2. 400038 重庆，第三军医大学军事预防医学院毒理学研究所
2. Institute of Toxicology, College of Military Preventive Medicine, Third Military Medical University, Chongqing, 400038, China
精液常规分析是评价精液质量、评估男性生育能力的常规方法。目前临床常用的精液常规指标主要是精液量、pH值、精子密度、精子数量、精子活力、精子形态等，其对临床指导意义的局限性越来越明显。近年来精子DNA损伤作为一项独立于精液常规参数之外的评价指标，逐渐成为男性不育症研究的热点，精子DNA损伤可影响精子的受精能力、受精卵的分裂、胚胎发育和着床，进而降低妊娠率、增大流产的风险[1]。因此，精子DNA损伤已经成为评价精子质量和生育能力的有效指标[2]。我们的前期研究也证明，环境化学物的暴露在不引起精液常规参数改变的水平下可引起精子DNA损伤[3]。目前精子DNA损伤已逐渐成为精液常规分析的必要补充[2-5]，但也有一些研究认为精子DNA损伤对于人工辅助生殖(assisted reproductive techniques,ART)就诊者的受孕率没有明确的指示作用[6-7]。本研究采用单细胞凝胶电泳技术(彗星实验)检测重庆大学生健康人群精子DNA损伤水平，分析其与精液常规多种参数间的关联性，探讨精子DNA 损伤检测在评价精液质量和男性生育能力中的应用价值。
1 对象与方法 1.1 研究对象本研究获得第三军医大学伦理委员会批准，于2014年6月开展大学生生殖健康现场调查，招募来自重庆大学、重庆医科大学、西南政法大学等9所重庆高校的健康男性大学生639名，全部受访者签署知情同 意书。研究对象纳入标准：①禁欲2～7 d；②年满18周 岁；③重庆市在读大学生。排除标准：①泌尿生殖系统疾病史，包括确诊的睾丸损伤、附睾炎、睾丸下降不全、泌尿生殖系统炎症、精索静脉曲张治疗史；②由调查现场中男科医师检查确认以下情况：附睾结节或精索静脉曲张、隐睾、阴茎异常、阴毛发育异常、喉结发育异常、乳腺发育异常。
1.2 方法 1.2.1 精液标本采集研究对象禁欲2～7 d后，手淫法采集精液样本于无菌的塑料采样皿中，立即置于37 ℃孵箱中液化。记录受试者禁欲时间，待完全液化后立即进行精液常规分析。
1.2.2 精液常规分析严格执行WHO《人类精液和精子-宫颈黏液相互作用实验室检验手册》(第五版)操作要求，采用计算机辅助精子分析系统(SCA CASA system,Spain )进行精液常规分析；精子形态学分析，首先制备精液涂片，风干后用Diff-Quik试剂盒 (Baxter 92 Healthcare Corporation,Inc.)进行染色分析。
1.2.3 精子DNA损伤检测采用单细胞凝胶电泳(彗星实验)检测精子DNA损伤水平。将冻存的精液样本置于37 ℃ 水浴锅中，至刚好融化后立即取出，吸取20 μL 精液样本并调节精子密度至3×106/mL,按照Luke Simon的方法[8](略有调整)进行操作。具体过程为：将调节好密度的精子悬液与0.6%的低熔点胶混合，平铺于预先用1% 琼脂糖铺过的载玻片上，经裂解液(2.5 mol/L NaCl，100 mmol/L Na2EDTA，10 mmol/L Tris，NaOH 8 g，10%DMSO，1%Triton X-100；pH 10.0，4 ℃，70 min)处理以去除细胞器、核膜和部分核蛋白，再经蛋白酶K(100 μg/mL; 37 ℃,16 h;AMO)液进一步除去核蛋白尤其是鱼精蛋白，经碱性溶液(0.3 mol/L NaOH,1 mmol/L Na2EDTA; 37 ℃,20 min)解旋后将玻片置于电泳槽中进行电泳，使断裂的DNA片段电泳出来形成彗星样形态；经溴化乙啶(EB)染色后置于荧光显微镜下观察、拍摄照片。最后将拍摄好的照片用专门的彗星分析软件Casp(http://casplab.com/)进行图像分析和数据处理，选取5项常用的彗星指标： ①尾部DNA含量百分比(Tail DNA%)； ②尾长(tail length，TL)； ③彗星长(comet length,CL)；④尾距(tail moment,TM)； ⑤Olive尾距(olive tail moment,OTM)来反应精子DNA损伤水平。
