2. 400038 重庆,第三军医大学西南医院:中心实验室 ;
3. 神经外科
2. Medical Research Center ;
3. Department of Neurosurgery, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400038, China
宫内窘迫是指胎儿在子宫内有缺血缺氧,并危及胎儿生命健康的综合现象,也是导致足月儿发生急性肺损伤的危险因素之一[1]。儿童急性肺损伤的病死率与成人相近,可达50%~60%[2],其发生机制可能与患儿肺组织发育不成熟以及肺组织缺血缺氧有关。目前研究证实[3],当肺组织缺血缺氧时,细胞膜上磷脂酶A2激活所产生的花生四烯酸代谢产物以及吞噬细胞所产生的肿瘤坏死因子、血小板激活因子等炎性介质会相互作用而呈现逐级放大效应,导致体内发生广泛的炎症反应,进而引起了肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤和肺泡表面活性物质失活,诱发ALI。莨菪烷类抗胆碱药物是治疗ALI的经典药物,盐酸戊乙奎醚(penehyclidine hydrochloride, PHCD),作为一种新型莨菪烷类药物,对M胆碱能受体的亚型具有选择性,能够降低毛细血管壁的通透性,改善微循环,减少溶酶体释放,保护细胞[4]。既往对PHCD的研究多集中于成人ALI,而其对宫内窘迫致新生儿ALI的影响未见报道。
在临床上,若宫内窘迫发生在围产期,常需紧急行剖宫产术抢救胎儿。刘芳[5]研究证实在胎儿宫内窘迫时,及时行剖宫产术是降低新生儿发生窒息的最有效措施之一,可保证母婴安全, 降低围产儿死亡率。因此,本研究以宫内窘迫胎鼠模型为研究对象,旨在探讨PHCD能否对新生儿ALI发挥保护性作用及其可能的分子机制,为PHCD临床应用于新生儿ALI提供一定的理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂盐酸戊乙奎醚购于成都力思特制药福分有限公司(批号:141108),TNF-α ELISA测定试剂盒购自美国RD公司,IL-6 ELISA测定试剂盒购自武汉博士德生物公司。NF-κB引物由上海TaKaRa公司合成(上游引物:5′-ACGCGGTTACGGGAGATGTGA-3′,下游引物:5′-GGCCAAGTGCAAAGGTGTCTGAT-3′)。逆转录试剂盒、TRIzol Reagent 均是上海TOYOBO公司产品。NF-κB p65鼠单克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品(批号:sc-372)。二抗购自武汉博士得生物公司。蛋白提取试剂盒为北京康为世纪生物科技有限公司产品,BCA蛋白浓度测定试剂盒购自江苏碧云天公司。
1.1.2 实验动物孕20 d SD大鼠,足月、体质量4.52~4.81 g的胎鼠80只(第三军医大学实验动物中心)。
1.2 方法 1.2.1 胎鼠分组及处理参阅文献[6]的方法制备宫内窘迫模型,将孕20 d的SD大鼠用3.5%水合氯醛(1 mL/100 g)腹腔注射麻醉后,仰卧位固定上门齿及四肢远端,剃去腹部毛发暴露术野,碘伏、75%酒精依次消毒,取下腹正中切口,打开腹腔,于下腹部两侧可见串球状胎鼠被包裹于子宫内,用微动脉夹钳夹孕鼠通向子宫和两侧卵巢的动静脉20 min,钳夹过程中不断更换覆盖于子宫上的温生理盐水纱布,维持局部温度在37 ℃左右。然后松开微动脉夹,恢复血供40 min后,剖宫取出胎鼠并断头处死后提取肺组织,于-80 ℃保存。空白对照组仅对孕鼠行开腹关腹手术,余不对胎鼠做任何操作;PHCD组术前30 min给予孕鼠以2 mg/kg浓度肌注PHCD;ALI组予建模处理;ALI+PHCD组在建模前30 min予孕鼠肌注相应剂量PHCD。
1.2.2 血气分析检测参照夏水秀等[7]的方法取出宫内胎鼠,断头后收集外周血,并使用Nova 血气分析仪测定胎鼠血浆中的pH、氧分压[p(O2)]、二氧化碳分压[p(CO2)]、乳酸(Lac)等指标,并记录。
1.2.3 胎鼠肺湿/干质量比值(W/D)测定各组随机取8只胎鼠,断头处死后提取肺标本,称取湿质量(W),烘干后的肺标本称取干质量(D),计算W/D值。
1.2.4 HE染色观察肺组织形态学变化各组随机取4只胎鼠,提取肺标本,操作方法同1.2.3,置于4%多聚甲醛溶液中浸泡固定,经石蜡包埋,冠状切片(厚约5 μm)后,常规HE染色,BX5/TF显微镜下(×100,Olympus公司,日本)观察肺组织形态学变化情况,并拍照记录。
1.2.5 ELISA检测肺组织TNF-α及IL-6含量每组随机取8只胎鼠断头取肺,将肺组织标本分装于冻存管内-80 ℃低温冰箱保存备用。取部分上述保存的肺组织经研磨制成匀浆,4℃、12 000 r/min离心,取上清液采用ELISA法进行测定TNF-α及IL-6含量,按照ELISA试剂盒说明书严格操作,利用全波长酶标仪于450 nm波长处测定光密度值,并参照标准曲线,计算出胎鼠肺组织中TNF-α、IL-6含量。
