牙周炎是口腔常见病与多发病，是人类缺牙的主要原因，主要表现为牙龈出血、牙周溢脓、牙槽骨吸收和牙周袋形成，恢复丧失的牙周骨组织一直是临床上的重点与难点，牙周组织工程技术为治疗提供了新思路[1]。rDFCs(rat dental follicle stem cells，rDFCs)，是形成牙周组织的前体细胞[2]，CHA作为优良的植骨材料被广泛地应用于临床骨缺损病例中[3]，本实验拟观察rDFCs在CHA上的黏附增殖与成骨分化，初步探讨rDFCs与CHA应用于牙周组织工程的可行性，为后期rDFCs与CHA复合物应用于体内牙周骨组织再生提供实验基础和理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料PBS、DMEM/F12(Hyclone公司)、fetal bovine serum (FBS)、0.25%胰酶、双抗(Gibico公司)、Ⅰ型胶原酶、地塞米松、抗坏血酸、β-磷酸甘油(Sigma公司)、戊二醛、4%多聚甲醛、茜素红染液(索莱宝公司)、RT-PCR试剂盒(TaKaRa公司)、手术器械包。本实验所使用的CHA由天博固齿公司提供，以天然珊瑚为原料，经加工制成成品-珊瑚羟基磷灰石生物玻璃陶瓷(coralline hydroxyapatite ，CHA)。
成骨诱导培养基(DMEM/F12、1%双抗、10%FBS、 10 mmol/L地塞米松、50 mg/L抗坏血酸，100 nmol/L β磷酸甘油)，普通培养基(DMEM/F12、1%双抗、10%FBS)
1.2 方法 1.2.1 rDFCs的原代培养rDFCs的原代培养与分离纯化方法参照本课题组前期实验操作步骤[4]。取10只SD大鼠下颌牙囊组织，酶组织块消化法及梯度离心消化法获取纯化的rDFCs。细胞每2～3天换液，细胞融合度达80%左右时按1 ∶2传代，观察记录每代细胞形态。
1.2.2 rDFCs的成骨诱导茜素红染色取生长状态良好第3代rDFCs，弃去培养液，PBS清洗，0.25%胰酶消化，离心力150×g，离心3 min，重悬后接种于24孔板内，待细胞约80%贴壁时设普通培养基组，成骨诱导培养基组，每2～3天换液，连续培养21 d后进行茜素红染色，PBS清洗，4%多聚甲醛(200 μL/孔)室温固定30 min，PBS清洗后加入茜素红染色液，常温孵育20 min，移去染色液后显微镜下观察并记录实验结果。
1.2.3 rDFCs与CHA支架材料黏附实验取第3代rDFCs，普通培养基重悬细胞，调节细胞浓度至2×106 个/mL。CHA浸泡于普通培养基中2 h后，弃去培养基，吸取细胞悬液500 μL缓慢滴加于CHA，使细胞悬液充分进入CHA空隙内部，4 h后加足普通培养基，每天换液。分别取复合1~7 d的细胞支架复合物，吸走培养基，PBS清洗两遍，放入2%戊二醛中固定，梯 度酒精脱水，然后乙酸异戊酯置换酒精，CHA及rDFCs-CHA 复合物干燥后喷金，扫描电镜下观察细胞黏附情况。
1.2.4 CHA促进rDFCs成骨标志物表达实验取生长良好的第3代rDFCs，消化离心重悬，调节细胞浓度至2×106 个/mL。实验分组及处理如下，rDFCs组：rDFCs组取1 mL细胞悬液直接加入6孔板中，补足普通培养基；rDFCs成骨诱导组：取1 mL细胞悬液至于 6孔板中，2 h后细胞贴壁更换成骨诱导培养基；rDFCs-CHA 复合组：50 mg CHA提前浸泡于普通培养基中2 h，吸走CHA中培养基，吸取细胞悬液1 mL缓慢滴加于CHA表面，4 h后补足普通培养基。每2~3天换液1次。分别于第5、7、9天进行RT-PCR，检测成骨相关基因OPN、ALP、Osterix的表达情况，按TaKaLa试剂盒提取RNA，反转录及RT-PCR，引物序列如下：Beta-actin 上游：5′-CCCGCGAGTACAACCTTCTTG-3′，下游：5′-GTCATCCATGGCGAACTGGTG-3′；ALP 上游：5′-CC-TGCAGGATCGGAACGTCAATTA-3′，下游：5′-TGAGTTGGTAAGGCAGGGTCC-3′；OPN 上游：5′-CCAGCCAAGGACCAACTACA-3′，下游：5′-AGTGTTTGCTGTAATGCGCC-3′；osterix 上游：5′-GCCAGTAATCTTCGTGCCAG-3′，下游：5′-TAGTGAGCTTCTTCCTGGGGA-3′(Order-No.14529)。
