2. 400030 重庆，重庆市肿瘤研究所：血液肿瘤生物治疗科
2. .Department of Biotherapy for Hemato-oncology, Chongqing Cancer Institute, Chongqing, 400030, China
肿瘤抗原(tumor antigens，TAs)是肿瘤细胞不同于正常细胞的基因表达产物，能有效地诱导机体针对瘤细胞产生体液免疫和细胞免疫应答，是肿瘤免疫治疗的分子基础，可对恶性肿瘤的诊断、治疗及监测提供靶分子[1]。恶性肿瘤是高发病率与高病死率性疾病，严重威胁人类健康，且其发病率和病死率呈逐年上升趋势。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是亚洲最致命的癌症，是全球恶性肿瘤患者中位居第二的常见死亡病因，同其他癌症比较，其治疗手段更为受限，且预后更差，确诊患者的生存期最多是1年[2]。HCC高病死率的原因主要是其早期诊断缺乏敏感的检测手段所致[3-5]。本实验采用双向凝胶电泳、Western blot、质谱鉴定等蛋白质组学技术检测HCC的相关TAs，并采用免疫组织化学与Western blot检测予以验证，以期为HCC的早期诊断和治疗奠定基础。
1 材料与方法 1.1 样本收集未经化疗、放疗等治疗的HCC患者手术组织样本30例(其中HCC组织及其对应的癌旁组织各15例)及其HCC组织和对应癌旁组织的血液样本各15例。全血采集10~15 mL，于4 ℃过夜静置后，1 000×g离心20 min收集血清并分装成5~8管，于-80 ℃保存备用。手术切下的每例HCC及其癌旁组织被大部分分装成5~8份(30 mg/份)冻存于液氮内备用，小部分(0.6 cm×0.2 cm×0.4 cm)固定于10%中性甲醛内进行常规病理制片，镜检鉴定其癌变情况。本研究经本所(重庆市肿瘤医院)伦理委员会审核同意，患者均签署知情同意书。
1.2 主要试剂蛋白酶抑制剂(PMSF)、胎牛血清标准品(BSA)、二硫苏糖醇DTT、十二烷基硫酸钠(SDS)、N, N, N’, N’-四甲基乙二胺(TEMED)、过硫酸铵(AP)、低熔点琼脂糖、乙腈、胰酶、三氟乙酸(TFA)、HCCA、Acylamide购自Amresco公司；Tris-base、Glycine、Urea、Tris-HCl、Thiourea、CHAPs、Acetone、IPG、Bromophenol blue、Glycerol、Tween-20购自Promega公司；drystrip、cover oil、paper wick购自GE公司；高灵敏度化学发光检测试剂、Nitrocellulose Blotting Membrane购自Life Science公司；G250购自Bio Basic公司；X线胶片购自柯达公司；N, N’-methylenebisacrylamide购自Sigma公司；DNAJB11兔多克隆抗体(ab75107)与PSMA3(ab109532)兔单克隆抗体购自Abcam公司；免疫组化即用型检测试剂盒、胃蛋白酶消化液及DAB显色试剂盒购自中杉公司。
1.3 方法 1.3.1 组织总蛋白的制备与定量分别从液氮中取出冻存的30例组织(HCC及其癌旁组织各15例)各30 mg，放入盛有液氮的研钵中研磨至粉末，加入裂解液充分溶解粉末，4 ℃，离心20 min (12 000 r/min)，收集上清，上清经超声破碎核酸，丙酮-20 ℃过夜沉淀等以纯化蛋白，并予以定量。
1.3.2 HCC、对应的癌旁组织与其自体血清相互作用的有效性验证采用Western blot分别将各HCC及其癌旁组织总蛋白转移至NC膜，5%脱脂奶室温封闭1 h后，与患者自体血清(一抗：1 :100~1 :900)杂交3~20 h，添加酶标记的羊抗人IgG (二抗：1 :2 000)，室温孵育3 h后同发光底物结合7 min左右，压片、曝光、显影与定影，GAPDH (相对分子质量为3.7×104)作内参，检测HCC、对应的癌旁组织与其自体血清的相互作用情况。
1.3.3 2-DE检测与电泳胶固定将经定量的15份HCC组织总蛋及其15份癌旁组织总蛋白各混合成1份样品。准备好水化盘，吸取上样液(相应量的混合总蛋白样品、1%DTT、1%IPG Buffer、1× BPB、RB)加置水化盘槽底。从冰箱取出干胶条放入水化盘槽中于室温20 ℃水化浸泡10~12 h后进行等电聚焦(一向电泳)：S1 stp 500 V 1 h→S2 grd 1 000 V 1 h→S3 grd 8 000 V 3 h→S4 stp 8 000 V 2 h 30 min，总电压时间积约60 kVh。去离子水洗涤胶条，分别用含100 mmol/L DTT与250 mmol/L iodoacetamide的平衡液(50 mmol/L Tris-HCl、6 mol/L Urea、30% Glycerol、2% SDS、0.002% Bromophenol blue)平衡胶条15 min。平衡后的胶条采用SDS-PAGE进行垂直电泳，即二向电泳：S1 2 W/gel 60 min→S2 17 W/gel约4 h 30 min (溴酚蓝前沿达玻璃板下沿时停止电泳)。电泳结束后，用去离子水洗涤胶块3次，放入固定液，室温固定2~3 h。每份混合总蛋白样品同时制备3张2-DE凝胶，其中2张用于染色(银染与考染)，余下1张用于Western blot转膜。
