非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)已经成为全球的主要公共卫生问题之一，对人类健康的威胁非常大，且迄今尚未发现防治NAFLD的有效措施[1-3]。有研究表明，膳食中不同脂肪酸构成与NAFLD发生、发展相关[4-5]，甚至有学者提出n-3多不饱和脂肪酸(n-3 poly-unsaturated fatty acids，n-3 PUFA)，如鱼油可能成为治疗NAFLD的有效药物[6]。我们进行的NAFLD病例对照研究发现饱和脂肪酸(saturated fatty acid，SFA)，如猪油、黄油是重庆居民发生NAFLD的危险因素，而n-6 PUFA(如玉米油、豆油)是保护因素[7]。尽管病例对照研究没有发现重庆市居民血浆n-3 PUFA水平与NAFLD患病率有关，鱼油的NAFLD人群干预研究的结果也不一致[8-9]，但鱼油干预对重庆NAFLD患者是有益的[10]。固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element-binding proteins, SREBPs)是调控与脂质代谢相关基因表达的关键性核转录因子，其功能异常对NAFLD有显著影响，因此，SREBP-1c可能成为治疗NAFLD的靶点[11]。我们在体外细胞实验发现不同的膳食脂肪酸可通过调节SREBP-1c的表达而影响肝细胞的脂肪蓄积[12]。本实验通过建立大鼠体内NAFLD模型，研究不同脂肪酸对大鼠NAFLD发生、发展的影响及其与SREBP-1c的关系，为NAFLD的预防和治疗提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 主要试剂胆固醇(规格BR)购自上海蓝季科技发展有限公司；猪油购自重庆福娃冻产品经营部；梭伦橄榄油和金龙鱼玉米油(不含植物甾醇或含量不高)购自大型超市；鱼油(EPA≥10%、DHA≥50%)购自山东荣成百合生物技术有限公司；总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)检测试剂盒为中生北控生物科技股份有限公司产品；TRIzol试剂购自美国英杰生命技术有限公司(Invitrogen)；SYBR Green实时定量RT-PCR试剂盒购自重庆波尔生物科技有限公司；多克隆兔抗脂肪酸合成酶(FAS)抗体(BS-1498R)和SREBP-1c抗体(BS-1402R)购自北京博奥森生物技术有限公司；RIPA裂解缓冲液购自碧云天生物技术研究所。
1.2 动物模型及分组采用第三军医大学实验动物中心10周龄清洁级Sprague-Dawley雄性大鼠100只，体质量175~230 g，适应性喂养3 d后，按随机数字表法分为5组，即对照组、NAFLD模型组、单不饱和脂肪酸组(mono-unsaturated fatty acid, MUFA)、n-6多不饱和脂肪酸组(n-6 poly-unsaturated fatty acids，n-6 PUFA)和4 ∶1 n-6/n-3 PUFA组，每组20只。对照组用基础饲料喂养，其余各组饲料中加1%胆固醇和10%不同油脂：NAFLD模型组饲料中加1%胆固醇和10%猪油，MUFA组饲料中加1%胆固醇和10%橄榄油，n-6 PUFA组饲料中加1%胆固醇和10%玉米油，4 ∶1 n-6/n-3 PUFA组饲料中加1%胆固醇、8%玉米油和2%鱼油。饲料配方参照韦娜等[13]方法，各组饲料的脂肪酸经一步法甲酯化后用高效气相色谱仪分析猪油、橄榄油、玉米油和鱼油脂肪酸含量，测定脂肪酸构成比，按比例调配饲料，保证各组饲料除膳食脂肪酸构成不同外，其他营养素含量和组成均相同，且能量供给一致(19.5 kJ/g，表 1)。饲料每月配1次，真空包装避光保存，实验期间每组大鼠自由饮水和进食饲料，每周称量大鼠体质量。分别于第8、16周的每组大鼠禁食过夜，活杀10只，取肝脏和血液备用。
| 组别 | 脂肪酸构成百分比(%) | n-6/n-3 | |||
| ΣSFA | ΣMUFA | Σn-6 PUFA | Σn-3 PUFA | ||
| 对照组 | 31.76 | 29.34 | 35.52 | 3.38 | |
| NAFLD模型组 | 43.54 | 41.83 | 13.68 | 0.95 | |
| MUFA组 | 16.22 | 76.56 | 6.25 | 0.97 | |
| n-6 PUFA组 | 11.08 | 26.84 | 61.06 | 0.92 | 66∶1 |
