2. 710048 西安, 陕西省新安中心医院妇产科 ;
3. 710068 西安, 陕西省人民医院: 呼吸内科
2. Department of Gynaecology and Obstetrics, Xin'an Central Hospital of Shaanxi Province, Xi'an, Shaanxi Province, 710048, China ;
3. Department of Respiratory Diseases, Shaanxi Provincial People's Hospital, Xi'an, Shaanxi Province, 710068
肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的发病率和死亡率在不断上升[1]。肺鳞癌(squamous-cell lung cancer,SQCLC)与肺腺癌构成NSCLC的主体,肺鳞癌约占30%,是一种常见的肺癌病理类型,且发病率有上升的趋势[2-3]。寻找抑制SQCLC细胞增殖和侵袭的靶标分子,可为SQCLC的治疗提供理论依据。
微小RNA(microRNA,miRNA)是生物体内普遍存在的内源性非编码小分子RNA,可以通过与靶标mRNA的3′-非编码区(untranslated region,UTR)结合,降解mRNA,抑制其被翻译成蛋白质,在基因调控、个体发育、疾病的发生等过程中发挥重要的生理功能[4-6]。Takahashi等[7]认为miR-185可以介导NSCLC细胞周期阻滞。另外,miR-185具有抑制三阴性乳腺癌肿瘤细胞增殖的作用[8]。但其是否参与SQCLC细胞的增殖和侵袭尚不清楚。本研究探讨miR-185在SQCLC中的表达及其初步作用机制,为SQCLC的治疗提供有价值的线索。
1 材料与方法 1.1 主要试剂NCI-H520、NCI-H226和BEAS-2B细胞购自美国ATCC公司;RPMI1640 Medium、胎牛血清购自Gibco公司;TRIzol和SYBR Premix Ex TaqⅡ 购自大连宝生物工程有限公司;BCA试剂盒购自美国Pierce公司;MTT购自上海生工公司;E2F6兔单抗、GAPDH兔多抗和羊抗兔二抗均购自美国Abcam公司;EcoRⅠ和 XhoⅠ 限制性内切酶购自赛默飞世尔科技公司;DH5α细胞购自天根生化科技(北京)有限公司;PVDF膜购自美国Bio-Rad公司;miR-185类似物(miR-mimics)和其非特异对照(miR-NC)由上海吉玛制药技术有限公司合成;pmirGLO载体及双荧光检测试剂盒购自美国Promega公司。
1.2 细胞培养人肺鳞癌细胞系NCI-H520、NCI-H226以及正常的肺上皮细胞BEAS-2B由含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基于37℃的恒温细胞培养箱中培养。
1.3 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测TRIzol法提取总RNA,而后利用反转录试剂盒反转录合成cDNA,以合成的cDNA为反应模板进行qRT-PCR。反应体系20 μL含有10 μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ,1 μL cDNA。反应程序:94 ℃,10 min; 35 个循环(94 ℃,30 s;58 ℃,30 s; 72 ℃,35 s);2 ℃,终止延伸10 min。引物如下:miR-185上游: 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′,下游: 5′-TGGAGAGAAAGGCA-GTTCCTGA-3′。GAPDH上游: 5′-CGTCTTCACCACCA-TGGAGA-3′,下游: 5′-CGGCCATCACGCCACAGTTT-3′。U6上游: 5′-CTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′,下游:5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。 GAPDH和U6 small nuclear RNA(U6)为内参基因。基因相对表达量根据2-ΔΔCt法计算,取3次结果的平均值。