1.3 统计学分析采用SPSS 20.0统计软件对数据进行分析，因所得检测结果为非正态数据资料，用中位数(median)和四分位数间距范围(interquartile range)进行描述；用Kruskal-Wallis检验对分层资料进行数据的比较分析；用Spearman相关性分析对精液常规参数和彗星参数进行关联性分析；检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 人口学背景资料639例重庆大学生分别来自汉族、土家族、哈萨克族、彝族、苗族、柯尔克孜族、蒙古族、瑶族、穿青人、仡佬族、回族、壮族、水族、藏族、侗族15个民族，其中汉族占84.0%；平均年龄22.0(四分位数间距：21.0～23.0)岁，平均禁欲时间4.0 d，平均体质量指数(BMI)21.2(四分位数间距：19.7～22.9)kg/m2；吸烟人数占21.6%，饮酒人数占74.8%(表 1)。
| 特征 | 例数(%) |
| 民族 | |
| 汉族 | 537(84.0) |
| 土家族 | 21(3.3) |
| 哈萨克族 | 9(1.4) |
| 彝族 | 7(1.1) |
| 苗族 | 8(1.3) |
| 其他民族 | 57(8.9) |
| 吸烟 | |
| 从不 | 467(73.1) |
| 已戒烟 | 34(5.3) |
| 吸烟 | 138(21.6) |
| 饮酒 | |
| 从不 | 125(19.6) |
| 已戒酒 | 36(5.6) |
| 饮酒 | 478(74.8) |
2.2 精液常规各指标及其合格率
样本各参数合格率分别为：精液量98.6%、精子 密度95.4%、精子总数96.7%、精子正常形态率91.9%、 前向运动精子百分率82.3%、精子总活力99.4%(异常值：精液量 <1.5 mL,精子密度 <15×106/mL，精子总数 <39×106/次，前向运动精子百分率 <40%，精子总活力 <32%，精子正常形态率 <4%)；所有指标都符合WHO标准的占68.9%(439/637)，见表 2。
| 参数 | 中位数(四分位数间距) | 符合率(%) |
| 精液量 (mL) | 3.6(2.8～4.6) | 98.6 |
| 精子密度(106/mL) | 52.0(33.5～81.7) | 95.4 |
| 精子总数(106/mL) | 193.6(115.0～310.8) | 96.7 |
| 精子形态 | ||
| 正常形态 (%) | 21.3(14.3～32.2) | 91.9 |
| 头部异常(%) | 53.2(45.9～59.5) | - |
| 体部异常(%) | 41.6(39.1～43.8) | - |
| 尾部异常(%) | 34.6(31.4～39.1) | - |
| 精子运动参数 | ||
| 前向运动精子(%) | 57.0(45.2～67.8) | 83.2 |
| 精子总活力(%) | 89.4(80.8～94.9) | 99.4 |
| VCL(μm· s-1) | 53.5(45.0～62.1) | - |
| VSL(μm ·s-1) | 20.6(16.7～24.8) | - |
| VAP(μm ·s-1) | 31.8(26.4～37.7) | - |
| BCF(Hz) | 12.3(10.7～13.7) | - |
| ALH(μm) | 1.8(1.5～2.1) | - |
| LIN(%) | 38.1(34.5～41.9) | - |
| STR(%) | 64.9(60.9～69.0) | - |
| WOB(%) | 58.7(55.5～61.9) | - |
2.3 精液参数影响因素分析
研究对象按照禁欲天数分为3组，2～3 d、4～5 d、 6～7 d；BMI按照中国人群标准分为4组， <18.5 kg/m2 (偏瘦)，18.5～ <24 kg/m2 (正常)、24～ <28 kg/m2 (偏胖)、≥28 kg/m2(肥胖)；按吸烟状态分3组，从不吸烟、已经戒烟、吸烟；按饮酒状态分3组，从不饮酒、已戒酒、饮酒。