| 4∶1 n-6/n-3 PUFA组 | 9.53 | 26.45 | 50.64 | 13.38 | 4∶1 |
1.3 HE染色
肝脏组织经4%的多聚甲醛液固定后，石蜡切片，常规HE染色，在光学显微镜下用NAS评分对病理组织进行分析[14]：脂肪变性：＜5%为0级，5%~33%为1级，＞33%~66%为2级，＞66%为3级；小叶内炎症：无为0级，＜2个/200倍视野为1级，2~4个/200倍视野为2级，＞4个/200倍视野为3级；肝细胞气球样变：无计0分, 少数计1分, 明显气球样变计2分；间质纤维化：无为0级, 窦周或汇管区周纤维化为1级, 窦周和汇管区周围纤维化为2级, 桥接纤维化为3级, 硬化为4级。
1.4 肝脏TC和TG含量检测按试剂盒说明书方法检测肝脏TC和TG的含量。
1.5 血脂检测采用自动分析仪分析(日本奥林巴斯 AU5400) 血清TC和TG的含量。
1.6 实时定量PCR检测各组大鼠肝脏组织SREBP-1c和FAS mRNA的表达取各组大鼠肝脏组织100 mg，使用TRIzol试剂提取总RNA，用分光光度计定量后，将mRNA反转录为cDNA后，再以cDNA为模板进行PCR扩增。目的基因的引物和内参照GAPDH和β-actin引物设计根据其核苷酸序列，采用Primer Premier 5.0软件设计。引物序列：GAPDH上游5′-TGTGAACGGATTTGGCCGTA-3′，下游5′-GATGGTGATGGGTTTCCCGT-3′，311 bp；β-actin上游5′-CCACCATGTACCCAGGCATT-3′，下游5′-CGGACTCATCGTACTCCTGC-3′，200 bp；FAS上游5′-GATGAAGAGGGACCATAAAGA-3′，下游5′-GAACTGGCGTCAATGTTGTA-3′，367 bp；SREBP-1c上游5′-GT-ACAGAAAGTTGCAGGGGAAG-3′，下游 5′-ACATAG-CACCAACATGGGATTC-3′，217 bp。反应体系25 μL进行PCR扩增：94 ℃预变性90 s，94 ℃变性30 s，60 ℃ 退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35个循环，72 ℃再延伸5 min。反应结束后，各取5 μL PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，Bio-Rad成像分析仪扫描各条带，观察并分析。定量PCR的方法根据MIQE准则执行[15]。
1.7 Western blot检测各组大鼠肝脏组织SREBP-1c和FAS蛋白表达按照100 g组织加1 mL RIPA裂解液的比例加入适量裂解液裂解并提取肝脏组织总蛋白。用Bradford方法定量蛋白浓度后，将100 μg蛋白加入5×的SDS蛋白上样缓冲液中，沸水浴加热3~5 min，冷却，上样，转膜，室温封闭于5%脱脂奶粉中2 h，在1 ∶1 000稀释的一抗(多克隆抗体特异性磷酸化的FAS抗体或SREBP-1抗体)中4 ℃孵育过夜，洗膜3次，每次5 min，加入相应的二抗在侧摆摇床上缓慢摇动室温孵育1 h，洗膜3次，每次5 min。ECL化学发光法显色。扫描印迹灰度值进行分析。
1.8 统计学分析采用SPSS 18.0统计软件，各样本正态分布且方差齐性，各组数据间的比较采用单因素方差分析，计量资料以x ±s表示，P＜0.05表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 不同膳食脂肪酸不同时间饲养对大鼠体质量的影响不同膳食脂肪酸饲养8周或16周，NAFLD模型组大鼠体质量显著高于对照组和其他膳食脂肪酸组(P＜0.05) ，而对照组、MUFA组、n-6 PUFA组、4 ∶1 n-6/n-3 PUFA组大鼠体质量增长则差异无统计学意义(P>0.05，表 2)。
| 组别 | 初始 | 第8周 | 第16周 |
| 对照组 | 221.1±12.8 | 232.1±8.3b | 267.8±24.1b |
| NAFLD模型组 | 219.2±11.8 | 319.8±37.6a | 356.1±21.0a |
| MUFA组 | 214.2±16.9 | 238.3±16.0b | 269.7±31.0b |
| n-6 PUFA组 | 211.5±14.4 | 240.0±15.2b | 266.3±23.0b |
