内皮祖细胞(endothelial precusor cells,EPCs)是内皮细胞的前体细胞,可靶向归巢至损伤血管部位有效促进内皮修复。但EPCs数目和有效的定向迁移影响了EPCs靶向治疗临床应用,找到调节EPCs增殖、迁移的关键靶点对于调控EPCs有效修复血管至关重要。斯钙素1(stanniocalcin 1,STC) 一种糖蛋白激素,广泛存在于人富含血管的器官、组织中,最近的研究表明STC1能保护心肌细胞、内皮细胞对抗有害刺激,有效促进细胞增殖、迁移的作用[1]。STC1对EPCs的功能影响研究尚少。本实验拟观察STC1对EPCs增殖、迁移的影响,并研究STC1是否通过PI3K/Akt/eNOS信号通路起作用,以期为以提高EPCs功能为基础的细胞靶向治疗提供新依据。
1 材料与方法 1.1 主要试剂大鼠淋巴细胞分离液购于灏洋生物制品公司(中国),DMEM低糖培养基和胎牛血清购自Gibico公司(美国),胰酶购自HyClone公司(美国),rhSTC1购自Biovendor公司(英国),STC1抗体购自Santa Cruz公司(美国),siRNA STC1来源于上海吉玛制药技术有限公司(中国),Lipofectamine lipo2 000购自Invitrogen公司(美国),PI3K抑制剂LY294002和eNOS抑制剂L-NAME购自Sigma公司(美国),Akt、p-Akt(S) eNOS、p-eNOS(S) 体来源于Cell Signaling Technology公司(美国),Transwell细胞小室购自Millipore公司(美国)。
1.2 EPCs的分离培养雄性SD大鼠2只,体质量150 g左右,由新桥医院实验动物中心提供。脱臼法处死,无菌操作分离脾脏。超净工作台上,200目滤网放在玻璃皿上,再将脾脏置于滤网上。剪碎脾脏用4 ℃预冷的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗,至滤网上组织发白。15 mL离心管加4 mL大鼠淋巴细胞分离液,将滤过的液体轻轻吸入离心管中,滤液约8 mL,4 ℃ 2 000 r/min离心20 min。 取出离心管,轻轻吸出离心管中间白色薄膜层,此为单个核细胞。吸取的单个核细胞加入装有PBS的离心管中,1 500 r/min离心洗涤,重复2次。洗涤后,弃除PBS,管内加入含10%优质胎牛血清的DMEM低糖培养基,用吸管轻轻吹打混匀。接种至6、24孔板或者96孔板中,细胞置5%CO2、37 ℃、饱和湿度培养箱中培养,第2天换液后每3天换液。
1.3 EPCs荧光双染鉴定4~7 d后,培养的细胞与2.4 μg/mL DiI-ac-LDL避光孵育1 h。吸除孵育液,PBS 清洗3次,4%PFA 固定,吸除液体,PBS 清洗3次。10 μg/mL FITC-UEA-I 避光孵育 1 h。PBS 清洗 1 次。DiI-ac-LDL 和 FITC-UEA-I 双染阳性细胞为EPCs。
1.4 rhSTC1对EPCs增殖的影响取出培养了6 d的EPCs 96孔板,每组加入相应浓度的rhSTC1,未处理组为对照,放回培养箱培养。24 h后取出,每孔加入CCK-8检测试剂10 μL,将96孔板放回培养箱中孵育4 h后取出置于酶标仪中,波长450 nm 处测定光密度值[D(450)] 。
1.5 rhSTC1对EPCs迁移的影响24孔板中每个孔中加入加入500 μL含10%胎牛血清DMEM低糖培养基,待测孔加入rhSTC1,其稀释终浓度为20、50、100 μg/mL,未处理组为对照。将Tranwell小室放入24孔板中,胰酶消化重悬EPCs,每孔加入200 μL含2×105个细胞的无血清DMEM低糖培养基细胞悬液。盖好板子,37 ℃,饱和湿度,5%CO2培养箱培养16 h。PBS 漂洗 2 次,无水乙醇固定30 s,PBS 漂洗 1 次。棉签轻轻擦去上层未迁移细胞,结晶紫染色5 min,PBS漂洗3次。在200倍显微镜计数迁移细胞,随机选取5个视野。
