2. 050011 石家庄，河北医科大学第四医院：消化内科
2. Department of Gastroenterology, the Fourth Affiliated Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang, Hebei Province, 050011, China
胃癌是严重威胁人类健康的消化系统恶性肿瘤。虽然近年来胃癌的发病率有所下降，但病死率和复发率却无明显改善[1-2]。胃癌病因中遗传因素有较为重要的意义[3-4]。胃癌早期无特异性症状，难以引起患者的重视。待症状明显时多已处于中晚期，许多患者失去了手术根治的机会。因此，采用简便的方法，找到胃癌的易感基因，对胃癌的防治有重要的临床意义。丝氨酸蛋白酶抑制剂B1(serine protease inhibitor,clade B,member 1，Serpin B1)是蛋白酶抑制剂家族成员之一，能通过与多种蛋白酶活性部位不可逆结合，阻止酶原活化、表达、分泌、降解等作用以减少蛋白酶的生成或调节蛋白酶的水解活性，使蛋白酶水解减少，活性减弱，从而维持体内稳定[5-6]。当其发生活性或功能变化时，可能造成肿瘤的发生。有研究表明，Serpin B1对肝癌细胞有调控作用[7]，我们前期研究也发现Serpin B1基因与胃癌分化有关[8]，但目前关于外周血Serpin B1基因多态性与胃癌之间关系尚不清楚。本研究检测了胃癌患者和健康人群外周血中Serpin B1基因H67Q位点多态性的分布差别以及不同基因型中Serpin B1浓度水平的变化情况，探讨Serpin B1与胃癌的发生、发展之间的联系。
1 材料与方法 1.1 研究对象选取2013年1月至2015年12月河北医科大学第四医院就诊并确诊为胃癌的350例患者作为病例组，均有病理学确诊。患者纳入标准：①有病理学证据确诊为胃癌；②患者均为初诊患者；③入组者未经过放疗、化疗、生物治疗等措施。排除标准：①合并其他恶性肿瘤患者；②复发或手术后患者；③合并严重肝肾、血液系统、免疫系统疾病患者；④经过术前治疗的患者；⑤妊娠期患者；⑥不能配合或不愿配合的患者。其中男性201例，女性149例，年龄(51.7±10.8)岁。选取同期来我院查体的健康人350例为对照组。其中男性203例，女性147例，年龄(51.3±13.3)岁。两组性别、年龄匹配，具有可比性。本研究由医院伦理委员会批准，研究对象均签署知情同意书。
1.2 方法 1.2.1 标本采集所有入选者晨起空腹抽取静脉血6mL，4 mL放入促凝管中，室温静置30 min，3 500 r/min 离心(1 760×g)15 min，分离血清，-20 ℃ 冻存备用；2 mL放入EDTA-K2抗凝管中，充分混匀，-80 ℃ 冻存备用。
1.2.2 血清Serpin B1浓度的检测选用人SERPINB1酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(美国 R&D公司，货号：20151113)。使用前室温平衡30 min，严格按照说明书操作。准确性：R≥0.990 0，灵敏度：最低检测浓度＜0.5 ng/mL，板内、板间变异系数均＜15%，用酶免之星全自动酶标仪在450 nm处测定光密度值[D(450)]，检测读数，计算样品浓度。
1.2.3 基因组DNA的提取EDTA-K2抗凝血应用TIANamp Genomic DNA Kit 血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型，DP304)，严格按照试剂盒说明书的规定操作，提取基因组DNA。
1.2.4 扩增目的基因Serpin B1基因H67Q位点引物序列：上游为5′-ACTTTATAGTTTCAAAATAA-3′，下游5′-TTTTAGAATGTGAAGGGCAA-3′。建立由上下游引物、dNTP、模板DNA、Taq DNA聚合酶、MgCl2、10×扩增缓冲液组成的总体积为50 μL的PCR反应体系，先后经过预变性、变性、退火、延伸等实验过程条件下进行PCR 扩增，扩增完成，取反应后体系中5 μL PCR扩增产物，经2%琼脂糖电泳检测确认并与标准(TaKaRa，150 bp)进行比较，判断PCR扩增产物的准确性。