1.3.4 2-DE胶染色与图像采集取HCC或其癌旁样本2-DE凝胶，用硝酸银染色60 min，以检测鉴定样本是否合格。取HCC及其癌旁样本2-DE凝胶，用考马斯亮蓝G-250染色6~8 h，用于质谱鉴定。将背景清晰的2-DE染色胶进行扫描并保存图像。扫描后的凝胶用保鲜膜包好，置于4 ℃备用。
1.3.5 2-DE-Western blot检测分别取未染色的HCC及其癌旁样本的2-DE凝胶，将经2-DE分离的蛋白转移至NC膜上，余同1.3.2。
1.3.6 图像分析与质谱鉴定采用图像分析软件Image Master 2D platinum 5.0对HCC及其癌旁组织蛋白的2-DE-Western blot图像予以分析比对，寻找感兴趣的蛋白斑点。根据比对结果在相应的2-DE考染胶上挖取相应的蛋白斑点进行脱色、脱水、酶切、肽段抽提及点靶，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(Ultraflex Ⅲ TOF/TOF)进行检测(UV波长：355 nm，重复速率：200 Hz，加速电压：20 000 V，最优质量分辨率：1 500。扫描质量范围：700~3 200)，利用flexAnalysis软件过滤基线峰、识别信号峰以获得肽质量指纹图谱，以软件BioTools检索uniprot等数据库，寻找相关匹配蛋白，并查询其功能。
1.3.7 HCC相关TAs的免疫组织化学检测验证15例人HCC及其癌旁组织包埋在一起形成组织芯片，制成4 μm的石蜡切片，采用HCC相关TAs抗体与即用型检测试剂盒对HCC相关TAs进行抗原染色, 胃蛋白酶消化液消化以修复抗原，DAB显色试剂盒显色，具体按各试剂盒说明书进行。
1.3.8 HCC相关TAs的Western blot验证采用Western blot，将HCC及其癌旁组织总蛋白转移至NC膜上，浸于含HCC相关TAs抗体的封闭液，4 ℃过夜，添加酶标记的相应二抗，室温孵育1.5 h，同底物于25 ℃结合7~10 min，β-actin (相对分子质量为4.3×104)作内参。
1.4 统计学分析采用SPSS 16.0统计软件进行统计分析，计量资料以x±s表示，2组间比较采用t检验，多组间差异行方差分析。检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 组织样本的癌变情况镜检鉴定常规病理制片镜检结果显示，HCC患者的HCC及其癌旁组织样本符合要求，可用于后续实验(图 1)。
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| 图 1 人HCC (A)及其癌旁组织(B)病理学变化(HE) |
2.2 HCC及其癌旁组织与自体血清相互作用的有效性验证
用一抗(自体血清)对HCC或其癌旁组织蛋白进行Western blot检测，均能曝光出清晰的条带(图 2)。结果显示，自体血清与其HCC或其癌旁组织蛋白均能良好结合，检测样本合格，可进行后续实验。
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| 1：HCC癌旁组织；2：HCC组织 图 2 Western blot检测人HCC及其癌旁组织蛋白与自体血清的相互作用 |
2.3 2-DE胶染色检测
取HCC或癌旁组织蛋白跑一张双向电泳胶银染，检测结果显示，斑点分离清晰，样本未见蛋白降解(图 3)，提示组织样本合格，可以进行后续实验。
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| 图 3 人HCC组织蛋白的双向电泳胶银染预实验检测结果 |
2.4 图像分析与质谱选点
HCC及其癌旁组织蛋白分别与血清杂交后，其NC膜上可见多个蛋白斑点，其中有些斑点是转有HCC组织蛋白的NC膜独有的，有些是两者共有的。采用图像分析软件对2-DE-Western blot图像与2-DE考染胶图像进行分析，比对出HCC组织蛋白上调的斑点33个，下调的斑点57个。从这些上、下调的斑点中筛选到19个蛋白斑点用于质谱检测，其中编号1~11是转有HCC组织蛋白的NC膜独有的斑点(图 4A)，编号A01-A08是两者共有的斑点(图 4B)。