1.2.6 q-PCR检测肺组织NF-κB mRNA的表达取部分保存的肺组织经研磨制成匀浆,按照RNA提取试剂盒说明书提取总RNA,按照Rever Tre Ace-a-逆转录试剂盒说明书逆转录合成cDNA。根据GenBank上所查RNA序列,采用Primer Premier 5.0软件设计引物,NF-κB上游引物序列:5′-ACGCGGTTACGGGAG-ATGTGA-3′NF-κB下游引物序列:5′-GGCCAAGTGCAAAGGTGTCTGAT-3′,扩增片段长212 bp。采用ABI 7500型荧光定量PCR仪测定Ct值,反应条件:95 ℃预变性30 s,95 ℃变性5 s,60 ℃退火延伸34 s,共45个循环。采用2-△△Ct法计算NF-κB p65 mRNA的相对表达量。
1.2.7 Western blot检测肺组织NF-κB p65 蛋白的表达取部分保存的肺组织总蛋白时,将标本解冻后,反复研磨制成肺组织匀浆,加入RIPA裂解液等蛋白抽提试剂,冰浴提取肺组织总蛋白,4 ℃离心后,取上清液并以BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度。按照配胶试剂盒说明配制SDS-PAGE凝胶,以50 μg蛋白上样量进行电泳分离,转膜,封闭,TBST洗膜后加入NF-κB p65鼠单克隆抗体(1∶2 000稀释)4 ℃下孵育过夜,回收一抗,加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2 000稀释)室温孵育2 h,TBST洗膜30 min后,显影,曝光。凝胶图像分析系统扫描成像,Quantity One 4.3进行分析,以NF-κB p65与β-actin蛋白条带灰度的比值表示NF-κB p65蛋白表达相对水平。
1.3 统计学分析采用SPSS 17.0统计软件,计量资料以x±s表示,组间比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 PHCD对胎鼠外周血血气分析的影响与空白对照组比较,ALI组p(CO2)、Lac含量明显增高,pH、p(O2)降低(P<0.05);与ALI组比较,ALI+PHCD组pH、p(O2)增高,p(CO2)、Lac含量降低(P<0.05,表 1)。
组别 | pH值 | p(O2)(mmHg) | p(CO2)(mmHg) | Lac(mmol/L) |
空白对照组 | 7.32±0.01 | 38.45±1.72 | 55.48±0.91 | 9.87±0. 21 |
PHCD组 | 7.31±0.08 | 37.23±0.98 | 54.27±0.88 | 9.74±0.18 |
ALI组 | 7.04±0.04ab | 19.72±1.05ab | 66.31±1.41ab | 20.18±1.36ab |
ALI+PHCD组 | 7.21±0.35abc | 25.38±1.35abc | 60.28±1.02abc | 15.78±0.75abc |
a: P<0.05, 与空白对照组比较; b: P<0.05, 与PHCD组比较; c: P<0.05, 与ALI组比较 |
2.2 PHCD减轻胎鼠肺组织的炎性反应
应用病理组织染色的方法研究PHCD对胎鼠肺组织内炎症反应的影响。结果显示,空白对照组、PHCD组肺组织未见明显炎症病理改变;ALI组肺间质明显浑浊肿胀,肺泡间隔增宽,毛细血管扩张充血,大量炎细胞浸润,肺泡腔可见浆液渗出、出血;ALI+PHCD组较ALI组在肺间质水肿、毛细血管扩张充血和炎细胞浸润方面显著减轻(图 1)。
2.3 PHCD减少胎鼠肺组织TNF-α及IL-6的含量
ALI组和ALI+PHCD组TNF-α及IL-6含量明显高于空白对照组(P<0.05),ALI+PHCD组TNF-α及IL-6含量明显低于ALI组(P<0.05,表 2)。
组别 | TNF-α(pg/mL) | IL-6(pg/mL) | W/D | NF-κB |
空白对照组 | 21.10±0.28 | 5.24±0.05 | 3.52±0.23 | 1.01±0.03 |
PHCD组 | 23.43±0.08 | 4.06±0.08 | 3.68±0.17 | 1.03±0.01 |
ALI组 | 110.85±1.18ab | 24.39±0.19ab | 4.32±0.15ab | 6.37±0.29ab |
ALI+PHCD组 | 73.20±0.85abc | 16.09±0.05abc | 4.07±0.98abc | 3.54±0.13abc |
a: P<0.05, 与空白对照组比较; b: P<0.05, 与PHCD组比较; c: P<0.05, 与ALI组比较 |