1.6 siRNA 沉默STC1对EPCs增殖、迁移的影响siRNA STC1正义链:5′-GCUCAAUGUUUGCAGC-AUUTT-3′,反义链:5′-AAUGCUGCAAACAUUGAGCTT-3′,TT为3′端悬头。siRNA阴性对照为与STC1序列无同源性的对照,未处理组作对照。24孔板(或96孔板)用不含双抗(青霉素、链霉素)的10%优质胎牛血清和DMEM低糖培养基培养EPCs,培养至第5天,细胞密度60%~80%,准备待用。取20 pmol siRNA STC1或siRNA阴性对照(96孔板5 pmol)溶于50 μL无血清DMEM低糖培养基稀释配制成A液。1 μL (96孔板0.25 μL)lipo2 000加入 50 μL无血清DMEM 低糖培养基,混匀,室温放置5 min,配制为B液。A、B液混合,放置20 min。期间将待用细胞培养板内培养基换为无血清培养基,每孔400 μL。AB混合液加入对应孔内37 ℃、饱和湿度,5%CO2培养箱孵育。4~6 h后吸弃细胞培养板内培养液,换为含10%优质胎牛血清的DMEM低糖培养基。放入孵箱继续培养。 转染48 h后,CCK-8检测增殖能力,Transwell检测迁移能力。
1.7 STC1对EPCs 中PI3K/Akt/eNOS 信号通路相关蛋白表达影响 1.7.1 rhSTC1对EPCs中Akt和eNOS表达的影响20、50、100 μg/mL rhSCT1孵育EPCs 24 h,未处理组为对照,提取细胞总蛋白,Western blot检测p-Akt、p-eNOS 和t-Akt、t-eNOS表达。
1.7.2 siRNA沉默STC1对EPCs中Akt和eNOS表达的影响培养5 d的EPCs利用siRNA沉默技术抑制STC1的表达,培养48 h。提取EPCs总蛋白,Western blot检测p-Akt、p-eNOS和t-Akt、t-eNOS表达。
1.8 LY294002(PI3K特异性抑制剂)和L-NAME (eNOS特异性抑制剂)对EPCs增殖、迁移的影响10 μmol/L LY294002(PI3K特异性抑制剂)和100 μmol/L L-NAME(eNOS特异性抑制剂)分别预处理EPCs 30 min,再加入终浓度50 μg/mL rhSCT1孵育24 h;未加抑制剂,只加rhSCT1为STC1组,未处理组为对照。分别采用CCK-8和Transwell细胞迁移实验检测EPCs增殖能力和迁移能力。
1.9 统计学处理实验数据以x±s表示,采用SPSS 18.0统计学软件分析。多组之间比较采用单因素方差分析,组间两两比较用Dunnett-t检验。
2 结果 2.1 EPCs的鉴定红色荧光(图 1A)表示具有摄取Dil-acLDL的能力的细胞;绿色荧光(图 1B)表示能与FITC-UEA-1结合的细胞;图像融合显示双染的细胞即为EPCs(图 1D)。蓝色荧光(图 1C)表示细胞核DAPI染色。随机视野(n=5)计数双染阳性细胞百分比为(88.5±5.2) 。
2.2 rhSTC1对EPCs增殖、迁移的影响
外源性给予不同浓度(20、50、100 μg/mL)rhSTC1处理EPCs。CCK-8检测细胞增殖情况显示,20 μg/mL STC1处理组(1.41±0.04) 50 μg/mL STC1处理组(1.59±0.08) 100 μg/mL STC1(1.95±0.06) 理组与正常对照组 (1.22±0.05) 比,D(450)值都显著增加(P<0.05) 提示rhSTC1呈浓度依赖性地促进EPCs增殖。
运用Transwell小室实验检测细胞迁移情况也表明,EPCs迁移数量20 μg/mL STC1处理组(37.40± 1.50) 50 μg/mL STC1处理组(43.00±1.34) 100 μg/mL STC1处理组(48.00±1.23) 显著高于正常对照组[(30.00±2.30) P<0.05],说明rhSTC1浓度依赖性的促进EPCs迁移。
2.3 siRNA沉默STC1对EPCs增殖、迁移的影响Western blot结果显示沉默STC1组与对照组相比,STC1的表达水平明显下调(图 2)。进一步用CCK-8检测细胞增殖情况,发现干扰STC1,阴性对照组D(450)值(1.13±0.05) 正常对照组(1.22±0.05) 比无明显变化,而沉默STC1组D(450)值(0.95±0.04) 正常对照组明显减少(P<0.05) 说明抑制EPCs内源性STC1抑制了EPCs的增殖。