1.3 统计学方法实验中所有数据采用SPSS 20.0软件分析，两组间比较用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 rDFC是原代培养及细胞形态观察组织块酶消化法消化大鼠牙囊组织，组织块在贴壁后细胞爬出，4~5 d铺满瓶底约80%，单层排列，形态存在多形性，主要以多角形、长梭形两种形态存在(图 1A)。原代细胞中见较多杂细胞，经梯度消化法传至第3代时，细胞基本已达到纯化(图 1B)。本课题组前期实验已对rDFCs进行了细胞鉴定[2]，免疫组化rDFCs波形蛋白表达阳性，角蛋白表达阴性，流式细胞术中CD31、CD146、Stro-1阳性，rDFCs来源于间充质干细胞，具有干细胞特性。
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| A：原代rDFCs；B：第3代；C：第3代rDFCs成骨诱导21 d后 图 1 倒置显微镜观察rDFCs原代和第3代rDFCs形态及rDFCs成骨诱导21 d后茜素红染色显色染成橘红色的钙结节(×40) |
2.2 rDFCs的成骨诱导茜素红染色
倒置显微镜下观察rDFCs成骨诱导培养21 d后茜素红染色结果，普通培养基组未见明显的钙盐沉积和钙结节形成，成骨诱导组可见散在的橘红色钙结节(图 1C)。
2.3 rDFCs与CHA黏附实验扫描电镜(SEM)下观察到CHA孔隙多且孔孔相通，空隙大小在100～600 μm(图 2A)，培养24 h时，rDFCs已于CHA表面形成牢固的黏附，细胞呈成长梭形、不规则形，并有伪足伸出(图 2B)，随着时间推移rDFCs逐渐增多并有向CHA空隙内部生长趋势，呈跨孔生长，4 d时细胞分泌的胞外基质相互接触，开始成片状黏附于CHA表面(图 2C)，7 d时，rDFCs及其分泌的胞外基质已完全覆盖CHA表面(图 2D)。
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| A：CHA三维多孔疏松结构(×50)；B：rDFCs定植于CHA表面2 d(×500)；C：rDFCs定植于CHA表面4 d时材料表面已有细胞外基质覆盖(×200)；D：rDFCs在CHA表面生长7 d 后分泌的细胞外基质覆盖在材料大部分表面(×500) 图 2 扫描电镜观察CHA及rDFCs定植于CHA表面后CHA表面的变化 |
2.4 CHA促进rDFCs成骨标志物表达实验
在第5、7、9 d对3个组应用RT-PCR对ALP、OPN、Osterix基因分析。在第5、7天时，rDFCs成骨诱导组和rDFCs-CHA组Osterix基因表达差异无统计学意义(P>0.05)，表明CHA促rDFCs表达Osterix 基因表达与成骨诱导液诱导rDFCs基因表达量一致。其余各时间点及各组间比较中，rDFCs-CHA组成骨相关基因表达明显高于rDFCs组(P<0.01)，但小于成骨诱导组，差异有统计学意义(P<0.01)。rDFCs-CHA组与rDFCs组相比，Osterix基因表达：5 d时rDFCs-CHA组是rDFCs组的36.9倍，7 d时是267倍，9 d时是94.9倍，OPN基因表达：5 d时rDFCs- CHA组是rDFCs组的6.2倍，7 d时是24.7倍，9 d时是29.2倍；ALP基因表达：5 d时rDFCs-CHA组是rDFCs组的3.1倍，7 d时是1.3倍，9d时是2.9倍(图 3)。
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| A：ALP；B：OPN；C：Osterix a:P<0.01,与rDFCs组比较；b：P<0.01,与rDFCs-CHA组比较 图 3 RT-PCR定量检测CHA促进rDFCs表达ALP、OPN、Osterix基因 |