1.2.5 DNA序列分析将扩增的PCR产物纯化，应用超高通量基因组测序系统GS FLX+系统(Roche Applied Science，型号GS FLX+ System)双向测序，得出PCR产物的基因组序列图。应用DNAMAN软件将测定结果与GenBank查询确定的基因序列进行比对，比较两者基因序列的差异。
1.3 统计学处理采用SPSS 13.0统计软件。计量资料以x±s表示，组间比较采用t检验；计数资料以百分率(%)表示，组间比较采用χ2检验；应用Logistic回归分析Serpin B1基因H67Q位点多态性与胃癌之间的关系。检验水准：α=0.05。
2 结果 2.1 Serpin B1基因H67Q位点直接测序结果PCR产物纯化后双向测序结果显示，Serpin B1基因H67Q位点存在2种等位基因G和T，共有3种基因型：纯合突变型(GG)、杂合突变型(GT)、野生型(TT)。Serpin B1基因H67Q位点发生突变，该突变位于第2外显子，所在区域编码Serpin B1蛋白的RSL环状结构区，第201位碱基由T突变为G，使第67位氨基酸由CAT突变为CAG，即异亮氨酸突变为苯丙氨酸。结果见图 1。
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| A：TT基因型；B：GT基因型；C：GG基因型 图 1 Serpin B1基因H67Q位点多态性基因序列 |
2.2 Serpin B1基因H67Q位点多态性基因型和等位基因频率分布
病例组与对照组基因型分布比较，差异有统计学意义(χ2=91.95，P＜0.01)；病例组GG基因型频率、GT基因型频率，均显著高于对照组(χ2=37.41，66.83，P＜0.01)。病例组G等位基因频率显著高于对照组(χ2=110.90，P＜0.01，表 1)。
| 组别 | n | 基因型 | 等位基因 | |||
| TT | GT | GG | T | G | ||
| 病例组 | 350 | 210(62.0) | 92(26.3)a | 48(13.7)a | 512(73.1) | 188(26.9)a |
| 对照组 | 350 | 319(91.1) | 20(5.7) | 11(3.1) | 658(94.0) | 42(6.0) |
| a：P＜0.01，与对照组比较 | ||||||
2.3 不同基因型间Serpin B1浓度水平的比较
病例组中Serpin B1的浓度明显高于对照组(t=145.7，P＜0.01)。病例组中，GG基因型Serpin B1的浓度明显高于GT基因型和TT基因型(t=2.846，P＜0.01；t=8.895，P＜0.01)；GT基因型Serpin B1的浓度明显高于TT基因型(t=7.341，P＜0.01)。对照组中，GG基因型Serpin B1的浓度明显高于GT基因型和TT基因型(t=36.490，P＜0.01；t=43.593，P＜0.01)；GT基因型Serpin B1的浓度明显高于TT基因型(t=9.630，P＜0.01，表 2)。
| 组别 | 例数 | Serpin B1浓度(ng/mL) |
| 病例组 | 350 | 295.3±34.6a |
| GG基因型 | 48 | 333.5±48.2abc |
| GT基因型 | 92 | 312.4±37.8ab |
| TT基因型 | 210 | 279.1±35.6a |
| 对照组 | 350 | 22.7±5.3 |
| GG基因型 | 11 | 67.3±2.7bc |
| GT基因型 | 20 | 28.5±2.9b |
| TT基因型 | 319 | 20.8±3.5 |
| a：P＜0.01，与对照组比较；b：P＜0.01，与TT基因组比较；c：P＜0.01，与GT基因组比较 | ||
2.4 Logistic回归分析Serpin B1基因H67Q位点多态性与胃癌间的关系
以是否患有胃癌(无=0，胃癌=1)为因变量，以年龄(＜50岁=0，≥50岁=1)、性别(男=0，女=1)、Serpin B1基因H67Q位点基因型(Tt=0，Gt=1，GG=2)、 等位基因(t=0，G=1)、Serpin B1浓度为自变量，进行分析。结果显示，GG基因型、G等位基因与胃癌关系密切，GG基因型、G等位基因是胃癌的独立危险因素(表 3)。
| 变量 | B | SE | Wald | P | OR | 95%CI |
