2. 730030 兰州, 甘肃省人民医院西院消化科 ;
3. 730030 兰州, 甘肃省消化系肿瘤重点实验室
2. Department of Gastroenterology, West Branch of Gansu Provincial People's Hospital, Lanzhou, Gansu Province, 730030, China ;
3. Key Laboratory of Digestive Tumors of Gansu Province, Lanzhou, Gansu Province, 730030, China
炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一种病因未明的累积胃肠道的慢性非特异性炎症疾病,主要包括了克罗恩病(Crohns disease,CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)，在我国发病率逐年提升。由于其发病机制仍不清楚 ，可能与免疫、遗传、感染及精神因素有关 [1]，目前尚缺少有效地治疗药物。因此，临床仍致力于开发安全高效的新药物。
中药或天然产物因安全性高、副作用小，一直是当前IBD研究的热点。二氢杨梅素(dihydromyricelin，DHM)又称蛇葡萄素，是一种二氢黄酮醇类黄酮化合物。其广泛存在于蛇葡萄科蛇葡萄属植物中，在藤茶中的量可以达到30%[2]。近年来，药理实验研究证实二氢杨梅素具有抗自由基、抗氧化、抗肿瘤、广谱抗菌、解酒保肝及降低血糖 、血脂等多方面的药理作用。新近的研究显示二氢杨梅素还可以抑制核因子κB(nuclear factor κβ,NF-κB)的活性。
本实验以4%葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate salt,DSS)诱导小鼠急性溃疡性结肠炎模型，通过给予不同剂量的DHM灌胃治疗，并与治疗溃疡性结肠炎传统药物5-氨基水杨酸(5-aminosalicylic acid,5-ASA)做对照，观察结肠炎小鼠的一般情况、结肠长度、病理损伤程度，肠组织中Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)2、TLR4、NF-κB的表达，炎性因子如IL-1β、TNF-α、IL-6水平，以及肠组织中髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、一氧化氮(nitric oxide,NO)及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的变化，探讨DHM对小鼠溃疡性结肠炎的作用及可能机制。
1 材料与方法 1.1 动物SPF级BALB/c雌鼠60只，体质量17~22 g，8周龄，购于中国农业科学院兰州兽医研究所。
1.2 药物二氢杨梅素(批号：MUST-15010908)，由成都曼斯特生物科技有限公司提供；葡聚糖硫酸钠(DSS)由Sigma公司提供；5-氨基水杨酸 (美沙拉嗪肠溶片)由葵花药业集团佳木斯鹿灵制药有限公司生产。
1.3 主要试剂Anti-TLR2、Anti-TLR4由艾博抗(上海)贸易有限公司提供；IL-1β、TNF-α、IL-6检测ELISA试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。 MPO、NO、SOD检测ELISA试剂盒由南京建成科技有限公司提供；NF-κB 非放射性EMSA检测试剂盒由微奥基因科技常州有限公司提供。
1.4 UC模型的建立与处理小鼠采用随机数字表法分为6组：正常组，模型组，DHM低剂量组[50 mg/(kg·d)]、中剂量组[100 mg/(kg·d)]、高剂量组[200 mg/(kg·d)]及5-氨基水杨酸组[50 mg/(kg·d)]，每组10只小鼠。分组当日给予正常组小鼠蒸馏水自行饮用，其余组小鼠给予4%DSS水溶液自行饮用(记为第1天)，连续饮用7 d。于饮用4%DSS水溶液当日开始，对DHM低、中、高剂量组及5-氨基水杨酸组按各组拟定剂量分别进行灌胃治疗，连续给药14 d后采用颈椎脱位法处死小鼠，游离结肠及远端回肠，取出肛门至盲肠末端的整个结肠和直肠段，对其进行肉眼观察，并测量长度。摘取小鼠脾脏称量。以PBS溶液将小鼠结肠内容物及管壁冲洗干净，于病变部位取材，置于4%多聚甲醛溶液中固定，留待进行常规石蜡包埋切片，HE染色。剩余肠段封存于EP管中，迅速转移到-80 ℃冰箱中冷冻保存，留待下一步提取肠组织蛋白。
1.5 疾病活动指数每日对各组小鼠进行体质量测量，观察小鼠的活动、毛色、精神状态以及大便性状、颜色等。参照文献[4]，结合小鼠体质量下降百分率(体质量不变为0，1~5 为1分，6~10为2分，11~15为3分，大于15为4分)、大便黏稠度(正常为0，松散的大便为2分，腹泻为4分)和便血(正常0分，隐血阳性为2分，显性出血为4分)3种情况进行疾病活动指数(disease activity index,DAI)评分，即DAI=(体质量指数+大便形状+出血情况)/3。
