登革热(dengue fever，DF)是由登革病毒(dengue virus，DV)引起的一种重要虫媒病毒性传染病，主要流行于热带和亚热带地区，包括Ⅰ ～Ⅳ共4个血清型，其感染后除引起普通登革热外，2次异型感染还可导致严重的登革出血热或登革休克综合征。Bhatt等[1]通过统计和科学推算，估计全球每年大约有3亿9 000万人感染登革热，其中9 600万人会出现明显的临床或亚临床症状。该病已成为全球公共卫生关注的焦点之一。登革热1978年首次在广东佛山暴发，目前4个血清型均已在我国流行[2-4]，主要分布在广东、云南、福建、海南、广西等地[5-8]。2014年广东省再次暴发数十年来最大规模的Ⅰ型登革热疫情[9-10]，累计报告登革热病例45 000多例[11]。
登革热传播速度快、危害严重，而登革热疫苗研究尚未取得突破性进展，因此，快速、准确的诊断对及早发现和管理传染源，迅速控制疫情，降低医疗卫生费用具有重要意义。目前国内外对登革病毒的快速检测在研究探索上非常广泛，主要以实时荧光定量RT-PCR检测病毒核酸和酶联免疫吸附实验(ELISA)检测IgM和IgG抗体为主[12-15]，力求找到敏感、特异、高效、全面、快速且经济的检测方法。近年，在应用多种实验方法对登革病毒进行快速检测的研究中发现，单一的检测方法[16-17]不能在登革病毒感染的整个病程中显示出令人满意的敏感度和特异性，联合应用有利于临床快速诊断。本研究拟通过回顾性分析同时应用RT-PCR和ELISA方法，对2014年7-11月收集的Ⅰ型登革病毒感染者标本进行检测，分析不同病程病毒核酸和IgM抗体的变化规律，以期为指导临床选择合理高效的检测方法提供数据积累，为快速、准确地诊断登革热提供理论支持。
1 资料与方法 1.1 标本来源于2014年7-11月收集广州市内广东省武警总队医院、解放军第458医院、解放军第421医院3家医院门诊、急诊患者和传染科住院患者中出现如发热、头痛、眼眶痛、肌肉关节痛、乏力、皮疹、恶心、呕吐、腹泻等症状，疑似登革病毒感染者的基本临床资料和血标本，基本临床资料和血标本采集均获得患者或其监护人知情同意。基本临床资料包括如姓名、性别、年龄、发病日期、采样日期、主要临床症状、已有检查结果、临床初步诊断等。血标本于24 h内低温冷藏运输至检测实验室，1 500 r/min离心10 min，分离血清，同时应用实时荧光定量RT-PCR和ELISA方法分别检测病毒核酸和IgM抗体。纳入标准：有基本临床资料，至少有1项临床症状符合登革热感染的表现，且任意1种检测方法结果为阳性的病例。排除标准：临床资料收集不完整，缺乏如年龄、发病日期和采样日期的病例。本研究通过广州军区疾病预防控制中心伦理学委员会的批准(批准号2014004)。
1.2 主要试剂和仪器病毒核酸提取试剂盒(Invitrogen，美国)，一步法TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR试剂盒(TaKaRa，大连)，登革热IgM抗体捕获法ELISA试剂盒(Panbio，澳大利亚)。实时荧光定量PCR仪为罗氏Light Cycler 2.0(Roche，瑞士)，洗板机Bio-Rad Model 1575、酶标仪Bio-Rad iMarkTM(Bio-Rad，美国)。
1.3 方法 1.3.1 引物探针设计从GenBank搜集Ⅰ型登革病毒(DV1)标准株的全基因组序列，用Clustal X进行全基因组比对分析，获得病毒基因组的保守区及特异区，利用Primer Premier 6.0软件分别设计Ⅰ型登革病毒特异性引物和TaqMan探针[18]，由上海生工生物科技有限公司合成。DV1引物上游：5′-GTGGAGAGGAACCTTGTGAAACC-3′，下游：5′-CTGTGACTTTCTTC-AGCCCAGC-3′，TaqMan探针：5′-6-FAM-TGACCAGCCA CC-TCTTCCACAACCGA-BHQ-1-3′。内参GAPDH上游：5′-GGTGGACCTGACCTGCCGTCTA-3′，下游：5′-AGT-GTAGCCCAGGATGCCCTTGAG-3′，TaqMan探针：5′-6-FAM-CCTCCGACGCCTGCTTCACCACCTTCTTAMRA-1-3′。
1.3.2 实时荧光定量RT-PCR检测取200 μL患者血清，按照产品说明书提取RNA，进行RT-PCR反应：待检RNA 4 μL，Ex HS Taq 0.4 μL，RT Enzyme 0.4 μL，one step RT-PCR Buffer 10 μL，上下游引物及探针混合物1.6 μL，无RNA酶水补足20 μL。实时荧光定量RT-PCR反应在罗氏Light Cycler 2.0 PCR仪上进行，反应条件：42 ℃逆转录5 min；95 ℃预变性10 s；95 ℃ 变性5 s，54 ℃退火延伸30 s，共40个循环；37 ℃ 10 s。反应完毕后，由计算机自动报告Ct值，若 ≤35，且扩增曲线呈S型判定为阳性；40>Ct值>35判定为可疑，可疑标本复检1次，仍为可疑以阳性统计。