Transwell小室实验观察细胞的迁移情况发现阴性对照组EPCs迁移数目(29.40±1.97) 正常对照组(30.00±2.30) 比,无明显变化。沉默STC1组 EPCs迁移数目(22.00±1.67) 正常对照组(30.00±2.30) 明显减少(P<0.05) 说明抑制EPCs内源性STC1抑制了EPCs的迁移。
2.4 STC1影响Akt与eNOS的磷酸化rhSTC1对Akt和eNOS的表达无影响,但明显促进Akt和eNOS的磷酸化且呈浓度依赖性。用siRNA转染处理EPCs,沉默内源性STC1同样对Akt和eNOS的表达无明显影响,但干扰STC1明显下调Akt和eNOS的磷酸化水平(图 3)。提示STC1影响EPCs增殖、迁移可能与PI3K/Akt/eNOS信号通路有关。
2.5 抑制PI3K/Akt/eNOS信号通路对rhSTC1诱导的EPCs增殖、迁移的影响
与STC1组相比,分别用LY294002和L-NAME预处理EPCs后,STC1诱导的细胞增殖、迁移明显被逆转(P<0.05,图 4),提示STC1促进EPCs增殖、迁移是通过PI3K/Akt/eNOS发挥作用的。
3 讨论
随着我国逐步进入老龄化社会,心脑血管疾病慢慢成为威胁人们的主要疾病。动脉粥样硬化作为多种心脑血管疾病的共同病理基础,有效的预防与治疗对控制心脑血管疾病的发生和发展至关重要。血管内皮的损伤是动脉粥样硬化的始动环节,尽早促进损伤血管的再内皮化、恢复血管内皮的完整性,可有效预防血栓形成和抑制血管平滑肌细胞的异常增生。因此,探索内皮再生机制,促进受损血管处内皮细胞的良性再生,是治疗损伤性血管疾病的关键。EPCs是血管内皮的前体细胞,在体内能够归巢至损伤血管壁的新生内膜中分化成有功能的内皮细胞参与损伤血管的再内皮化。研究发现冠心病患者循环血中EPCs数量显著下降,迁移能力受损,常见心血管病危险因子如吸烟、高脂血症、高糖血症等也损害了EPCs的增殖和迁移能力[2-5],导致EPCs归巢至受损内皮处的数量减少,修复能力显著降低。目前,对于调控EPCs增殖、迁移的机制研究尚不透彻,缺乏比较有效的调控手段。因此进一步研究调节EPCs的关键因子,有效促进EPCs增殖、迁移,在EPCs介导的细胞治疗中显得尤为重要。
STC1是一种能促进内皮细胞增殖、迁移的糖蛋白激素,主要通过旁分泌和自分泌的形式作用于细胞线粒体内膜的受体后进一步发挥作用。STC1在人心脏、肺、肝、肾脏等高度血管化的组织中广泛存在,与心血管功能密切相关。目前的研究认为它是一种保护性激素,保护心肌细胞对抗缺氧,防止钙超载。在内皮细胞中,能提高动脉内皮细胞的活性,促进人脐静脉内皮细胞增殖、迁移,促进血管新生。已有研究表明STCI通过多种通路调节了乳腺癌细胞、人脐静脉内皮细胞、生长板软骨细胞的增殖、迁移,但STC1对EPCs增殖、迁移的作用及机制尚少见报道。本实验室在前期研究发现Notch、PI3K/Akt、MAPK等多条信号通路参与EPCs增殖与迁移的调控,对STC1是否也通过这些通路影响EPCs增殖、迁移,我们进行了实验研究。
我们的研究表明,外源性给予不同浓度rhSTC1,可浓度依赖性地促进大鼠脾源性EPCs的增殖、迁移,而用siRNA技术沉默大鼠EPCs内源性STC1,EPCs的增殖、迁移功能受到了抑制;STC1影响EPCs Akt与eNOS的磷酸化,而抑制Akt与eNOS的磷酸化可明显阻断STC1对EPCs增殖、迁移的促进作用。