1.6 光镜下病理组织学观察小鼠结肠组织病理切片观察用常规HE染色法。光镜下观察结肠组织损伤情况，结肠病灶病理组织显微镜检查并评分(CMDI)，评分标准如下，①溃疡，0-无，1-小溃疡(＜3 mm)，2-大溃疡(>3 mm)； ②炎症0-无，1-轻度，2-重度； ③肉芽组织：0-无，1-有； ④病变深度：0-无，1-黏膜下层，2-肌层，3-浆膜层； ⑤纤维化：0-无，1-轻度，2-重度，各项相加即为总分。
1.7 脾脏指数根据公式计算：脾脏指数(mg/g)=脾脏质量/小鼠体质量。
1.8 ELISA检测用ELISA测定DHM治疗前后肠组织细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6含量以及治疗前后肠组织MPO、NO、SOD的活性变化，分别按照相应的ELISA试剂盒说明书进行测定。
1.9 EMSA检测用非放射性EMSA测定通用试剂盒检测治疗前后肠组织NF-κB的活性。
1.10 Western blot检测采用Western blot检测DHM治疗前后肠组织TLR2、TLR4含量的表达。
1.11 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件。正态分布计量资料数据以x±s表示，两组间均数比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 小鼠DAI结果统计结果显示，除正常组外，其余各组小鼠从饮用4%DSS 3 d后，开始出现烦躁不安、精神倦怠、腹泻、血便、毛色黯淡无光泽、消瘦等情况。经过治疗后，各剂量治疗组均有不同程度的改善。药物治疗14 d后，DHM中剂量组、高剂量组、5-氨基水杨酸组DAI均显著低于模型组(P＜0.01，图 1)，DHM高剂量组与5-氨 基水杨酸组相比差异无统计学意义(P=0.611)。说明中、高剂量DHM对缓解小鼠疾病活动具有显著的抑制作用，高剂量组与5-氨基水杨酸治疗效果相当。
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| a: P＜0.01,与模型组比较 图 1 治疗14 d后各组小鼠DAI评分比较 |
2.2 病理组织学评分
正常组，光镜下可见正常肠道黏膜。模型组，光镜下可见黏膜固有层大量炎性细胞浸润，多灶性大小不一的溃疡，无黏膜覆盖。DHM低剂量组，光镜下可见黏膜固有层可见炎性细胞浸润，多灶性大小不一溃疡，肉芽填充，可见上皮覆盖。DHM中剂量组，光镜下可见多灶性溃疡，但可见肉芽组织填充，腺体增生修复，部分上皮覆盖。DHM高剂量组，光镜下可见溃疡面积较小，肉芽组织修复，可见上皮覆盖，但炎症较重。5-氨基水杨酸组光镜下可见溃疡面积较小，黏膜修复较为完整(图 2)。
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| A：正常组；B：模型组；C：DHM低剂量组；D：DHM中剂量组；E：DHM高剂量组；F：5-氨基水杨酸组 图 2 光学显微镜观察各组小鼠结肠组织学变化 (HE ×200) |
与正常组相比，其余各组的病理组织学评分均显著升高，差异有统计学意义(P＜0.01)，DHM低、中剂量组与高剂量组相比，差异也有统计学意义(P＜0.01)，高剂量组与5-氨基水杨酸组差异无统计学意义(P＞0.05，图 3)。
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| a: P＜0.05,b: P＜0.01，与模型组比较 图 3 光镜下小鼠结肠病理组织学评分 |
2.3 DHM对小鼠结肠长度的影响
正常组小鼠肠黏膜无充血、水肿，饮用4%DSS 7 d后，模型组小鼠结肠肠壁充血、水肿，严重者自结肠至肛门肠段均可见血性内容物。统计结果显示，各治疗组与模型组相比，均可不同程度的抑制溃疡性结肠炎小鼠结肠缩短(P＜0.05，图 4)。
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| a: P＜0.05，与模型组比较 图 4 各组小鼠治疗14 d后结肠长度比较 |
2.4 小鼠脾脏指数
模型组，DHM低、中、高剂量组，5-氨基水杨酸组小鼠脾脏指数较正常组升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。DHM低剂量组、高剂量组、5-氨基水杨酸组与模型组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)，而DHM中剂量组与模型组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，DHM各剂量组与5-氨基水杨酸组之间差异均无统计学意义(P＞0.05，图 5)。