| 4∶1 n-6/n-3 PUFA组 | 211.8±17.2 | 237.0±6.1b | 259.4±12.5b |
| a: P＜0.05, 与对照组比较；b:P＜0.05, 与NAFLD模型组比较 | |||
2.2 不同膳食脂肪酸对大鼠脂代谢的影响
与对照组比较，高脂膳食各组大鼠血清和肝脏中TC含量显著增加(P＜0.05) ，模型组大鼠血清和肝脏中TG含量显著增加(P＜0.05) ；与模型组比较，富含PUFA各组大鼠血清中TG含量以及肝脏中TC和TG含量显著降低(P＜0.05，表 3)。
| 组别 | 血清TC(mmol/L) | 血清TG (mmol/L) | 肝脏TC(μmol/g) | 肝脏TG (μmol/g) | ||||
| 8周 | 16周 | 8周 | 16周 | 8周 | 16周 | 8周 | 16周 | |
| 对照组 | 1.46±0.33 | 1.59±0.90 | 0.51±0.20 | 0.56±0.15 | 4.34±0.52 | 4.45±0.46 | 3.92±1.04 | 4.02±1.54 |
| NAFLD模型组 | 2.39±0.31a | 2.51±0.77 a | 0.87±0.22a | 0.92±0.44a | 7.86±1.35a | 8.56±1.83a | 8.94±0.89a | 9.14±1.29a |
| MUFA组 | 6.13±2.71ab | 6.40±4.43 a | 0.46±0.10b | 0.52±0.16b | 7.10±1.16a | 7.60±1.42a | 8.21±1.32a | 8.75±1.22a |
| n-6 PUFA组 | 2.54±0.47a | 3.18±1.67 a | 0.57±0.20b | 0.62±0.21b | 6.66±1.05ab | 6.74±0.82b | 4.67±0.72b | 4.82±0.94b |
| 4∶1 n-6/n-3 PUFA组 | 2.71±0.67a | 2.94±1.20ab | 0.40±0.07b | 0.51±0.10b | 6.50±1.15ab | 6.63±1.05ab | 4.19±0.57b | 4.22±1.26b |
| a: P＜0.05, 与对照组比较；b:P＜0.05, 与NAFLD模型组比较 | ||||||||
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| 图 1 不同膳食脂肪酸对各组大鼠肝脏组织的病理变化 (HE) |
2.3 不同膳食脂肪酸不同时间饲养对大鼠NAFLD发生的影响
基础饲料加1%胆固醇加10%猪油喂养的NAFLD模型组大鼠在饲养8周后，肝脏出现了大量的脂肪沉积，部分小叶内出现炎性浸润和肝细胞气球样变，饲养16周后情况更见明显。与模型组比较，其余高脂各组肝脏脂肪变性程度都较轻，尤其是4 ∶1 n-6/n-3 PUFA组与对照组接近(图 1)。模型组的NAS量化评分显著高于其他组(P＜0.05) ，16周后4 ∶1 n-6/n-3 PUFA组的NAS量化评分显著低于其他组(P＜0.05，图 2)。
2.4 不同膳食脂肪酸对高脂膳食大鼠肝脏组织SREBP-1c与FAS蛋白表达的影响与对照组比较，NAFLD模型组大鼠肝脏组织SREBP-1c与FAS蛋白表达显著上调(P＜0.05) ；与NAFLD模型组比较，4 ∶1 n-6/n-3 PUFA组SREBP-1c蛋白表达均显著下调(P＜0.05) ，FAS蛋白表达相应下降(图 3)。
2.5 不同膳食脂肪酸对高脂膳食大鼠肝脏组织SREBP-1c与FAS mRNA表达的影响与对照组比较，NAFLD模型组大鼠肝脏组织 SREBP-1c与FAS mRNA表达显著增加(P＜0.05) ，SREBP-1c与FAS mRNA的变化趋势和蛋白表达水平的变化趋势一致；与NAFLD模型组比较，MUFA组、n-6 PUFA组、4 ∶1 n-6/n-3 PUFA组基因表达显著下调(P＜0.05，图 4)。
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| 1：对照组;2：NAFLD模型组; 3：MUFA组; 4：n-6 PUFA组; 5：4 ∶1 n-6/n-3 PUFA组 图 2 不同膳食脂肪酸对各组大鼠肝脏组织NAS量化评分结果 |