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| 图 4 2-DE-Western blot检测人HCC组织(A)及其癌旁组织(B)的差异蛋白 |
2.5 蛋白斑点的质谱检测与分析
通过比对分析HCC及其癌旁组织蛋白的2-DE-Western blot图像(图 4)与2-DE考染胶(图 5)后，挖出19个斑点进行脱色、脱水、酶切、肽段抽提、点靶及MALDI-TOF MS/MS质谱分析，获得肽指纹图谱。指纹图谱优势峰明显、间隔均匀、基线平稳(图 6)，并发现15个蛋白表达上调，4个蛋白表达下调(表 1)。文献检索分析显示，上调蛋白中的DnaJ同源B亚家族成员11(dnaJ homolog subfamily B member 11, DNAJB11)和下调蛋白中的蛋白酶体亚基α3 (proteasome subunit alpha type 3, PSMA3)在HCC相关抗原研究领域未见报道，由此提示，DNAJB11、PSMA3可能是HCC的相关抗原。2.6 HCC相关TAs的免疫组织化学检测验证组织芯片的免疫组织化学检测证实，15份HCC组织中有4份可见较强的DNAJB11抗原表达(图 7A)，这4份HCC组织对应的癌旁组织的DNAJB11抗原表达则较弱(图 7B)；15份HCC组织中有3份可见较弱的PSMA3抗原表达(图 7A)，而这3份HCC组织对应的癌旁组织的PSMA3抗原均高表达(图 8B)。由此提示，DNAJB11、PSMA3可能是HCC的相关抗原。
| 编号 | 登录号 | 蛋白名称 | 分数 | 匹配上的 多肽数目 |
变化趋势 |
| 1 | A0A0C4DGV7_HUMAN | Retinol-binding protein 4 | 138 | 13 | 上调 |
| 2 | APOA1_HUMAN | Apolipoprotein A-I | 296 | 25 | 上调 |
| 3 | J3KRH2_HUMAN | Haptoglobin (Fragment) | 143 | 5 | 上调 |
| 4 | J3KRH2_HUMAN | Haptoglobin (Fragment) | 74 | 5 | 上调 |
| 5 | A0A087WUQ6_HUMAN | Glutathione peroxidase | 87 | 9 | 上调 |
| 6 | CLPP_HUMAN | ATP-dependent Clp protease proteolytic subunit, mitochondrial | 109 | 8 | 上调 |
| 7 | ST2A1_HUMAN | Bile salt sulfotransferase | 129 | 15 | 上调 |
| 8 | ANXA4_HUMAN | Annexin A4 | 344 | 20 | 上调 |
| 9 | DJB11_HUMAN | DnaJ homolog subfamily B member 11 | 182 | 17 | 上调 |
| 10 | PDIA6_HUMAN | Protein disulfide-isomerase A6 | 207 | 10 | 上调 |
| 11 | LASP1_HUMAN | LIM and SH3 domain protein 1 | 74 | 12 | 上调 |
| 12 | NDRG1_HUMAN | Protein NDRG1 | 140 | 13 | 上调 |
| 13 | D6RF35_HUMAN | Vitamin D-binding protein | 319 | 23 | 上调 |
| 14 | ENOA_HUMAN | Alpha-enolase | 165 | 12 | 上调 |
| 15 | GDIR2_HUMAN | Rho GDP-dissociation inhibitor 2 | 164 | 11 | 上调 |
| 16 | PSA3_HUMAN | Proteasome subunit alpha type-3 | 177 | 16 | 下调 |
| 17 | ECHM_HUMAN | Enoyl-CoA hydratase, mitochondrial | 228 | 14 | 下调 |
| 18 | PRDX6_HUMAN | Peroxiredoxin-6 | 228 | 15 | 下调 |
| 19 | CAZA2_HUMAN | F-actin-capping protein subunit alpha-2 | 141 | 10 | 下调 |
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| 图 5 人HCC组织(A)及其癌旁组织(B)蛋白的双向电泳考染胶结果比较 |
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| 图 6 人肝癌组织阳性蛋白斑点的肽质量指纹图 |
