧光量比率作为 FITC-BSA透过率,以反映肺静脉内皮细胞的通透性[3]。同时提取LPS刺激内皮细胞后的相应时相点细胞总蛋白,用Western blot检测Aqp3蛋白表达。为进一步验证Aqp3对肺静脉内皮细胞通透性的影响,在RNA水平上用PCR检测3个RNAi片段(RNAi 1~3)处理Aqp3,选择有效的RNAi片段(LipofectamineTM2000转染 siRNA,50 nmol/L),24 h后观察其对通透性的影响。
1.2.5 SS-31对脓毒症肺血管通透性和Aqp3的影响复制脓毒症模型时,经尾静脉注射0.5、1、3 mg/kg SS-31,观察CLP 12 h后大鼠肺血管通透性和Aqp3表达的变化。离体细胞水平以0.1 μg/mL SS-31预处理后,观察LPS刺激后Aqp3和内皮细胞通透性变化。
1.3 统计学分析采用SPSS 13.0统计软件,数据以x±s表示,多组比较采用方差分析,两组均数比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 脓毒症肺血管通透性和Aqp3表达的变化与假手术组相比,CLP后不同时相点的肺血管通透性均有明显升高(P<0.05),脓毒症6、12 h组的肺血管通透性分别增加28.61%、78.14%(图 1A)。同时,Western blot检测结果显示脓毒症6、12 h大鼠肺血管中Aqp3表达水平明显升高(P<0.05,图 1B、C)。表明Aqp3表达和肺血管通透性有关。
2.2 LPS刺激肺静脉内皮细胞后通透性和Aqp3的变化以及Aqp3干扰后内皮细胞通透性影响
与空白对照组相比,LPS刺激6、12 h组肺静脉内皮细胞的通透性均有升高(P<0.05,图 2A)。同时LPS刺激肺静脉内皮细胞后Aqp3蛋白水平也明显升高(P<0.05,图 2B、C)。为进一步验证Aqp3对通透性的作用,采用RNAi处理Aqp3,干扰片段1、2效果明显(图 2D、E)。选用片段2干扰Aqp3可明显拮抗由LPS刺激引起的单层内皮细胞FITC-BSA透过率的增加(P<0.05,图 2F)。
2.3 SS-31对脓毒症肺血管通透性和Aqp3的影响
脓毒症模型经尾静脉注射SS-31 0.5、1、3 mg/kg后,脓毒症肺血管的通透性降低。与脓毒症组相比,各组分别降低14.08%(0.5 mg/kg)、19.01%(1 mg/kg)、41.25%(3 mg/kg),见图 3A。同时发现给药后大鼠肺静脉Aqp3的蛋白表达较脓毒症大鼠明显下降(P<0.05,图 3B、C)。
2.4 SS-31对LPS刺激的肺静脉内皮细胞通透性和Aqp3的影响
在LPS刺激肺静脉内皮细胞的同时予以SS-31处理后,肺静脉内皮细胞的通透性降低(图 4A);与LPS刺激的肺静脉内皮细胞相比,SS-31处理的肺静脉内皮细胞Aqp3蛋白表达明显降低(P<0.05,图 4B、C)。
3 讨论
本研究通过在整体动物水平和离体细胞水平观察脓毒症和LPS刺激不同时相点肺血管通透性和Aqp3的表达变化,发现随着脓毒症肺血管通透性的增加,Aqp3的表达明显增强。进一步研究发现,在离体细胞水平干扰Aqp3后,可明显拮抗LPS刺激的肺静脉内皮细胞通透性增加。说明Aqp3参与了脓毒症肺血管通透性的调节。
Aqps是一组调控水迅速进出细胞的膜转运蛋白,主要介导自由水被动跨生物膜转运,对保持细胞内外水平衡起重要作用[4]。Aqps参与了细胞的迁移、分化等功能的调节,对脑缺血缺氧再灌注损伤[5],肿瘤的发生、侵袭[6-7],视网膜及神经脱髓鞘性疾病[8]等多种疾病有影响[9-12]。以往研究发现Aqp1、Aqp4、Aqp5等在多种因素引起的脑和肺等器官通透性增加中发挥作用[13-15]。有关Aqp3是否参与疾病后血管通透性调节,目前尚不清楚。本研究证实Aqp3在脓毒症后肺血管通透性中发挥作用,但Aqp3是否参与脓毒症后其他器官通透性的调节以及在其他疾病引起的通透性变化中起作用和其他Aqp亚型是否参与脓毒症血管通透性的调节等均需进一步证实。
氧化应激是脓毒症重要的病理生理过程。SS-31是一种新型抗氧化肽,其抗氧化作用主要针对线粒体,能减少活性氧的产生[16-17]。本实验结果发现在整体水平和离体水平应用SS-31能显著降低脓毒症肺血管的通透性,同时降低Aqp3的表达。本研究发现SS-31可改善脓毒症肺血管通透性,未来可作为一种治疗脓毒症的有效药物,其具体机制有待进一步阐明。SS-31能下调Aqp3的表达,但SS-31是否通过下调Aqp3来降低肺血管通透性,我们下一步将继续研究。
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