2.4 PHCD下调胎鼠肺组织NF-κB mRNA表达及降低肺湿/干质量比值(W/D)
ALI组和ALI+PHCD组NF-κB mRNA表达、W/D值明显高于空白对照组(P<0.05),ALI+PHCD组NF-κB mRNA表达、W/D值明显低于ALI组(P<0.05,表 2)。
2.5 胎鼠肺组织内NF-κB p65蛋白的表达ALI组和ALI+PHCD组NF-κB p65蛋白表达明显高于空白对照组(P<0.05),ALI+PHCD组NF-κB p65蛋白表达明显低于ALI组(P<0.05,图 2)。
3 讨论
急性肺损伤是一组以肺内弥漫性炎症细胞浸润、肺血循环障碍、肺毛细血管通透性增加和低氧血症为特征的临床综合征,是新生儿临床常见的危重症,致死率高[8]。新生儿由于肺发育欠成熟,肺泡表面积约为成人的3%,对内源性细胞因子的变化敏感,一旦缺血缺氧更易发生ALI。目前,ALI发病的分子机制仍未明确,既往研究显示,炎症反应是ALI发生的重要环节之一[9]。肺表面活性物质(pulmonary surfactant,PS)功能异常,如合成不足、组成成分改变、活性降低,都会间接引发ALI。虽然PS改变不是引起ALI的始动病因,但PS减少和功能异常是导致肺损伤的一个重要因素,与炎症反应在ALI的发生和发展过程中相辅相成[10]。蔡栩栩等[11]亦研究证实新生儿ALI与肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤及肺泡表面活性物质失活有关。此外,基因遗传多态性也是当前ALI/ARDS发病机制环节中的一个关键因素[12]。
本研究参照Tanaka等[13]介绍的方法通过阻断足月孕鼠子宫血管,诱发短期胎盘缺血缺氧,建立宫内窘迫模型,引起胎鼠发生ALI。研究结果显示,与空白对照组相比,阻断足月孕鼠子宫血管后,胎鼠外周血p(CO2)、Lac含量明显增高,pH、p(O2)显著降低,提示胎鼠酸中毒。此外,我们还观察了胎鼠W/D值和肺组织病理学变化。结果显示,与空白对照组相比,ALI组肺组织W/D值显著增加,肺间质明显浑浊肿胀,肺泡间隔增宽,毛细血管扩张充血,大量炎细胞浸润,肺泡腔可见浆液渗出、出血,提示胎鼠ALI造模成功。
PHCD是临床常见的抗胆碱药,能选择性地作用于M1和M3受体,对M2受体几乎没有影响,相对分子质量较小,约为351.92,易透过胎盘屏障,分布于胎儿肺内[14]。既往有大量研究表明PHCD对大鼠急性肺损伤有保护作用,其作用机制与减少炎性介质的失控性释放有关[15-16]。但PHCD对胎鼠ALI的作用,目前未见报道。本研究参照姜丽华等[17]的研究结果并结合预试验,选择在建立宫内窘迫前30 min向孕鼠肌注2.0 mg/kg剂量PHCD。为排出PHCD本身对胎鼠的影响,实验设立了PHCD组,结果与空白对照组相比,胎鼠的各项测定指标均无明显差异,提示该剂量范围内PHCD本身并不引起ALI。与ALI组相比,ALI+PHCD组胎鼠酸中毒得到明显改善,胎鼠肺W/D值明显降低,炎症反应明显减轻。
NF-κB是Sen等从B淋巴细胞核提取物中发现的一种核蛋白因子[18],由p50和p65亚单位组成的异源二聚体是典型的NF-κB,也是其活性的主要形式[19]。当细胞处于静息状态时,NF-κB和IκB形成复合体,以无活性形式存在于细胞质中。既往研究显示,NF-κB为ALI发病进程中的主要炎症介质的轴心转录因子。ALI发生后,IκB激酶复合物活化,使IκB磷酸化而降解,使胞质中游离的NF-κB快速移至核内,结合在被诱导基因启动子序列上与之相同的κB位点,进而调控TNF-α、IL-6等免疫炎性基因的转录[20],而增加的细胞因子又可进一步活化NF-κB,造成持续或放大的炎症反应[21]。为进一步探讨PHCD对胎鼠ALI作用的分子机制,我们检测了各组NF-κB mRNA、蛋白表达及胎鼠肺组织炎症因子含量。研究发现,与空白对照组相比,ALI组胎鼠肺组织TNF-α、IL-6含量均增加,NF-κB mRNA、NF-κB p65蛋白表达水平升高,应用PHCD预处理后发现ALI组胎鼠肺组织TNF-α、IL-6含量均减少,NF-κB mRNA、NF-κB p65蛋白表达水平明显下降,肺部炎症反应减轻。这提示NF-κB及其介导的炎症反应在胎鼠ALI发病中具有重要作用,而PHCD则可通过抑制NF-κB表达及其介导的炎症反应改善胎鼠ALI,起到治疗和保护作用。
综上所述,PHCD预处理对胎鼠宫内窘迫导致ALI具有一定的保护作用,其相关机制与抑制NF-κB信号通路有关,为临床应用PHCD提供了可能的理论依据,拓展了其临床应用前景。接下来,可以从通过干预炎症刺激信号传导和基因表达这一手段来控制ALI/ARDS的进展[22],但目前主要还处在理论探索阶段,只有小部分试用于临床,其前景取决于相关领域更深入的研究以及临床的可操作性。
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