| 年龄 | 0.374 | 0.389 | 1.246 | 0.213 | 0.853 | 0.437~1.168 |
| 性别 | 0.268 | 0.317 | 2.067 | 0.325 | 0.629 | 0.418~1.023 |
| Serpin B1浓度 | 0.167 | 0.228 | 1.925 | 0.116 | 0.924 | 0.504~1.429 |
| 基因型 | 3.016 | 0.402 | 13.275 | 0.006 | 9.485 | 2.169~44.283 |
| 等位基因 | 0.698 | 0.163 | 2.371 | 0.014 | 5.105 | 1.847~13.360 |
3 讨论
当前胃癌为严重威胁人类生命健康的重要疾病。胃癌的发生与多种因素有关，遗传因素在其中为重要因素[9]。确定与胃癌发生、发展相关的基因意义重大。本课题组前期研究发现Serpin B1基因与胃癌有关[8]，但具体情况尚不清楚。其他研究也发现Serpin B1基因与恶性肿瘤有关[7]。为了解Serpin B1蛋白及基因多态性在胃癌患者外周血的表达及意义，本研究检测了外周血中Serpin B1的水平以及Serpin B1基因H67Q位点的多态性。
Serpin B1属于蛋白酶抑制因子家族，广泛存在动植物体内，其主要作用为调节丝氨酸蛋白酶的生物活性。其蛋白结构含有9个α-螺旋和3个β-折叠，并形成RSL环状结构区，用于与靶向酶识别并共价结合，从而改变靶向蛋白酶的活性和功能[10-11]。当Serpin B1出现结构异常或功能异常时，蛋白酶的水解反 应将失去控制，可能引起疾病的发生。本研究结果显示，与对照组相比较，胃癌患者外周血中Serpin B1的水平升高，就证实了Serpin B1可能与胃癌的发生有关。
Serpin B1蛋白由379个氨基酸残基组成，当Serpin B1基因发生突变时，Serpin B1双螺旋结构的空间构象发生变化，Serpin B1蛋白的功能受到影响[12]。本研究中Serpin B1基因H67Q位点位于第2外显子，所在区域编码Serpin B1蛋白的RSL环状结构区，第201位碱基由T突变为G，使第67位氨基酸由CAT突变为CAG，即异亮氨酸突变为苯丙氨酸。该突变可能导致该区域结构异常，无法与蛋白酶识别结合，从而无法发挥其抑制作用。我们检测发现该单核苷酸多态性位点有G、T 2种等位基因，TT、GT、GG 3种基因型。
本研究发现病例组和对照组外周血均存在Serpin B1基因H67Q位点多态性。本研究表明，病例组中GG、GT 2种基因型所占的比例明显高于对照组中的2种基因型所占的比例；病例组中G等位基因的频率 (26.9%)远高于对照组中G等位基因的频率(6.0%)。 因此我们推测Serpin B1基因H67Q位点突变可能与胃癌的发生关系密切，但尚待更为深入的研究予以证实。
本研究进一步把入组者按GG、GT、TT基因型分成3组，比较病例组和对照组中不同基因型之间Serpin B1浓度的变化。结果发现病例组与对照组中GG基因型Serpin B1的浓度明显高于GT基因型和TT基因型者；GT基因型Serpin B1的浓度明显高于TT基因型者。从而证明Serpin B1基因H67Q位点突变影响了外周血中Serpin B1蛋白的水平。结果提示Serpin B1基因H67Q位点发生突变干扰了该基因的正常转录及翻译功能，使蛋白的抑制功能丧失，无法精准地控制细胞内外不断发生的各种各样的水解反应，破坏了机体内部环境的稳定，导致肿瘤发生。
为了解Serpin B1基因H67Q位点多态性与胃癌发生的关系，本研究进行了Logistic回归分析。结果显示GG基因型、G等位基因是胃癌发生的重要危险因素，说明Serpin B1基因H67Q位点突变与胃癌有关，检测外周血Serpin B1基因H67Q位点多态性可能对预测胃癌发生有益。
总之，本研究发现胃癌患者外周血中存在Serpin B1基因H67Q突变，且该突变为胃癌发生的危险因素。因此，检测Serpin B1基因H67Q位点多态性，对早期发现、早期诊断胃癌有益；外周血Serpin B1蛋白的检测也可能作为新的胃癌标志物。但本研究为单中心研究，尚需扩大研究规模并对Serpin B1基因的突变进行深入分析。
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