乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。据统计，2015年美国乳腺癌的发病率居于女性恶性肿瘤首位，在肿瘤相关疾病的死亡率中占第2位，严重威胁女性的生命健康[1]。我国乳腺癌发病率所占比例为15%，是女性发病率最高的恶性肿瘤，且其发病率及死亡率有明显上升趋势[2]。近年来，虽然以外科手术、放疗、化疗、内分泌治疗、靶向治疗为主的综合治疗在乳腺癌治疗中取得了重要进展，但患者的预后并未得到显著改善，乳腺癌发生、发展的分子机制有待深入探讨。
微小RNAs(microRNAs，miRNAs)是含有19~22个核苷酸、进化上保守的非编码RNA，不仅在调控生物体正常发育中具有重要作用，而且也参与调控多种恶性肿瘤的病理过程[3]。miRNAs在乳腺癌发生、发展中的作用已有研究报道[4]。我们前期的研究从乳腺癌细胞株中分离得到乳腺癌干细胞，采用基因芯片技术获得其miRNAs表达谱，经实时定量PCR验证，该芯片的准确率达到80%[5]。在此基础上，本研究从宏观的角度，利用调控网络分析在基因芯片大数据研究中的独特优势，筛选调控乳腺癌的关键miRNAs，并验证其在乳腺癌侵袭及迁移中的作用。
1 材料与方法 1.1 细胞、主要试剂及仪器人乳腺癌细胞系MCF-7、T47D及正常乳腺上皮细胞MCF-10A购自第三军医大学中心实验室。Gibco胎牛血清、Gibco DMEM-H培养基、RPMI1640培养基购自重庆衍庆生物技术有限公司，青霉素和链霉素购自上海碧云天生物技术公司，胰酶购自HyClone公司，miRNA negative control、miRNA agomir、miRNA antagomir购自广州市锐博生物技术有限公司，逆转录试剂盒及qRT-PCR试剂盒购自宝生物工程有限公司，Transwell小室(8 μm孔径聚碳酸酯膜)和Matrigel购自美国Corning Costar公司，梯度PCR仪及荧光定量PCR仪购自美国Applied公司，倒置相差显微镜购自德国Leica公司。
1.2 相关特异miRNAs的靶基因预测利用miRNAs靶基因预测的在线网络TargetScan(http://www.targetscan.org/)和miRanda(http://www.microrna.org/microrna/home.do)等工具对乳腺癌干细胞miRNAs进行靶基因预测，得到显著差异miRNAs调控的潜在靶基因。
1.3 miRNAs-gene-network和miRNAs-GO-network以人乳腺癌和乳腺癌干细胞样细胞的miRNAs芯片为研究对象[5]，对筛选出的靶基因进行显著靶向性功能(gene ontology，GO)分析，得到具有显著性、低误判率、靶向性的GO功能富集以及对应的靶基因，构建差异miRNAs与靶基因的作用网络miRNAs-gene-network以及差异miRNAs与靶基因显著性功能之间的作用网络miRNAs-GO-network。利用图论的方法对miRNAs在两个网络中的调控地位进行评价，评价标准以miRNAs在网络中的维度(Degree)来衡量，用维度表示网络中的miRNAs调控靶基因的数目和功能多少，维度越大代表miRNAs调控的靶基因数目越多、功能越强。
1.4 MCF-7及T47D细胞培养及基因转染采用含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM-H或RPMI1640培养基，于37 ℃、5% CO2孵箱中分别培养MCF-7和T47D细胞，倒置相差显微镜观察细胞形态，贴壁达到70%～80%，胰酶消化后，进行传代。实验分3组：Negative control组、miR-106a-5p agomir组、miR-106a-5p antagomir组。取对数生长期的细胞，5 mL PBS清洗3次，1 mL胰酶消化后加入含10% 胎牛血清的完全培养基4 mL重悬、计数，24孔板每孔接种1×105个细胞，37 ℃、5% CO2 孵箱中培养，过夜。去除培养基，PBS清洗3次后每孔加入DMEM或RPMI1640 完全培养基500 μL，再分别加入1 μL Negative control、miR-106a-5p agomir、miR-106a-5p antagomir，轻轻晃动24孔板混匀，37 ℃、5% CO2孵箱中培养24～48 h。