1.3.3 IgM抗体捕获法ELISA检测取10 μL血清标本，参照试剂盒说明书进行IgM抗体检测。结果判定为阴性、阳性和可疑，可疑标本重复检测1次，仍为可疑以阴性统计。
1.4 统计学分析应用SPSS 17.0统计软件，根据患者的发病日期和采样日期计算其病程，以出现具体临床症状的时间开始计为第1天。全部病例按急性期(发病1～5 d)和恢复期(发病6～10 d)分为2组。检测结果分3类：病毒核酸阳性但抗体阴性，即DV1(+)、IgM(-)；病毒核酸和抗体均为阳性，即DV1(+)、IgM(+)；病毒核酸阴性但抗体阳性，即DV1(-)、IgM(+)。统计不同检测结果的病例数。病程急性期和恢复期检测结果构成比的差异和不同年龄组检测结果差异比较行χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 纳入患者一般临床资料共纳入222例患者，其中男性134例(60.4%)，女性88例(39.6%)，年龄1~89(36.8±16.3)岁，主要分布在21~50岁，占73.5%(表 1)。主要临床表现：发热209例(94.1%)，头痛眼眶痛71例(32.0%)，肌肉关节痛76例(34.2%)，皮疹66例(29.7%)，乏力57例(25.7%)，咽喉红肿、浅表淋巴结肿大29例(13.1%)，恶心、呕吐20例(3.2%)，腹泻7例(3.2%)，其他30例(13.5%)。
| 年龄(岁) | 病例[n(%)] | DV1(+)、IgM(-)(例) | DV1(+)、IgM(+)(例) | DV1(-)、IgM(+)(例) |
| ≤20 | 22(9.9) | 6 | 8 | 8 |
| ＞20~30 | 77(34.7) | 23 | 23 | 31 |
| ＞30~40 | 45(20.3) | 15 | 14 | 16 |
| ＞40~50 | 41(18.5) | 15 | 12 | 14 |
| ＞50~60 | 11(5.0) | 3 | 4 | 4 |
| ＞60 | 26(11.6) | 14 | 6 | 6 |
| 合计 | 222(100.0) | 76 | 61 | 85 |
2.2 DV1病毒核酸和IgM抗体检测
222例阳性血清标本，实时荧光定量RT-PCR法检测出阳性标本131例，Ct值介于16～35之间，均呈现典型的S形曲线，可疑标本6例，复检仍可疑，以阳性结果统计，共计137例。ELISA法检测出IgM抗体阳性标本146例，可疑标本2例，复检仍可疑，以阴性结果统计。两者同时阳性标本61例。不同年龄组之间检测结果比较，差异无统计学意义(χ2=6.071，P＞0.05，表 1)。
2.3 不同病程检测结果分布222例患者检测结果根据其病程时间顺序排列如表 2所示。急性期(发病1～5 d)以病毒核酸阳性为主，其中在发病1～2 d约占90%以上，第3～5天为75%~80%；进入恢复期(发病6～10 d)病毒核酸阳性率开始快速下降，第6～7天降至43%以下，第8天后仅20%左右。与此呈相反趋势，IgM抗体在发病第1天不能检测到，至第2天阳性率即接近20%，第3天开始明显上升，并保持逐渐升高趋势，第3～5天升高至50%～70%；恢复期IgM抗体阳性占绝大部分，第6～7天阳性率可达95%以上，第8～10天保持在100%。
| 病程 | DV1(+)、IgM(-) | DV1(+)、IgM(+) | DV1(-)、IgM(+) | 合计 |
| 急性期 | ||||
| 第1天 | 11(100.0) | 0(0) | 0(0) | 11 |
| 第2天 | 21(80.8) | 2(7.7) | 3(11.5) | 26 |
| 第3天 | 14(50.0) | 7(25.0) | 7(25.0) | 28 |
| 第4天 | 17(38.6) | 16(36.4) | 11(25.0) | 44 |
| 第5天 | 11(29.7) | 18(48.7) | 8(21.6) | 37 |
| 第1～5天合计 | 74(50.7) | 43(29.4) | 29(19.9) | 146 |
| 恢复期 | ||||
| 第6天 | 1(3.8) | 10(38.5) | 15(57.7) | 26 |
| 第7天 | 1(4.5) | 8(36.5) | 13(59.0) | 22 |