禁欲天数对精液量(P≤0.001)、精子密度(P≤0.001)、精子总数(P≤0.001)、前向运动精子百分率(P=0.005)都有影响，并且禁欲2～3 d组以上的指标均低于4～5 d、6～7 d组；BMI对精子总数有影响，精子总数随BMI分级的升高而降低；吸烟会对精子正常形态率产生影响；饮酒对精子密度、精子总数、前向运动精子百分率、精子总活力都有影响(表 3)。
2.4 彗星实验检测精子DNA损伤经彗星实验测得精子DNA损伤各参数中位数(四分位数间距范围): Tail DNA%为19.4%(15.6～23.4)，TL为35.7(30.9～41.0)pixels，CL为81.6(76.6～85.9) pixels，TM为7.6(5.5～10.1)，OTM为6.3(4.9～7.9)。
2.5 精液参数与精子DNA损伤参数关联性分析精子DNA损伤彗星指标主要与精子运动能力相关联，前向运动精子百分率与Tail DNA%、TL、CL、TM、OTM都呈负向关联，精子总活力与Tail DNA%、CL、TM、OTM呈负向关联；Tail DNA%与精子密度也存在负向关联(表 4)。
| 影响因素 | n | 精液量(mL) | 精子密度(106/mL) | 精子总数(106) | 前向运动精子(%) | 精子总活力(%) | 正常形态率(%) |
| 禁欲时间 | |||||||
| 2～3 d | 225 | 3.3(2.6～4.2) | 47.6(30.2～67.8) | 158.4(95.62～242.6) | 59.6(41.7～69.3) | 90.1(81.6～94.8) | 10.4(7.1～15.2) |
| 4～5 d | 291 | 3.6(2.9～4.6) | 52.5(34.4～80.9) | 195.5(120.4～310.9) | 56.9(45.4～66.3) | 88.9(80.6～94.8) | 10.5(7.1～15.8) |
| 6～7 d | 122 | 4.3(3.1～5.2) | 67.3(40.7～108.9) | 279.1(152.8～424.0) | 50.9(41.5～63.7) | 90.0(77.2～95.0) | 10.5(6.6～15.9) |
| P | <0.001 | <0.001 | <0.001 | 0.005 | 0.763 | 0.915 | |
| BMI(kg/m2) | |||||||
| <18.5 | 55 | 3.8(2.8～5.1) | 52.7(30.6～99.9) | 205.4(129.0～400.0) | 54.4(46.1～66.6) | 90.1(79.6～95.6) | 9.3(5.9～12.4) |
| 18.5～ <24 | 479 | 3.6(2.8～4.7) | 54.0(34.8～82.8) | 199.9(115.2～316.7) | 57.1(44.7～67.5) | 89.5(80.6～94.7) | 10.6(7.2～16.0) |
| 24～ <28 | 72 | 3.2(2.6～4.2) | 50.3(34.2～71.6) | 174.8(111.5～246.0) | 58.7(46.5～71.3) | 89.0(82.2～96.3) | 9.8(6.5～15.9) |
| ≥28 | 28 | 3.3(2.6～4.5) | 39.4(29.2～56.6) | 135.7(101.3～192.2) | 55.5(49.9～62.4) | 87.3(81.1～92.9) | 10.5(8.4～14.1) |
| P | 0.072 | 0.109 | 0.004 | 0.823 | 0.692 | 0.153 | |
| 吸烟 | |||||||
| 从不 | 466 | 3.5(2.8～4.6) | 51.4(33.8～80.6) | 192.7(117.6～301.3) | 56.4(44.7～67.2) | 88.9(80.4～74.7) | 10.4(7.0～15.5) |