STC1对细胞功能影响的研究已多有报道,然而其对EPCs生物学功能的报道尚少见到。在已有细胞学功能研究报道中,STC1对不同细胞功能的作用也不尽相同。STC1在乳腺癌细胞中、卵巢癌细胞、脐静脉内皮细胞中促进了细胞增殖、迁移,在乳腺癌细胞、宫颈癌细胞、生长板软骨细胞中抑制了增殖、迁移。乳腺癌中,Chang等[6]发现抑制STC1能减小肿瘤大小,抑制乳腺癌细胞侵袭,而Daniel等[7]则证实抑制STC1表达,可以上调了黄体酮受体进而抑制乳腺癌细胞增殖;在卵巢癌中,Liu等[8]发现STC1促进了卵巢细胞的增殖、迁移;Guo等[9]过表达STC1发现宫颈癌细胞增殖和迁移的能力受到抑制。非肿瘤细胞中,Law等[10]证实STC1促进了人脐静脉内皮细胞增殖、迁移。但是,Wu等[11]的研究则发现STC1抑制了生长板软骨细胞的增殖;本研究中,我们发现STC1能促进EPCs的增殖、迁移,这与Liu[8]、Law等[10]的报道一致。STC1不同细胞生物学功能,可能与不同细胞类型,不同的微环境有关。在生长板软骨细胞中,STC1抑制增殖的作用可被磷酸盐转运抑制剂磷酸三钠甲酸盐逆转。说明STC1抑制生长板软骨细胞增殖可能与STC1调节钙磷代谢从而影响软骨细胞的钙磷微环境有关。在宫颈癌细胞和乳腺癌细胞中,STC1抑制了细胞增殖、迁移,而在乳腺癌细胞中这一功能是通过上调黄体酮受体实现,说明性别差异,性激素也可能参与了STC1对细胞增殖、迁移的调节。
STC1促进EPCs增殖、迁移通过了PI3K/AKt/eNOS途径。Murai等[12]发现STC1通过PI3K/AKt信号通路增强了乳腺癌细胞侵袭性。我们的研究与之相似,发现STC1促进了EPCs中Akt蛋白Ser473位点磷酸化,激活了PI3K/AKt信号通路。活化的PI3K/AKt信号通路可以进一步激活下游多条通路,常见促进细胞增殖、迁移的有mTOR,IKK,eNOS等。
eNOS是调节EPCs功能的重要分子,与EPCs增殖、迁移密切相关。因此,我们推测STC1可能通过PI3K/AKt进一步激活eNOS,进而促进EPCs的增殖、迁移。eNOS的活化除了增加细胞内钙离子,促进钙调蛋白与eNOS结合,促进eNOS活化外,还可以通过eNOS磷酸化、热休克蛋白90、小凹蛋白等调节eNOS活性。其中eNOS磷酸化是蛋白翻译后eNOS功能调控的重要手段。eNOS丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基可以被磷酸化,是eNOS磷酸化的主要位点。现有被证实有重要作用的磷酸化位点有位于还原酶区的的Ser1177和位于钙调素结合区的Thr495。其他的还有Ser114,Ser633,Tyr81,and Tyr657。在静息的细胞中,Ser1177位点一般不被磷酸化。但当细胞暴露于流体剪切力或接触到雌激素,VEGF,胰岛素,缓激肽时。这些刺激因子会激活Akt,AMP依赖的蛋白激酶[Adenosine 5’-monophosphate (AMP)-activated protein kinase,AMPK],钙调蛋白激酶Ⅱ( Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ,CaMKⅡ),蛋白激酶A(Protein Kinase A,PKA)等激酶促进eNOS磷酸化。我们的研究证实STC1与雌激素和 VEGF类似,在EPCs中STC1激活PI3K/AKt,活化的Akt进一步促进了eNOS磷酸化位点Ser1177磷酸化进而激活eNOS。
活化的eNOS与活化的Akt参与了EPCs的增殖、迁移、动员、血管新生等多种生物学功能[13-16]。STC1激活PI3K/AKt/eNOS的具体机制还不明确,而STC1受体结合分析和分馏法分析显示,STC1大多数高亲和力结合位点位于线粒体内膜上,STC1是否通过直接结合受体,进而影响分子构象或激活下游分子激活PI3K/AKt/eNOS通路还有待进一步证实。Law等[10]研究发现,STC1在HUVEC中促进了VEGF、SDF-1等旁分泌促血管生长因子表达,EPCs是ECs前体细胞,其旁分泌功能较ECs更强,我们推测STC1也可能促进了EPCs表达VEGF等细胞因子。而大量文献证实VEGF可以活化AKt/eNOS途径,所以STC1也可能通过促进EPCs表达VEGF,进而间接活化Akt/eNOS信号通路。
综上所述,我们的实验证明STC1可以促进大鼠脾脏来源EPCs的增殖和迁移,这一功能与激活PI3K/Akt/eNOS信号通路相关。我们的这一发现也为改善EPCs功能为基础的细胞靶向治疗提供了新思路。
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