肝癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一，在肿瘤相关性死亡中位居第3位[1]。目前肝癌治疗是以手术为主的综合治疗模式，但很多患者就诊时已失去手术机会，且术后复发率较高。肿瘤细胞的侵袭转移是导致这一结果的重要原因[2]。目前有研究认为，上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)能促进肝癌的侵袭和转移[3]，因此抑制EMT现象成为抑制肿瘤侵袭转移的新途径。维生素D3是一种类固醇类化合物，不仅调节钙磷代谢，而且其具有抑制EMT的作用[4]。EB1089作为一种最新研制的维生素D类似物，在诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞增殖方面有着明显效果[5-6]，同时与一些抗肿瘤药物具有协同作用，加强抗肿瘤效果[7]，有重要的临床应用前景。本研究旨在探讨EB1089对TGF-β1诱导肝癌细胞SMMC-7721上皮-间质转化现象的影响，进一步寻找抑制肿瘤侵袭转移的新途径。
1 材料与方法 1.1 材料人肝癌细胞株SMMC-7721由重庆医科大学生命科学研究院实验室提供；新鲜胎牛血清、DMEM高糖培养基、青霉素/链霉素溶液均购自美国HyClone公司；兔抗人E-cadherin多克隆抗体和兔抗人N-cadherin多克隆抗体，鼠抗人Vimentin单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG及山羊抗鼠IgG二抗均购自Immunoway公司；鼠抗人GAPDH单克隆抗体(内参)购自碧云天生物技术研究所；引物由宝生物工程(大连)有限公司合成，反转录试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；蛋白质印迹及蛋白质提取相关试剂购自碧云天生物技术研究所；EB1089购自Tocris生物公司，TGF-β1购自PeproTech公司。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养肝癌细胞SMMC-7721用含10%胎牛血清的DMEM培养液进行培养，用对数生长期的细胞制成单细胞悬液，以1×105个细胞/瓶的密度接种于细胞培养瓶中。当细胞密度为30%~40%时，更换培养液为含1%血清的DMEM培养液继续培养24 h。对照组细胞加入含0.1%乙醇(纯度100%)培养基，目的组细胞分别加入含不同浓度EB1089(1、10、100、1 000 nmol/L)的培养基培养不同时间(6、12、24、48 h)，筛选出EB1089作用于肝癌细胞SMMC-7721后上皮标志物E-cadherin表达水平变化显著的浓度和时间。然后将细胞分为4个组，其中3组分别加入含10 ng/mL TGF-β1、1 000 nmol/L EB1089、1 000 nmol/L EB1089+10 ng/mL TGF-β1的5% DMEM培养液，空白对照组加入含0.1%乙醇的5% DMEM培养液，作用48 h。
1.2.2 RT-PCRTRIzol法提取细胞总RNA，按反转录试剂盒提供的实验步骤反转录为cDNA，随后行实时荧光定量PCR检测E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表达。E-cadherin基因上游引物序列为5′-CCAAAGCCTCAGGTCATAAACAT -3′，下游引物序列为5′-TGAGATTGATTTTGTAGTCACCCAC -3′；N-cadherin基因上游引物序列为5′-CCATCAAGCCTGTGGGAATC -3′，下游引物序列为5′-GCCGCTTTAAGGCCCTCAT -3′；Vimentin基因上游引物序列为5′-TCTGGATTCACTCCCTCTGGTT -3′，下游引物序列为5′-ATCGTGATGCTGAGAAGTTTCGT -3′；内参照GAPDH基因的上游引物序列为5′-CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC -3′，下游引物序列为5′-GTAGAGGCAGGGATGATGTTCT -3′。扩增条件：第1步95 ℃ 1 min；第2步95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s、65 ℃ 5 s，共39个循环；最后75 ℃延伸7 min。采用CFX96Real-time System软件，定量分析目的基因E-cadherin、N-cadherin、Vimentin及内参照GAPDH的Ct值。采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量并进行统计学分析。实验重复3次。
1.2.3 Western blot不同组细胞处理一定时间后，分别提取各组细胞总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度后，各取30 μg蛋白行10% SDS-PAGE分离蛋白，并转移至聚偏二氟乙烯膜上，室温条件下在摇床上用封闭液封闭处理1.5 h，加入兔抗人E-cadherin、N-cadherin多克隆抗体(体积稀释比例为1:1 000)、Vimentin单克隆抗体(体积稀释比例为1:1 000)和内参鼠抗人GAPDH单克隆抗体(体积稀释比例为1:1 000)，4 ℃反应过夜，用PBST洗膜3次后，加入二抗[辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG或山羊抗鼠IgG(体积稀释比例为1:8000)]，37 ℃反应1 h，用PBST洗膜3次后，曝光成像。用Quantity one软件分析E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和GAPDH蛋白条带的灰度值，以E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白和GAPDH蛋白灰度值的比值表示E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白的相对表达量并进行统计分析。实验重复3次。