1.5 实时荧光定量PCR 检测miR-106a-5p表达水平检测过表达或敲低miR-106a-5p后MCF-7和T47D细胞中miR-106a-5p的表达水平，将细胞接种在6孔板，分为3组：Negative control组、miR-106a-5p agomir组、miR-106a-5p antagomir组，转染48 h采用TRIzol法提取总RNA，miR-106a-5p特异引物进行反转录，获得相应cDNA，以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR检测，以U6 RNA为内参对照校正PCR模板的拷贝数，其相对表达量用2-ΔΔCt值计算。引物序列如下，hsa-miR-106a-5p反转录引物: 5′-TCGTATCCAGTGCAGG-GTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACctacc-3′；hsa-miR-106a-5p上游引物: 5′-AAAAGTGCTTACAGTGC-AGGTAG-3′；下游引物: 5′-GGAAAAGTGCTTACAGTGCAGGT-3′。
1.6 过表达及敲低miR-106a-5p对MCF-7和T47D细胞侵袭能力的影响4 ℃ 复温基质胶和高压消毒后的PBS溶液，当基质胶呈液态时，基质胶和PBS按1：8比例配置成混合液，每个小室上室缓慢均匀加入80 μL混合液，避免有气泡产生，37 ℃孵育过夜；选对数生长的细胞，胰酶消化，计数。下室加入800 μL 含15% FBS的完全培养基，按照分组上室分别加入200 μL用无血清DMEM-H或RPMI1640培养基重悬的细胞，细胞数为2×105个。37 ℃、5% CO2孵箱中培养48 h；1 mL 95% 乙醇溶液固定10 min，PBS清洗3次，1% 结晶紫染色10 min，小水流清洗、棉签轻轻擦除上室结晶紫和基质胶，倒置显微镜细胞观察、计数。
1.7 过表达及敲低miR-106a-5p对MCF-7和T47D细胞迁移能力的影响选对数生长的细胞，胰酶消化，计数。将小室放入24孔板中，下室加入800 μL含15% 胎牛血清的DMEM-H或RPMI1640完全培养基，按照分组上室分别加入200 μL无血清DMEM-H或者RPMI1640培养基重悬的细胞，细胞数为4×104个。37 ℃、5% CO2孵箱中培养24 h；清除培养基后，以1 mL 95% 乙醇溶液固定10 min。PBS清洗3次，1% 结晶紫染溶液色10 min。小水流清洗上室结晶紫，棉签轻轻擦净。倒置显微镜观察，拍照，细胞计数。
1.8 细胞划痕实验先用标记笔在6孔板背面垂直划3～4条直线，按照分组进行细胞种板，采用无双抗10%胎牛血清的DMEM-H或RPMI1640培养基培养MCF-7或T47D细胞株；待细胞融合度达到60%～70%时，加入丝裂霉素干预处理2 h(终浓度10 ng/mL，减少细胞侵袭对迁移的影响)，PBS清洗3次，垂直背后标记横线用 100 μL移液枪头轻轻作划痕。PBS清洗除去脱落细胞，倒置显微镜下拍照，并记录拍照位置；24 h后重复在记录位置拍照。0 h和24 h分别在划痕的上中下3个位置，用Image J工具测量划痕间距，得到3次的均值L0和L24，并计算L=L0-L24，得到细胞平均迁移距离。
1.9 统计学分析数据以x±s表示，采用SPSS 17.0统计软件进行独立样本t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 miRNAs-gene-network的建立对乳腺癌和乳腺癌干细胞进行miRNAs靶基因预测、乳腺组织特异性筛选和显著靶向性功能分析，建立miRNAs与调节基因的网络miRNAs-gene-network，见图 1。miRNAs调控的Gene越多，其面积就越大；同理，Gene受到miRNAs的调控越多，其面积也越大。以调控靶分子的数目(Degree)来衡量miRNAs在网络中的调控地位，Degree值较高的miRNAs见表 1。
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| 矩形为下调miRNAs；圆形为gene；直线表示miRNAs与gene的调控关系 图 1 miRNAs-gene-network |
| miRNAs | Degree |
| miR-106a-5p | 48 |
| miR-20b-5p | 48 |
| let-7b-5p | 42 |
| let-7e-5p | 39 |
| miR-29b-3p | 39 |
| miR-98-5p | 39 |
2.2 miRNAs-GO-network的建立
对乳腺癌和乳腺癌干细胞样细胞进行miRNAs和显著靶向性功能分析，建立miRNAs与基因功能的调控网络miRNAs-GO-network，见图 2。miRNAs调控的GO越多，其面积就越大；同理，GO受到miRNAs的调控越多，其面积也越大。以调控靶分子功能的数目(Degree)来衡量miRNAs在网络中的调控地位，Degree值较高的miRNAs见表 2。
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| 矩形为miRNAs；圆形为GO；直线表示miRNAs与GO的调控关系 图 2 miRNAs-GO-network |