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| a: P＜0.05，与模型组比较 图 5 各组小鼠治疗14 d后脾脏指数比较 |
2.5 Wsetern blot测定小鼠结肠组织中TLR2、TLR4的表达变化
模型组小鼠结肠组织TLR2、TLR4蛋白表达水平较正常组明显升高，给予DHM灌胃治疗后，各剂量组小鼠肠组织TLR2、TLR4蛋白表达水平均有明显降低，其中DHM高剂量治疗组给药后显著抑制了DSS给药后小鼠结肠组织中TLR2、TLR4的高表达(P＜0.01)，治疗效果与5-氨基水杨酸相当(图 6)。
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| 1: 正常组; 2: 模型组; 3: DHM低剂量组; 4: DHM中剂量组; 5: DHM高剂量组; 6: 5-氨基水杨酸组 图 6 Wsetern blot检测各组小鼠结肠组织中TLR2、TLR4的表达 |
2.6 EMSA测定NF-κB的表达
模型组小鼠结肠组织NF-κB表达水平较正常组明显升高，表明溃疡性结肠炎小鼠结肠黏膜中NF-κB信号通路被激活。给予DHM治疗后，明显抑制了NF-κB的高表达。各治疗组对NF-κB 均具有显著的抑制作用(P＜0.01),而高剂量组与5-氨基水杨酸组相比，差异有统计学意义(P＜0.01，图 7)。
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| 1~8：NF-κB阳性、NF-κB阴性、正常组、模型组、DHM低剂量组、DHM中剂量组、DHM高剂量组、水杨酸对照组 图 7 各组小鼠NF-κB表达情况比较 |
2.7 ELISA法测定细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6的含量
模型组小鼠组织蛋白中IL-1β、TNF-α、IL-6含量显著升高(P＜0.01)。而高剂量组、5-氨基水杨酸组与模型组相比，差异均有统计学意义(P＜0.05，表 1)。
| 组别 | n | IL-1β | TNF-α | IL-6 |
| 正常组 | 6 | 138.55±13.13 | 190.47±22.63 | 387.35±34.61 |
| 模型组 | 6 | 321.13±25.10a | 352.40±24.27a | 699.00±81.42a |
| DHM低剂量组 | 7 | 300.79±28.96 | 291.87±31.85 | 560.80±12.44 |
| DHM中剂量组 | 7 | 190.83±18.14b | 254.21±83.47 | 625.79±27.72 |
| DHM高剂量组 | 7 | 178.41±11.47b | 195.99±7.01b | 536.14±40.72b |
| 5-氨基水杨酸组 | 7 | 169.62±18.04b | 218.04±25.84b | 427.19±18.91b |
| a: P＜0.01,与正常组比较; b: P＜0.05,与模型组比较 | ||||
2.8 ELISA法测定NO、SOD、MPO的活性
模型组小鼠结肠组织中SOD活性明显下降(P＜0.01)，NO、MPO活性明显升高(P＜0.01)。给予药物治疗后，DHM各剂量组及5-氨基水杨酸组小鼠结肠组织中SOD、MPO活性均有不同程度变化，与模型组比较差异均有统计学意义(P＜0.05，表 2)，但DHM低、中剂量组NO活性与模型组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；DHM高剂量组、5-氨基水杨酸与模型组比较，差异有统计学意义(P＜0.05，表 2)。
| 组别 | n | MPO(U/g) | SOD(U/mg) | NO(μmol/g) |
| 正常组 | 6 | 0.45±13.13 | 33.22±2.72 | 0.82±0.06 |
| 模型组 | 6 | 4.87±0.69a | 7.05±0.06a | 4.76±0.14a |
| DHM低剂量组 | 7 | 2.47±0.18b | 18.86±1.84b | 4.64±0.18 |
| DHM中剂量组 | 7 | 2.31±0.00b | 18.84±1.66b | 4.41±0.29 |
| DHM高剂量组 | 7 | 1.47±0.23b | 29.24±3.97b | 2.01±0.14b |
| 5-氨基水杨酸组 | 7 | 1.41±0.29b | 26.91±1.61b | 2.05±0.11b |
| a: P＜0.01,与正常组比较; b: P＜0.05,与模型组比较 | ||||
3 讨论
目前，UC的发病机制仍未明确，主要观点认为UC是免疫、遗传、环境、肠道菌群等多种因素共同作用的结果。由于其发病机制不明，所以目前临床上仍缺少有效的治疗药物，因此，开发高效且安全副作用小的药物仍然是目前炎性肠病的研究热点。