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| 1：对照组;2：NAFLD模型组; 3：MUFA组;4：n-6 PUFA组; 5：4 ∶1 n-6/n-3 PUFA组 a:P＜0.05, 与对照组比较;b:P＜0.05, 与NAFLD模型组比较 A:Western blot检测结果；B、C:分别为第8、16周SREBP-1c与FAS蛋白表达半定量分析 图 3 Western blot检测不同膳食脂肪酸对各组大鼠肝脏组织SREBP-1c与FAS蛋白表达的影响 |
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| 1：对照组;2：NAFLD模型组; 3：MUFA组;4：n-6 PUFA组; 5：4 ∶1 n-6/n-3 PUFA组 a:P＜0.05, 与对照组比较;b: P＜0.05, 与NAFLD模型组比较 图 4 实时定量PCR检测不同膳食脂肪酸饲养第8(A)、16周(B) 大鼠肝脏组织SREBP-1c、FAS mRNA表达 |
3 讨论
非酒精性脂肪性肝是一种无过量饮酒史，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变性为主要特征的临床病理综合征。NAFLD的发生、发展涉及到遗传、环境和生活方式等多种因素，与肥胖、高脂血症、胰岛素抵抗、糖尿病等有关，被认为是代谢综合征的组成部分。近年来，随着人们生活水平的提高、生活方式的改变，我国的NAFLD发病率明显上升且呈年轻化趋势，了解关于NAFLD发病机制的最新研究进展，对遏制脂肪肝的发展趋势有着十分重要的意义。近年来对于NAFLD的发病机制的研究已取得了一定进展，但仍未完全阐明。膳食因素中的能量摄入过多、脂肪摄入过多、膳食脂肪酸不平衡(尤其是饱和脂肪酸较多而n-3 PUFA较少)等是导致脂肪肝的主要危险因素[4-5, 16-17]。Bjerregaard等[18]也证实，多食鱼类的人群脂肪组织EPA和DHA含量增多，表明膳食脂肪酸成分可影响脂肪组织的脂肪酸组成。流行病学调查表明，n-3 PUFA的摄入量与NAFLD的患病率呈负相关[5]，NAFLD患者血中和肝组织中PUFA含量降低，n-6/n-3 PUFA的比值升高[19]。本实验通过建立大鼠体内NAFLD模型，研究不同脂肪酸对大鼠NAFLD发生、发展的影响及其与SREBP-1c的关系，发现在高脂膳食情况下适当增加膳食PUFA尤其是n-3 PUFA的摄入量对NAFLD的防治有积极意义，与Barrios-Ramos等[20]报道一致。
肝脏组织脂肪酸组成的改变会影响脂代谢基因的表达，进而调控NAFLD的发生、发展[4]。脂肪酸影响基因表达的主要调控途径是固醇调节元件结合蛋白，即SREBP-1c，它是肝脏脂质代谢的关键调控者，几乎参与所有肝脏脂肪酸和甘油三酯合成基因的转录活化。膳食脂肪酸摄入过多或脂肪酸不平衡，导致血浆中饱和脂肪酸升高或n-6/n-3多不饱和脂肪酸比值升高，会激活肝脏的SREBP-1c，促进脂肪酸和甘油三酯合成基因的表达，抑制微粒体甘油三酯转移蛋白(MTTP)的表达[14]，从而导致肝脏甘油三酯合成增加，流出减少，使肝脏脂肪蓄积增多。结合本实验，我们发现SFA显著增加SREBP-1c的表达，而MUFA组、n-6 PUFA组和4 ∶1 n-6/n-3 PUFA组SREBP-1c蛋白表达均显著下调，4 ∶1 n-6/n-3 PUFA组SREBP-1c的表达水平最低，可能是因为适量的n-3 PUFA能下调SREBP-1c的表达与活性。FAS作为肝脏脂肪酸合成的关键限速酶，它受SREBP-1c的调节，FAS的表达与SREBP-1c的水平是一致的。本研究结果显示，SFA显著增加FAS基因的表达，MUFA、n-6 PUFA以及适当 比例n-6和n-3 PUFA混合油脂能显著抑制FAS 表达，结合HE染色结果和NAS量化评分，说明适当增加n-3 PUFA可能通过下调SREBP-1c、FAS的表达而对NAFLD的防治是有益的，与文献[20-21]报道的结果一致。
本研究证实了SREBP-1c在膳食脂肪酸对NAFLD的影响中发挥重要作用，不同膳食脂肪酸通过调节SREBP-1c的表达和转录活性而影响大鼠NAFLD的发生、发展。该研究虽然仅仅是动物实验的结果，但结合课题组前期的体外细胞实验[12]、病例对照研究[7]以及NAFLD 患者鱼油干预研究[10]，其结果均表明在高脂膳食情况下，适当增加膳食中n-3 PUFA而减少膳食中饱和脂肪酸会降低NAFLD的发病风险。这为指导人们合理选用膳食脂肪酸，防治NAFLD提供了实验依据。
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