| miRNAs | Degree |
| miR-106a-5p | 36 |
| miR-20b-5p | 36 |
| let-7b-5p | 33 |
| let-7e-5p | 33 |
| miR-29b-3p | 33 |
| miR-98-5p | 33 |
2.3 关键miRNA的筛选
在两个网络中调控维度最高的miRNAs基本一致，miR-106a-5p是调控维度最高的miRNAs之一，可能是调控乳腺癌恶性表型的关键miRNAs之一。
2.4 实时荧光定量PCR检测miR-106a-5p的表达结果表明miR-106a-5p在乳腺癌细胞中的表达下调8.866倍(t=3.827，P=0.019,图 3A)；过表达或敲低miR-106a-5p后实时荧光定量PCR检测miR-106a-5p在乳腺癌MCF-7及T47D细胞中的表达水平，结果显示，在MCF-7和T47D细胞中miR-106a-5p agomir 可明显使miR-106a-5p过表达，分别上调3.480倍和11.811倍(t=-7.872，P=0.001；t=-4.772，P=0.009，图 3B、C)；而miR-106a-5p antagomir可明显抑制miR-106a-5p的表达，分别下调2.841倍和1.949倍(t=6.732，P=0.003；t=3.259，P=0.031，图 3B、C)。
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| A：人正常乳腺上皮细胞MCF-10A和乳腺癌细胞MCF-7中miR-106a-5p的相对表达量 a：P＜0.05，与MCF-10A比较；B、C： 分别为乳腺癌MCF-7、T47D细胞中miR-106a-5p的相对表达量 1:Negative control组; 2: miR-106a-5p agomir组; 3: miR-106a-5p antagomir组；a：P＜0.05，b：P＜0.01，与Negative control组比较 图 3 实时荧光定量PCR检测miR-106a-5p的相对表达量 |
2.5 转染miR-106a-5p对MCF-7和T47D细胞侵袭能力的影响
处理48 h后，MCF-7细胞的穿膜细胞数：Negative control组(72.67±4.73)、miR-106a-5p agomir组(57.00±3.61)、miR-106a-5p antagomir组(179.67±3.06)；T47D细胞的穿膜细胞数：Negative control组(67.33±2.52)、miR-106a-5p agomir组(52.67±5.13)、miR-106a-5p antagomir组(164.33±4.04)。结果显示，过表达miR-106a-5p可抑制MCF-7 (t=4.565，P=0.010)和T47D (t=4.445，P=0.011)细胞的侵袭能力；抑制miR-106a-5p的表达可以促进MCF-7 (t=-32.934，P＜0.001)和T47D (t=-35.289，P＜0.001)细胞的侵袭能力(图 4)。
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| 图 4 结晶紫染色观察miR-106a-5p对MCF-7和T47D细胞侵袭能力的影响 |
2.6 转染miR-106a-5p对MCF-7和T47D细胞迁移能力的影响
处理24 h后，MCF-7细胞的穿膜细胞数：Negative control组(83.33±2.08)、miR-106a-5p agomir组(65.67±2.08)、miR-106a-5p antagomir组(166.67±2.52)；T47细胞的穿膜细胞数：Negative control组(20.33±3.51)、miR-106a-5p agomir组(13.33±2.08)、miR-106a-5p antagomir 组(2.67±2.08)。结果显示，过表达miR-106a-5p可抑制MCF-7 (t=10.394，P＜0.001)和T47D (t=2.970，P=0.041)细胞的迁移能力，抑制miR-106a-5p的表达可以促进MCF-7 (t=-44.194，P＜0.001)和T47D (t=-5.223，P=0.006)细胞的迁移能力(图 5)。
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| 图 5 结晶紫染色观察miR-106a-5p对MCF-7和T47D细胞迁移能力的影响 |
2.7 转染miR-106a-5p对MCF-7和T47D细胞划痕实验的影响