5-氨基水杨酸(5-ASA)又名美沙拉嗪，是当前治疗UC的一线药物，能够有效缓解轻度和中毒活动期UC患者的症状。国内外众多研究对5-ASA治疗实验性小鼠结肠炎的机制见解各异，但相关数据对其疗效都是一致的认可[3-4]。DSS诱导的结肠炎动物模型在UC相关研究中应用广泛，病理表现近似于人类UC，可用于评价新的治疗方法对UC的治疗作用[5-6]。
本实验通过DSS诱导建立小鼠的急性UC模型，发现使用不同剂量DHM后，可不同程度缓解DSS诱导的小鼠急性溃疡性结肠炎的疾病活动指数(DAI)，结肠长度及脾脏指数变化。镜下可见DHM可以减轻溃疡性结肠炎模型肠黏膜的组织病理炎症改变。说明DHM对急性溃疡性结肠炎小鼠具有一定的干预机制。
近年来，随着对核因子NF-κB结构与功能研究的深入，细胞因子与 NF-κB的关系已引起了人们高度的重视，成为当今研究的热点,而通过激活NF-κB从而释放的如IL-1β、TNF-α、IL-6等炎性刺激因子，越来越多的研究证实,UC患者肠黏膜组织、血清及粪便中肿瘤坏死因子TNF-α、IL-1β、IL-6等多种细胞因子的表达均增强[7-8]。本实验应用EMSA测定NF-κB结果显示出经过DHM治疗的溃疡性结肠炎小鼠与模型组小鼠相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。通过ELISA法，结果显示出IL-1β、TNF-α、IL-6在模型组小鼠肠黏膜中表达明显升高，经过DHM治疗的溃疡性结肠炎小鼠肠组织中IL-1β、TNF-α、IL-6等炎性刺激因子较模型组相比，均有不同程度的降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。说明DHM能够降低DSS诱导的小鼠结肠组织中IL-1β、TNF-α、IL-6，具有一定的抗炎作用。
TLRs是一族具有信号转导功能的固有免疫识别受体，其中TLR2主要识别革兰阳性肽聚糖，而TLR4主要识别革兰阴性菌的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS) [9-10]。研究表明，TLR2和TLR4在正常的结肠黏膜中呈现低表达，而在溃疡性结肠炎的结肠黏膜中则呈现异常的高表达[11]，大量研究表明，TLR4/NF-κB 信号通路在UC中发挥至关重要的作用，因此，TLR2、TLR4受体及其信号传导通路可能是溃疡性结肠炎发病过程中的重要环节。本实验Western blot检测结果显示，溃疡性结肠炎模型组小鼠肠组织TLR2、TLR4表达明显增高,对照组小鼠结肠黏膜TLR2、TLR4表达较少，通过二氢杨梅素治疗的小鼠TLR2、TLR4及NF-κB表达含量明显降低，与模型组相比，差异均有统计学意义(P＜0.05)。说明TLR2、TLR4可能参与了溃疡性结肠炎的发生和发展，而DHM可抑制UC模型中TLR2、TLR4的表达，发挥抗炎作用。
免疫因素也被公认为是UC发病机制的重要因素之一。有报道肠黏膜超氧化物歧化酶(SOD)活性降低，髓过氧化物酶(MPO)活性 、一氧化氮(NO) 水平升高与 UC 的发病关系密切[12]。SOD是机体超氧自由基的清除剂，广泛分布于细胞内和各种体液中，机体多种病理过程如缺血性疾病、炎症、肿瘤、损伤、衰老等均与SOD密切相关。SOD活性的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力[13]。MPO是中性粒细胞嗜天青颗粒的重要组成部分，是粒细胞聚集的指标，也是炎症和组织损伤的指标。据报道，实验性动物和炎症性肠病患者的MPO活性都会显著增加[14]。NO作为另一种氧自由基也对肠黏膜具有氧化损伤和促炎作用，研究表明 UC病变黏膜中NO浓度的增加与炎症程度呈平行关系[15]。本实验ELISA结果显示，模型组小鼠SOD活性明显下降，NO、MPO活性明显升高，治疗组小鼠SOD活性不同程度升高，NO、MPO活性不同程度降低，与模型组相比具有明显的统计学差异(P＜0.05)，提示氧化应激在DSS诱导的UC模型中发挥了作用，而DHM具有一定的抗氧化作用，抑制组织的过氧化反应。因此，我们认为二氢杨梅素确实具有一定的抗氧化作用，增加SOD活性，抑制MPO、NO产生可能是其缓解小鼠结肠炎的机制之一。
以上研究结果表明，不同剂量DHM灌胃给药，可以不同程度有效缓解DSS诱导的小鼠结肠炎，对DSS小鼠结肠炎具有良好的保护作用。其作用机制是多方面的，可能通过抑制结肠黏膜组织TLR2、TLR4蛋白的合成，进而阻断了TLR/NF-κB信号通路的转导，使NF-κB的活性受到抑制，减少IL-1β、TNF-α、IL-6等炎性因子的表达、分泌，阻断炎症的放大效应从而有效减轻炎症反应对机体造成的损伤。同时，增加SOD活性，抑制MPO、SOD产生可能是其重要作用机制之一。本实验结果为确定信号通路中的关键分子和DHM最佳治疗剂量以及临床研发治疗UC药物提供了实验依据。
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