3 讨论
临床病例中牙周病的治疗方法有龈上洁治、龈下刮治、药物缓释治疗、物理治疗、牙周手术治疗等，虽然能有效清除牙菌斑和牙结石，控制牙周炎症，但并不能有效恢复丧失的牙周骨组织，故恢复牙周骨缺损成为牙周炎治疗的热点与难点，也是牙周组织再生的关键。为解决这一难题，许多学者开辟了新的方法，组织工程技术被认为是牙周骨组织再生的有效方法[5-6]。种子细胞和支架材料是组织工程技术两个非常重要的因素[7-8]，现仍然处于研究阶段。本实验选择rDFCs作为种子细胞，CHA作为支架材料进行体外研究。本实验通过组织块酶消化法和梯度离心消化法从牙囊组织中分离纯化获取rDFCs，rDFCs是形成牙周组织的前体细胞，即可分化形成牙骨质，牙周膜和固有牙槽骨[2]。Wise[9]首次分离培养出大鼠牙囊细胞(rDFCs)，而后 学者研究发现rDFCs表达干细胞表面标志物，如Stro-1、Notch-1、nestin，鉴定得知rDFCs 来源于间充质干细胞[4]，具备干细胞特性[10]，有多向分化潜能，一定诱导条件下，能向成骨细胞分化[4]。文献[3]报道CHA可作为组织工程化骨良好的支架。多孔的CHA三维结构类似于骨组织，具有骨诱导作用，含钙、磷成分，在体内能游离到材料表面，机体吸收代谢后形成新的骨组织，已应用于组织工程研究[11-12]。本实验探讨了rDFCs 与CHA二者间生物相容性及CHA对rDFCs成骨向分化影响，为rDFCs与CHA体外形成组织工程化骨用于动物实验提供体外实验依据。
本研究发现在rDFCs植入CHA 7d后，SEM观察到rDFCs及其分泌的胞外基质已完全覆盖CHA表面。这说明rDFCs能稳定黏附伸展于CHA，并能在CHA表面及内部空隙内稳定生长增殖，证明rDFCs与CHA二者生物相容性良好。国内外研究认为CHA拥有良好的细胞相容性[13-15]，骨髓间充质干细胞(BMSCs)能在CHA表面及空隙侧壁黏附，能作为组织工程支架材料应用于动物实验，与本研究rDFCs与CHA的黏附增殖实验结果相似。这可能是因为CHA的多孔三维的特殊表面结构，因其骨诱导性从而有利于的细胞的黏附增殖[13-14]。
本研究也发现，在细胞培养5、7、9 d时，rDFCs-CHA组成骨相关基因ALP、OPN、Osterix表达明显高于rDFCs组(P<0.01)。ALP、OPN、Osterix三者为细胞向成骨细胞分化不同时期所表达的重要标志物，ALP为早中期成骨分化指标OPN和Osterix为中、晚期矿化组织的重要检测指标，表达量越高说明细胞矿化能力越强，向成骨方向分化能力越强。研究发现CHA具有促进BMSCs成骨向分化的作用[13]，严宁等[15]将成骨细胞与CHA共培养，发现CHA并不影响成骨细胞功能，且在共培养2、8 d时，其促进了成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)的表达，与本研究rDFCs与CHA体外共培养实验结果相似。CHA具有促进rDFCs的成骨向分化的作用，这可能基于它的特殊三维结构和与骨组织相似的化学成分，CHA来源于天然珊瑚，孔隙率30%~70%，孔径100~600 μm，排列规则，其多孔的三维结构与人松质骨骨小梁结构相似，能诱导新生骨组织长入孔内，为形成组织工程化骨起着良好的支架作用[16-17]，CHA主要成分为羟基磷灰石，占90%以上，所含钙、磷成分能游离到材料表面，为细胞成骨向分化提供必要的营养成分。本实验结果也表明CHA促进了rDFCs的成骨向分化，具有骨诱导作用。
综上所述，本研究表明rDFCs能良好黏附伸展于CHA表面，且稳定生长增殖，二者生物相容性好；CHA能促进rDFCs成骨相关基因ALP、OPN、Osterix的表达。CHA作为支架材料在体外能促进rDFCs向成骨细胞分化，表达成骨相关基因。本实验为下一步动物体内研究提供了理论基础。但是否在加入一种生长因子后CHA的促成骨作用更强尚需要进一步实验研究。CHA与rDFCs的复合物在体内是否具有成骨作用还需进一步研究。
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