| 第8天 | 0(0) | 4(21.1) | 15(78.9) | 19 |
| 第9天 | 0(0) | 0(0) | 3(100.0) | 3 |
| 第10天 | 0(0) | 2(33.3) | 4(66.7) | 6 |
| 第6～10天合计 | 2(2.6) | 24(31.6) | 50(65.8) | 76 |
| 合计 | 76(34.2) | 67(30.2) | 79(35.6) | 222 |
DV1(+)、IgM(-)在发病第1～2天分别占当日病例的100.0%、80.8%，至第3天下降为50.0%，第4～5天持续下降。而DV1(-)、IgM(+)所占比例从发病第2天开始缓慢上升，第6天迅速上升，在发病第9天达100.0%。DV1(+)、IgM(+)的变化趋势与病毒核酸和抗体的变化保持一致，第1～5天随抗体阳性率升高而平稳升高，第6～10天随病毒阳性率下降而平稳下降。在发病第10天，仍有2例病毒核酸阳性者，1例为男性79岁，1例为女性62岁，均为年老体衰有基础疾病患者，可能因机体免疫功能衰退及清除病毒能力下降，所以仍可检测到病毒核酸阳性，但就整体而言，IgM抗体阳性率为100.0%(6/6)。
2.4 病程急性期和恢复期检测结果分析病程急性期DV1(+)、IgM(-)占97.4%(74/76)，DV1(+)、IgM(+)占64.2%(43/67)，DV1(-)、IgM(+)占36.7%(29/79)；而恢复期DV1(+)、IgM(-)只占2.6%(2/76)，DV1(+)、IgM(+)占35.8%(24/67)，DV1(-)、IgM(+)占63.3%(50/79)。不同病程检测结果构成比间比较差异有统计学意义(χ2=63.41，P＜0.05)。
3 讨论本研究同时应用实时荧光定量RT-PCR和ELISA法检测Ⅰ型登革病毒感染者标本，可克服仅用单一检测方法漏诊率比较高的缺点，实现了对登革热的快速诊断。从检测阳性的222例患者的临床资料来看，其临床表现符合登革热感染的典型症状，包括发热、头痛、眼眶痛、肌肉关节痛、乏力、皮疹、恶心、呕吐等，与其他学者的临床分析结果吻合[19]。结合临床表现和两种检测结果综合判断，有利于临床医师快速确诊，及时开展登革热的治疗和防控，提高对疾病早期的诊断效率。
本研究对不同病程病毒核酸和IgM抗体的变化情况分析发现，病程急性期(发病1～5 d)以病毒核酸阳性为主，阳性率为75%～100%，进入恢复期(发病6～10 d)病毒核酸阳性率快速降低，8 d后仅20%左右；与此趋势相反，IgM抗体阳性率在发病第1～2天较低，但第3～5天快速升高至50%～70%，恢复期阳性率显著升高达95%~100%。国外学者对二者的变化趋势亦有类似发现。如Teoh等[20]在对登革病毒的早期诊断研究中发现，在病程＜5 d时，病毒核酸的检测阳性率为75.0%～85.0%，到病程第5天，阳性率下降至51.9%～63.0%，5 d后阳性率仅有16.9%～27.7%； 而IgM抗体的阳性率则由＜5 d时的35%上升至5 d后的92.3%。Hunsperger等[21]亦获得相似结果，并建议同时采用两种以上的检测方法综合分析，对登革病毒感染可达90%以上的诊断率，大大提高早期诊断的准确性。本研究进一步印证了登革病毒感染后病毒核酸和抗体的变化规律，通过了解和掌握其变化规律，可指导临床医师根据患者就诊时所处的病程，科学合理地选择检测方法，采用更高效、经济的手段实现最大效率地确诊登革病毒感染者。本研究结果提示，在临床实践中，若患者处于发病1～2 d，可以以病毒核酸检测为主；在发病3～5 d，应同时采用两种检测方法为优，因为此时期部分患者核酸检测可能为阴性，但IgM抗体水平已经升高至可检测的范围，同时检测可减少漏诊率；在发病6～10 d，则可考虑以IgM抗体检测为主，因为此时期患者的IgM抗体阳性率水平保持在95%以上，能够将绝大部分病例确诊。若条件允许，尤其是预测可能有疫情暴发的情况，建议两种检测方法联合应用，可大大提高对疾病的诊断效率，实现快速、准确地诊断，利于及时开展针对性治疗和实施疾病防控措施。
本研究中病程在第8～10天病例数偏少，一定程度影响了统计分析的准确性，可进一步积累资料。并且病程只观察到第10天，没有超过11 d的资料，可能是患者不会拖延病情太久再去医院就诊，所以鲜有超过10 d还未医治的患者，或有部分患者症状较轻，自行买药后好转，因此对病程超过11 d的资料收集造成了影响。对病程≥11 d的患者，可根据机体抗体变化的一般规律和经验[22]，采用合适的检测方法。本研究仅收集了Ⅰ型登革病毒感染者的资料，其他型别的登革病毒资料和数据还有待积累。
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