1.4 Western blot检测蛋白质提取试剂盒提取细胞中蛋白质,BCA试剂盒测定蛋白浓度。取50 μg蛋白质行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE,10%),将分离的蛋白质通过半干转法电转移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF),再用5%脱脂奶粉的溶液封闭PVDF膜2 h。含有E2F6兔单抗(1:500)或GAPDH兔多抗的TBST溶液4 ℃过夜孵育已封闭的PVDF。辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1:1 000)于室温下孵育2 h,利用凝胶成像系统观察结果。GAPDH为内参照,实验结果为重复3次的平均值。
1.5 双荧光素酶报告基因将E2F6的3′-UTR区包含miR-185结合位点的cDNA片段插入pmirGLO载体。将测序验证正确的pmirGLO-E2F6与miR-185 mimics或对照miR-NC共转染入NCI-H520和NCI-H226细胞,于5% CO2、37 ℃ 环境下培养48 h。裂解细胞,并根据双荧光素酶报告基因系统的方法检测萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性。通过公式计算相对荧光素酶活性。
相对荧光素酶活性=(萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性) ×100%
1.6 pcDNA.3.1-E2F6的构建及细胞转染TRIzol提取细胞的总RNA,反转成cDNA,然后扩增E2F6基因的全长。E2F6上游引物:5′-TCTGAA-TTCTTGTGCTGGGCCCTTGGAAATC2-3′,下游引物:5′-CCCGGTACCAATGCCATCAGTTGCTTACTTCAA-3′。扩增产物于琼脂糖凝胶中电泳,胶回收后,扩增产物与质粒pcDNA.3.1同时进行EcoRⅠ和 XhoⅠ双酶切后连接,转化到DH5α中扩增后鉴定,测序正确的pcDNA.3.1-E2F6用于后续实验。pcDNA.3.1-E2F6、pcDNA.3.1、miR-NC和miR-185 mimics的细胞转染步骤严格按照Turbofect的操作说明书进行。转染效率由qRT-PCR或Western blot检测。
细胞分组如下,Normal组:无转染处理的正常肺鳞癌细胞;pcDNA.3.1组:转染pcDNA.3.1的肺鳞癌细胞;pcDNA.3.1-E2F6组:转染pcDNA.3.1-E2F6的肺鳞癌细胞;miR-NC组:转染非特异性MicroRNA的肺鳞癌细胞;miR-185组:转染miR-185mimics的肺鳞癌细胞;miR-185-E2F6组:转染pcDNA.3.1-E2F6的过表达miR-185的肺鳞癌细胞;miR-185-pcDNA.3.1组:转染pcDNA.3.1的过表达miR-185的肺鳞癌细胞。
1.7 MTT测定细胞生长活力将NCI-H520和NCI-H226细胞分别接种到96孔板培养24 h后,转染细胞,5% CO2、37 ℃培养48 h后向各孔分别加入20 μL浓度为5 mg/mL的MTT,于上述培养环境下孵育4 h。而后弃掉上清液,每孔加入150 μL二甲基亚砜溶解结晶甲瓒。最后利用酶标仪测定波长490 nm处光密度值[D(490)],结果取3次重复实验的平均值。
1.8 细胞侵袭实验按照细胞侵袭试剂盒说明操作,然后在200倍光镜下随机选取5个视野,计算出侵袭到滤膜背面的细胞数,实验重复3次,结果取平均值。
1.9 统计学分析采用SPSS 16.0统计软件,数据以x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析,两组间均数比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 miR-185在肺鳞癌细胞中表达量降低采用qRT-PCR检测了肺鳞癌细胞系NCI-H520和NCI-H226中miR-185的表达量,结果表明,miR-185在NCI-H520和NCI-H226细胞中的表达量较正常肺上皮细胞BEAS-2B均显著下降(P<0.01,图 1)。
2.2 miR-185抑制E2F6基因表达量
经Targetscan(http://www.targetscan.org/)和microRNA.org(http://www.microrna.org/)分析,E2F6是miR-185的靶基因。为了证明这一结论,将miR-185 mimics与pmirGLO-E2F6共转染后进行双荧光素酶报告基因实验。结果表明,miR-185可以显著抑制pmirGLO-E2F6的荧光活性(P<0.05,图 2)。另外,通过转染miR-185 mimics到NCI-H520和NCI-H226细胞中使miR-185的含量上升,并利用qRT-PCR和Western blot分别验证过表达是否成功和miR-185对E2F6的作用。结果表明,转染实验中miR-185的表达量显著上升(P<0.01,图 3),且E2F6 的蛋白表达量随即显著下降(P<0.01,图 4)。