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| 图 7 免疫组化染色观察人HCC (A)及其癌旁组织(B)的相关抗原DnaJB11 (S-P) |
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| 图 8 免疫组织化学染色观察人HCC (A)及其癌旁组织(B)的相关抗原PSMA3 (S-P) |
2.7 HCC相关TAs的Western blot验证
Western blot检测结果证实，15份HCC组织中有4份(2、4、6、8)在相对分子质量4.0×104处可见较强的DNAJB11抗原染色带，这4份HCC组织对应的癌旁组织(1、3、5、7)在相对分子质量4.0×104处的DNAJB11抗原染色带则较弱(图 9)；15份HCC组织中有3份(2、4、30)在相对分子质量2.7×104处可见较弱的PSMA3抗原染色带，而这3份HCC组织对应的癌旁组织(1、3、29)在相对分子质量2.7×104处出现的PSMA3抗原染色带则均较强(图 9)。由此提示，DNAJB11、PSMA3可能是HCC的相关抗原。
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| 图 9 Western blot检测HCC相关抗原DNAJB11、PSMA3的表达 |
3 讨论
运用针对肿瘤细胞反应的细胞毒T淋巴细胞所鉴定出的人与小鼠的肿瘤抗原，证实了肿瘤特异性抗原(tumor specific antigens TSAs)的存在。由于研究手段的不断发展与创新，所发现的TSAs不断增加，有些已在临床研究中展示了其良好的疗效。因此，在肿瘤组织、细胞中，种类繁多、特性各异的TSAs吸引着人们不断地探索、挖掘[7]，以期能找到特异性更好、功能更强的TSAs (新TSAs)用于临床，达根除肿瘤之目的。
蛋白质组学是横跨基因组和临床应用鸿沟的桥梁，可直接从蛋白的整体水平，动态定量观测肿瘤的发生、发展过程中其蛋白的变化情况，这些变化可能发生在蛋白表达水平、表达位置、组成成分或/和DNA翻译后的修饰上。近些年来，随着生物技术，尤其是蛋白质组学技术的发展，使得肿瘤新TSAs的筛选与鉴定不断迈上新台阶，为肿瘤的治疗提供了新的手段。因此，探寻有利于肿瘤诊断、治疗的新TSAs已成为目前的研究热点之一。
我们通过血清蛋白质组学技术探检HCC的新TSAs, 先用双向电泳分离HCC及其癌旁组织蛋白，再用Western blot将自体血清中的抗体与HCC及其癌旁组织抗原分子杂交，结果显示，HCC及其癌旁组织蛋白表达差异斑点共90个。采用二级质谱技术对其中19个蛋白斑点分析鉴定，获得DnaJB11与PSMA3抗原分子，即HCC患者的血清中存在抗DnaJB11与抗PSMA3的抗体，提示DnaJB11与PSMA3可能是HCC的新TSAs。
DnaJB11属于Hsp70家族BiP成员，是丰富的可溶性内质网驻留的分子伴侣蛋白。分子伴侣有利于新合成蛋白的折叠，受损蛋白的复性，蛋白在胞内的运输，以及错误折叠蛋白到降解系统的交付[8]。与大多数ER驻留的分子伴侣不同，DnaJB11缺乏C末端内质网滞留信号序列(KDEL)，在其正常的驻留环境外发挥蛋白平衡调控作用[9]，能在胞外识别蛋白的聚集并为该聚集保驾护航，能激活BiP的ATP酶活性以增加BiP与底物蛋白的亲和性，调控BiP的底物蛋白向BiP传递[10]。另有研究显示，DnaJB11还参与氧化应激介导的炎症反应[11]，在促进或维持一个被称作K1的病毒跨膜蛋白的抗凋亡功能中有着极其重要的作用[12]，在口腔鳞状细胞癌中的表达明显上调[13]。
蛋白酶体在所有真核细胞的蛋白降解中起着重要作用[14]。蛋白酶体26S是机体内负责蛋白降解的分子机器，由19S调节颗粒与20S核心颗粒构成。前者识别具有泛素链标签的底物蛋白，并对其予以去折叠，最后将去折叠的底物蛋白送至后者中降解。蛋白酶体亚基α3(PSMA3)是20S核心颗粒的重要成分，可在一定程度上增加抑癌基因Bim的表达而诱导HEK293亚细胞的凋亡，还与肿瘤高表达的PAI-1、AGR2等基因密切相关[15-16]。
本实验采用双向凝胶电泳、Western blot、质谱鉴定等蛋白质组学技术检测到DnaJB11、PSMA3在HCC组织及其癌旁组织中的明显差异表达。采用免疫组织化学与Western blot检测结果显示，与对照比较，DNAJB11在HCC组织中明显高表达，PSMA3在HCC组织的中表达显著降低。这提示DnaJB11、PSMA3可能是HCC的相关抗原。进一步的研究将探讨DnaJB11、PSMA3在HCC早期诊断与治疗中的作用及其机制。
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