1.2.4 细胞形态学观察将SMMC-7721细胞分别以1×105/孔接种于6孔板，培养24 h之后更换为含1%血清的DMEM培养液进行饥饿化处理约24 h。再将细胞分为4组并培养48 h (同上)。于图 1每组细胞的形态并拍照，每组拍摄不低于4张照片。实验重复3次。
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| 图 1 Western blot检测不同浓度的EB1089作用于肝癌细胞SMMC-7721不同时间E-cadherin蛋白水平的变化 |
1.2.5 细胞Transwell小室侵袭迁移实验
Transwell小室迁移实验时，将4个不同处理组的SMMC-7721细胞消化离心，并用无血清培养基吹打均匀；将不同组含约1×105个细胞的200μL无血清培养基的细胞悬液分别接种于24孔板中不同小室的上室，小室膜的直径为8.0 μm，下室加入600 μL含10% DMEM的高糖培养基，放入37 ℃、5% CO2的培养箱中继续培养约24 h，将不同组的小室用4%多聚甲醛固定30 min，之后用0.1%结晶紫染色15 min，用双蒸水洗3次，显微镜下成像，随机选5个视野进行拍照。Transwell小室侵袭实验步骤基本同前，但加入细胞悬液前，将基质胶按1:8的比例稀释后加入小室，放入培养箱中48 h。实验重复3次。
1.3 统计学方法应用SPSS 17.0统计软件进行数据统计分析，用GraphPad Prism 5软件制图。实验数据以x±s表示，两独立样本间的比较采用t检验，多组之间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验。检验水准为α=0.05。
2 结果 2.1 EB1089作用浓度和时间的筛选1、10、100、1 000 nmol/L EB1089作用于SMMC-7721细胞6、12、24、48 h，同时设置对照组，Western blot检测E-cadherin蛋白表达水平。结果表明当EB1089的浓度为1 000 nmo/L，作用时间为48 h时，SMMC-7721细胞E-cadherin蛋白表达相对于对照组差异最为显著(P < 0.05，P < 0.01, 图 1)，故选择EB1089浓度为1 000 nmol/L，作用时间为48 h用于后续实验。
2.2 TGF-β1、EB1089引起SMMC-7721细胞形态的改变TGF-β1组SMMC-7721细胞形态由原来的不规则多边形变为长梭形，并伸出较多触角，与其他3组差别较大。与空白对照组相比，EB1089组SMMC-7721细胞形态变化不明显。与TGF-β1组相比，EB1089+TGFβ1组SMMC-7721细胞长梭形变化不明显，且触角减少(图 2)。
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| A:对照组；B: EB1089组；C:TGF-β1组；D:EB1089+TGF-β1组 图 2 相差倒置显微镜观察不同处理组肝癌细胞SMMC-7721形态变化(×200) |
2.3 EB1089作用SMMC-7721细胞后相关标志物的mRNA与蛋白表达
Western blot和实时荧光定量PCR实验检测4组细胞。结果显示，与空白对照组相比，TGF-β1诱导48 h后，间质细胞标志物N-cadherin和Vimentin的mRNA和蛋白表达明显增加(P < 0.05)，上皮细胞标志物E-cadherin的mRNA和蛋白表达明显降低(P < 0.05)；EB1089组E-cadherin的mRNA和蛋白表达增加，N-cadherin和Vimentin的mRNA和蛋白表达下降(P < 0.05，图 3A)。与TGF-β1组相比，EB1089+TGF-β1组N-cadherin和Vimentin的mRNA和蛋白表达明显下降，E-cadherin的mRNA和蛋白表达明显回升(P < 0.05)，但与对照组相比，EB1089+TGF-β1组N-caherin和Vimentin的mRNA和蛋白表达增加，E-cadherin的mRNA和蛋白表达明显减少(P < 0.05，图 3B)。
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| 1:对照组；2: EB1089组；3: TGF-β1组；4: EB1089+TGF-β1组A：Western blot检测结果；B：实时荧光定量PCR检测结果a:P < 0.05, 与对照组比较, b：P < 0.05, 与TGF-β1组比较 图 3 不同处理组E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白和mRNA表达情况 |
2.4 EB1089对TGF-β1诱导SMMC-7721细胞侵袭和迁移能力的影响
Transwell小室侵袭、迁移实验检测4组细胞侵袭、迁移能力。结果显示，与空白对照组相比，TGF-β1组SMMC-7721细胞穿膜细胞数明显增加(P < 0.05)，而EB1089组穿膜细胞数明显减少(P < 0.05)。与TGF-β1组相比，EB1089+TGF-β1组穿膜细胞数明显减少(P < 0.05, 图 4~7)。
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| A:对照组；B EB1089组；C: TGF-β1组；D: EB1089+TGF-β1组 图 4 显微镜观察EB1089对SMMC-7721细胞迁移能力的影响(结晶紫×100) |