2.3 miR-185抑制肺鳞癌细胞增殖
MTT检测过表达miR-185的NCI-H520和NCI-H226细胞的增殖能力。结果显示,miR-185含量升高显著抑制NCI-H520(P<0.01)和NCI-H226(P<0.05)细胞的生长活力(图 5)。
2.4 miR-185抑制肺鳞癌细胞侵袭能力
为了检测miR-185对肺鳞癌细胞侵袭能力的作用,在miR-185含量升高的情况下,利用细胞侵袭实验试剂盒检测其对NCI-H520和NCI-H226细胞侵袭能力 的影响。结果显示,miR-185含量升高,可显著抑制肺鳞癌细胞的侵袭能力(P<0.05,图 6、7)。
2.5 miR-185通过抑制E2F6进一步抑制肺鳞癌细胞的增殖和侵袭能力
在miR-185含量升高的NCI-H520和NCI-H226细胞中转染pcDNA.3.1-E2F6重组质粒,最终达到miR-185含量升高(P<0.01,图 8)的同时过表达E2F6 的效果(图 9)。结果显示,过表达E2F6可显著抑制miR-185对NCI-H520和NCI-H226细胞增殖(P<0.01)和侵袭能力(P<0.05)的作用,可显著上调肺鳞癌细胞的增殖和侵袭能力(图 10、11)。
3 讨论
肺癌是目前发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一,其中肺鳞癌是很常见的肺癌类型[9-10]。肺鳞癌的治疗手段包括传统的手术方法和放疗、化疗,其靶向治疗也是重要手段[11]。miRNA可以通过翻译调节或降解 mRNA 来调控基因表达[12-13]。目前已报道与肺癌相关的 miRNA 包括 let-7a、 miR-145、miR-31、miR-146、miR-185 等 40 余种,其在肺癌组织中表达异常,发挥着促进或抑制肺癌发生、发展的功能[14-18]。
文献[19-20]报道miR-185已被证实在多种肿瘤(结肠癌、前列腺癌、肝癌等)中低表达,并认为其可以作为一个抑癌基因影响肿瘤细胞的生长和迁移。报道证实,miR-185具有抑制三阴性乳腺癌肿瘤细胞增殖和介导NSCLC细胞周期阻滞的作用[7-8]。另外,miR-185可以抑制人结直肠癌细胞的增殖能力[21]。但其对SQCLC细胞的增殖和侵袭的作用尚不清楚。本研究发现miR-185表达量在肺鳞癌中显著下调。转染miR-185 mimics 后,miR-185含量升高可显著抑制肺鳞癌细胞的增殖和侵袭能力。有研究表明,三阴性乳腺癌中miR-185可以通过靶向E2F6和DNMT1抑制肿瘤增长[8]。因此,我们推测miR-185可以在肺鳞癌中通过靶向E2F6抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭。
E2F6是E2F转录因子家族成员之一,E2F转录因子家族可以调节靶基因的转录,进而起到对细胞增殖、 凋亡及分化调节的作用,其在细胞周期调控中发挥重要作用[22]。E2F6对基因转录发挥抑制功能[23]。E2F6表达量减少可以抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖[8]。本研究通过双荧光素酶报告基因实验验证,在肺鳞癌细胞中E2F6是miR-185的靶向基因。同时,miR-185含量升高,E2F6的表达量显著下降,进一步证明miR-185靶向E2F6。另外,miR-185含量升高的同时过表达E2F6,结果显示肺鳞癌细胞的增殖和侵袭能力较只提高miR-185的含量时显著上升。说明miR-185可以通过靶向E2F6抑制肺鳞癌细胞的增殖和侵袭能力。
综上所述,肺鳞癌中miR-185的表达量显著减少,且E2F6是其靶基因。miR-185含量升高抑制E2F6的表达量,且显著降低肺鳞癌细胞的增殖和侵袭能力。另外,在miR-185含量升高的基础上过表达E2F6,抑制了只提高miR-185含量对肺鳞癌细胞的增殖和侵袭能力的作用。本研究表明,miR-185通过靶向E2F6抑制肺鳞癌细胞的增殖和侵袭能力,为肺鳞癌的治疗提供了新的理论依据。
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