| 已戒烟 | 33 | 3.9(2.6～4.9) | 55.1(38.0～68.7) | 196.7(116.2～342.5) | 59.1(43.6～71.7) | 91.3(79.5～96.9) | 8.8(5.7～16.1) |
| 吸烟 | 138 | 3.6(2.8～4.5) | 51.1(32.0～86.1) | 196.4(105.3～331.3) | 58.8(47.6～68.3) | 91.0(81.5～95.0) | 11.6(7.9～18.1) |
| P | 0.701 | 0.975 | 0.894 | 0.456 | 0.332 | 0.049 | |
| 饮酒 | |||||||
| 从不 | 125 | 3.8(2.9～4.7) | 44.6(29.5～68.8) | 176.7(106.7～268.3) | 52.4(41.3～65.8) | 86.8(76.8～93.2) | 9.8(6.9～13.6) |
| 已戒酒 | 36 | 3.2(2.6～4.2) | 47.5(32.4～58.5) | 149.8(102.7～275.3) | 49.9(37.0～68.7) | 85.2(73.6～93.9) | 9.8(4.7～13.9) |
| 饮酒 | 477 | 3.6(2.8～4.6) | 55.6(35.7～85.0) | 206.2(117.9～324.3) | 57.9(46.0～68.0) | 90.2(82.7～95.0) | 10.8(7.3～16.0) |
| P | 0.278 | 0.011 | 0.035 | 0.015 | 0.006 | 0.064 |
| 彗星实验参数 | 精液量(mL) | 精子密度(×106/mL) | 精子总数(×106) | 精子总活力(%) | 前向运动精子(%) | 正常形态率(%) | |
| Tail DNA% | |||||||
| r | 0.075 | -0.090 | -0.071 | -0.164 | -0.165 | -0.042 | |
| P | 0.058 | 0.023 | 0.074 | <0.001 | <0.001 | 0.296 | |
| TL | |||||||
| r | 0.019 | -0.045 | -0.043 | -0.075 | -0.087 | -0.034 | |
| P | 0.629 | 0.253 | 0.283 | 0.058 | 0.028 | 0.388 | |
| CL | |||||||
| r | 0.041 | -0.063 | -0.058 | -0.122 | -0.112 | -0.022 | |
| P | 0.307 | 0.112 | 0.142 | 0.002 | 0.005 | 0.582 | |
| TM | |||||||
| r | 0.051 | -0.069 | -0.056 | -0.123 | -0.135 | -0.052 | |
| P | 0.201 | 0.083 | 0.158 | 0.002 | 0.001 | 0.189 | |
| OTM | |||||||
| r | 0.056 | -0.073 | -0.060 | -0.130 | -0.139 | -0.047 | |
| P | 0.160 | 0.066 | 0.128 | 0.001 | <0.001 | 0.242 |
3 讨论
全世界范围内不孕不育形势日渐严峻，目前已发现越来越多的危险因素，如环境污染[9]、不良生活方式[10-11]、心理因素[12]等均可导致精液质量的下降。与此同时，不明原因的原发性不育患者也日渐增多，对精液常规指标能否真实反映精液质量的质疑声也越来越强烈[13]。精子DNA损伤检测[14]、精液活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)检测[15]等指标已逐渐被认为是精液常规检测的必要补充。其中，精子DNA损伤被认为可以反映精子受环境暴露后的损伤[3]，在精液质量检测中的应用已越来越广泛。