细胞划痕实验中，MCF-7细胞平均迁移距离：Negative control组(161.33±6.51)μm、miR-106a-5p agomir组(142.67±4.51) μm、miR-106a-5p antagomir组(288.67±8.08) μm；T47D细胞平均迁移距离：Negative control组(106.33±4.73) μm、miR-106a-5p agomir 组(55.67±4.04) μm、miR-106a-5p antagomir组(254.67±5.01) μm。结果显示，过表达miR-106a-5p可抑制MCF-7 (t=4.084，P=0.015)和T47D (t=14.113，P＜0.001)细胞的爬行能力，抑制miR-106a-5p的表达则显著增加MCF-7 (t=-21.255，P＜0.001)和T47D (t=-35.402，P＜0.001)细胞的爬行能力(图 6)。
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| A：MCF-7细胞；B：T47D细胞 图 6 miR-106a-5p对MCF-7和T47D细胞爬行能力的影响 |
3 讨论
miRNAs是由发夹状miRNAs前体经过RNaseⅢ酶家族中的Drosha酶和Dicer酶剪切加工而来。它通过与特定地靶基因mRNA的3′-UTR非翻译区不完全互补配对，在转录或转录后水平下调靶基因的表达，参与疾病的发生、发展[6]。miRNAs的生物学功能包括区分癌症的表型、药物治疗靶点或者作为药物本身[7]。最新研究表明，在酸性的肿瘤微环境中，通过核酸肽运输抗miRNAs药物(反义寡肽)，可实现miRNAs 相关的抗肿瘤治疗[8]。Li等[9]报道血浆miRNAs可用于肝癌的早期诊断。可见，miRNAs在癌症的发生、发展、诊断、维持治疗、预后等方面具有重要的作用。与传统的单个miRNA研究相比，通过miRNAs与靶基因及GO分析建立的网络，系统筛选肿瘤相关关键miRNAs，可以提高miRNAs调控肿瘤恶性表型研究的准确性及可靠性[10]。本研究通过构建乳腺癌相关的miRNAs-gene-network和miRNAs-GO-network调控网络，筛选出miR-106a-5p、miR-20b-5p、let-7b-5p、let-7e-5p、miR-29b-3p、miR-98-5p等6个调控乳腺癌的关键miRNAs，其中miR-106a-5p是乳腺癌调控维度最高的miRNAs之一。它定位于人X染色体(Xq26.2)上，属于miR-106a-363基因簇，该基因簇在肿瘤的发生、发展中具有重要作用[11]。研究发现miR-106a在乳腺癌中具有重要地位[12]。然而，近年来关于miR-106a在乳腺癌中的作用报道不尽相同[13-14]。miR-106a有作为促癌miRNAs的相关报道：通过抑制ZBTB4/Sp/EZH2信号轴促进乳腺癌的发生、发展，而这种促癌作用可被Betulinic acid(白桦脂酸)抑制[15]。相反，Guo等[14]发现miR-106a在雌激素受体阴性的乳腺癌患者中表达下降，具有抑癌的作用，抑制miR-106a的表达可上调毛细血管扩张性共济失调症突变基因(ATM)的表达，而ATM的高表达与ER阴性的患者术后或放疗后复发正相关。因此，miR-106a在乳腺癌中的确切调控作用仍然不清楚，本研究拟探讨其对乳腺癌细胞侵袭及迁移功能的作用。
本研究比较乳腺癌细胞MCF-7与乳腺正常上皮细胞MCF-10A中miR-106a-5p的表达水平，发现miR-106a-5p在MCF-7中表达较低，提示miR-106a-5p可能具有抑癌作用；通过Transwell侵袭实验、Transwell迁移实验以及划痕实验验证，miR-106a-5p确实显著抑制了乳腺癌细胞的侵袭和迁移能力，起着抑癌基因的作用。研究报道在胶质瘤及胃癌中miR-106a可通过分别抑制靶基因E2F1和TIMP2而抑制肿瘤的增殖、侵袭、迁移[16-17]，与本研究miR-106a-5p可抑制侵袭、迁移的生物学作用的结论相似。但是，本研究仅对miR-106a-5p的生物学功能进行了探讨，其调控机制尚不清，其调控的靶基因不明，对乳腺癌干细胞的调控作用也未阐明，有待进一步探讨。
此外，本研究还筛查到多个调控维度较高的miRNAs，如miR-20b-5p、let-7b-5p等。既往研究显示，这些miRNAs可能与乳腺癌发生、发展有关，如Xu等[18]发现let-7b与乳腺癌干细胞的干性维持密切相关。因此，我们将逐个探讨这些miRNAs对乳腺癌的调控作用及其确切机制。miRNAs-GO-network初筛表明miR-106a-5p在乳腺癌的多种生物学功能中均有调控作用，而本研究仅选取了侵袭、迁移两个方面进行研究，拟在今后的研究中继续探讨其对乳腺癌的增殖、分化、干性调控等方面的作用。
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