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| a：P < 0.05，与对照组比较；b：P < 0.05，与TGF-β1组比较 图 5 Transwell检测EB1089对SMMC-7721细胞迁移能力的影响 |
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| A:对照组；B: EB1089组；C: TGF-β1组；D: EB1089+TGF-β1组 图 6 显微镜观察EB1089对SMMC-7721细胞侵袭能力的影响(结晶紫×100) |
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| a：P < 0.05，与对照组比较；b：P < 0.05，与TGF-β1组比较 图 7 Transwell检测EB1089对SMMC-7721细胞侵袭能力的影响 |
3 讨论
EMT是在特定的生理和病理情况下，上皮细胞向间充质细胞分化的现象。E-cadherin是上皮细胞的一种标志性蛋白, 在维持组织形态、细胞极性、细胞间连接方面起着关键作用。E-cadherin低表达与肿瘤细胞侵袭性增加和不良预后有关[8]。N-cadherin和Vimentin为间质细胞特征性蛋白，表达上调与上皮性肿瘤细胞转移性增强有关[9-10]。在EMT发生过程中，E-cadherin表达下调、N-cadherin和Vimentin表现为上调趋势。EMT的发生可受环境刺激和众多调节因子的影响，其机制相当复杂。TGF-β1是一个重要促EMT因子，已有研究表明在体外培养的肝癌细胞系、原代肝细胞以及大鼠肝细胞，均能通过TGF-β1诱导出典型的EMT现象[11]。Xu等[12]研究发现，10 ng/mL TGF-β1作用于肝癌细胞48 h时，其诱导EMT效果最佳。本实验中，我们观察到10 ng/mL TGF-β1作用于肝癌细胞SMMC-7721 48h后，细胞形态由不规则多边形向长梭形的“间质样细胞”转变；Real-time PCR和Western blot结果表明在TGF-β1作用下E-cadherin表达下调、N-cadherin和Vimentin表达上调, 这些变化均提示肝癌细胞SMMC-7721发生EMT。
维生素D为固醇类衍生物，维持体内的钙、磷代谢平衡。近年有研究表明，维生素D3能抑制TGF-β1诱导结肠癌细胞的EMT现象，减弱结肠癌细胞的侵袭、迁移能力[13]。同时，维生素D3的类似物MART-10对胰腺癌、乳腺癌细胞EMT现象表现出比维生素D3更强的抑制作用[14-15]。本实验中，我们观察到肝癌细胞SMMC-7721在TGF-β1作用下发生典型的EMT现象。但在加入1000 nmol/L EB1089干预48 h后，细胞形态向“间质样”转变的趋势明显减缓；同时，Real-time PCR和Western blot结果提示上皮细胞标志物E-cadherin蛋白和mRNA表达与TGF-β1组比较明显上调，间质细胞标志物N-cadherin和Vimentin蛋白和mRNA表达则明显下调，表明1 000 nmol/L EB1089对于TGF-β1诱导的肝癌细胞SMMC-7721发生EMT表现出抑制作用。EB1089干预后肝癌细胞SMMC-7721侵袭、迁移能力的明显下降，亦恰好印证了这点。
EB1089能减少机体50%钙代谢，同时，对多种肿瘤表现出生长抑制及促进分化的作用，是一种非常有潜力的抗肿瘤药物。目前相关研究多集中在其对细胞周期的调控、诱导细胞凋亡等方面，而其对肝癌细胞发生EMT的影响，尚少见相关报道。本研究中我们证实了TGF-β1能诱导肝癌细胞SMMC-7721发生EMT现象；同时，发现在EB1089的干预下，TGF-β1诱导肝癌细胞SMMC-7721发生的EMT明显减弱，细胞侵袭、迁移能力也受到明显抑制，其具体机制尚不明确。目前大多观点认为TGF-β通过多种途径诱导肿瘤EMT发生，机制主要是通过Smad依赖通路和非Smad依赖通路完成。相关研究表明维生素D类似物帕立骨化醇通过抑制TGF-β1的Smad信号通路来抑制EMT现象[16]。Debra等[17]的实验发现在慢性移植肾肾病中，维生素D的活性形式1, 25-(OH)2D3能通过下调TGF-β1/Smad的信号通路中Smad2的表达，上调Smad7的表达来减轻TGF-β1引起的纤维化。因此，我们认为在TGF-β1诱导SMMC-7721细胞EMT的Smad信号通路中可能存在EB1089的作用靶点。此外，TGF-β1也可通过丝裂原活化的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)途径激活下游的细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase, Erk), 从而诱导肿瘤EMT形成。文献[18]报道，维生素D可以下调表皮细胞生长因子受体的表达，通过抑制MAPK达到促进肿瘤细胞分化、凋亡并抑制其生长。EB1089是否也对TGF-β1激活的MAPK途径产生影响，目前尚不明确。Wnt通路也能与TGF-β1/Smad通路作用，上调EMT诱导因子Snail和Twist, 抑制E-cadherin的表达, 同时激活了β-catenin/TCF/LEF复合物, 间接导致Vimentin等间质标志物的表达, 共同协调对肿瘤EMT的调节。EB1089是否通过中间环节调节EMT，目前少见相关报道。同时，调节肝癌细胞SMMC-7721中TGF-β1及其受体的表达，也可能是EB1089影响TGF-β1诱导的EMT现象的一种机制。总之，TGF-β1诱导肝癌细胞SMMC-7721发生EMT是一个复杂的过程，EB1089对该过程的影响也可能存在多种途径，其具体机制有待进一步研究。
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