目前检测精子DNA损伤的方法主要有精子染色质结构分析(sperm chromatin structure assay，SCSA)、精子染色质扩散试验(sperm chromatin dispersion test，SCD)、精子彗星实验(comet assay)、末端转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记法(TUNEL)，而不同的试验方法代表着的精子遗传损伤的不同终点。彗星电泳可以直接反映精子DNA的单、双链断裂水平，并且有成本低、重复性好等优点，所以是一种较好地反映精子DNA损伤的检测方法。
目前关于精子DNA损伤的研究对象主要集中在不育人群[16-17]，也有部分研究针对普通育龄人群[18]。MARHCS队列是本课题组建立的重庆市大学生生殖健康调查队列，队列于2013年开始建立，基线调查时共纳入合格的健康男性大学生796人[19]，本研究的对象是2014年随访的样本。我们共随访到了696人，随访率为87.4%。所有的调查对象是大学三年级学生，年龄相似，生活习惯同质化较高，这些因素有利于排除对精液质量有影响的混杂因素,如年龄、职业暴露、受教育程度、收入水平等的干扰，研究环境暴露、生活习惯等因素对生殖健康的影响。
本研究结果表明，禁欲时间与饮酒会影响精液参数，且随着禁欲天数的增加，精液量、精子密度、精子总数都相应增高，但前向运动精子(%)相应降低；而禁欲时间、饮酒与精子DNA损伤指标间没有发现关联性，提示精子DNA损伤较精液常规参数更加稳定，这与前人研究结果相符[20]。
目前有关精子DNA损伤与精液常规参数间关联性的研究结果主要体现在与精子密度和精子活力的关联性上。本研究对精液常规和精子DNA损伤关联性分析结果表明，精子DNA损伤与精子密度、精子运动指标相关联。精子密度与精子DNA损伤呈负向关联，与Zini等[21]、曾兰等[22]的研究结果一致；精子活力、前向运动精子(%)与精子DNA损伤呈显著负向关联，与孙静波等[23]、杨雪梅等[24] 的研究结果相符。本课题以重庆大学生这一身体素质、生殖机能相对较好的人群进行研究，更能说明精子DNA损伤可以反映精子密度、精子活力等精液常规指标水平。
一般认为，精子DNA损伤会造成精子头部畸形[25]，但我们的研究结果未发现精子DNA损伤与精子畸形的关联性，其原因可能是本研究纳入的对象均为健康大学生，其精子畸形率显著低于普通人群，其精子DNA损伤程度也显著低于普通人群，所以，其精子DNA损伤可能还未造成精子头部的畸形，这也进一步证明精子DNA损伤较精液常规检测更为敏感。
精子DNA损伤主要机制包括：①精子发生过程中的细胞凋亡异常[26]；②精子染色质重塑、包装异常[27]；③精子运输过程中的氧化应激作用[28-29]。我们前期的研究表明，精子DNA损伤与个体多环芳烃的暴露成正相关关系[3]，可以比精液常规更为灵敏地反映环境暴露对精子造成的损害。精子DNA损伤后可影响精子的受精能力、受精卵的分裂、胚胎发育和着床等功能，而在精子发生过程中，80%的核DNA组蛋白被结合力更强的鱼精蛋白所取代，染色质逐渐凝缩，以增加DNA对各种有害因素的自我保护能力。在精子生成以后，精子DNA几乎没有自我修复能力，在精卵结合以后受损的DNA才得以修复[30]，因此对精子DNA损伤水平的检测尤为重要。本研究结果表明在大学生人群中，精子DNA损伤与精子密度和活力呈显著负向关联，但相关系数较小，说明精液常规指标只能部分反映精子DNA损伤的状况，而不能完全取代。
随着我国二孩政策的全面放开，高龄夫妇的生育需求也越来越大，男性生育能力的检测显得尤为重要。目前精液分析仍然是衡量男性生育能力和精子质量的主要指标，但约有15%的男性不育者精液常规分析正常[22]，因此，精液常规分析作为衡量精子质量的基本指标，有时不能对男性生育能力进行有效评价。精子DNA损伤可影响受精能力、胚胎发育甚至子代健康，不育男性有较高的DNA损伤水平[31]，在特发性不育者中约20%有高水平的精子DNA损伤，所以精子DNA损伤的检测被看作是评价精子质量和男性生育能力的更有效指标。精子DNA损伤检测可以反映出精液常规分析不能反映的精子异常，因此，精子DNA损伤的检测应作为精液常规分析的必要补充，以对精液质量、男性生育能力进行更加全面、客观的评价。
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