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骨形态发生蛋白9激活PI3K/Akt信号通路抑制退变髓核细胞的炎症反应和凋亡
鲁花, 于露, 甄欢欢, 刘汝银, 岳宗进     
450002 郑州,河南省中医院脊柱科
[摘要] 目的 研究骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)对退变髓核细胞炎症反应和凋亡的影响,并探究其与PI3K/Akt信号通路的关系。 方法 通过氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)培养建立退变髓核细胞模型;重组腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)将BMP9转染入人髓核细胞内(human nucleus pulposus cells, HNPCs),实验共分5组:Control组(正常培养的HNPCs)、OGD组(氧糖剥夺模型)、AAV组(氧糖剥夺模型,转染AAV空载体)、AAV-BMP9组(氧糖剥夺模型,转染AAV-BMP9),AAV-BMP9+LY294002组(AAV-BMP9组基础上添加PI3K抑制剂LY294002)。免疫荧光方法检测蛋白聚糖(Aggrecan)和Ⅱ型胶原(type Ⅱ collagen,Col2a1)的表达;Western blot检测p-Akt和p-mTOR的蛋白表达;酶联免疫吸附实验检测细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的表达;流式细胞术检测细胞的凋亡。 结果 在氧糖剥夺培养模型中Aggrecan和Col2a1表达明显降低;AAV-BMP9组中p-Akt和p-mTOR的表达明显高于OGD组和AAV组(P<0.05);此外,AAV-BMP9组HNPCs分泌的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8明显减少,细胞凋亡被显著抑制(P<0.05);LY294002的加入能够显著逆转BMP9的上述效果。 结论 BMP9能够抑制退变HNPCs的炎症反应和凋亡,并且这种作用是通过激活PI3K/Akt信号通路实现的。
[关键词] 骨形态发生蛋白9     炎症反应     细胞凋亡     髓核细胞    
BMP9 inhibits inflammatory response and apoptosis of degenerative nucleus pulposus cells through activating PI3K/Akt signaling pathway
Lu Hua , Yu Lu , Zhen Huanhuan , Liu Ruyin , Yue Zongjin     
Department of Spinal Surgery, Henan Hospital of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou, Henan Prouince, 450002, China
Corresponding author: Liu Ruyin, E-mail: s_yanbing@126.com
[Abstract] Objective To investigate the effects of bone morphogenetic protein 9 (BMP9) on inflammatory response and apoptosis of degenerative nucleus pulposus cells and to mechanistically explore its association with PI3K/Akt signaling pathway. Methods The degenerative nucleus pulposus cells were generated by oxygen glucose deprivation (OGD) method. BMP9 gene was transinduced into human nucleus pulposus cells (HNPCs) by recombinant adeno-associated virus (AAV) mediated gene transfer. According to the transfection and treatment, HNPCs were divided into 5 groups: Control group (cultured HNPCs without treatment), OGD group (OGD model), AAV group (OGD+AAV empty vector), AAV-BMP9 group (OGD+AAV-BMP9), and AAV-BMP9+LY294002 group (OGD+AAV-BMP9+PI3K inhibitor LY294002). Immunofluorescence staining was used to detect Aggrecan and type Ⅱ collagen (Col2a1). Western blot were performed to detect the protein expression of p-Akt and p-mTOR. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was carried out to measure the levels of TNF-α, IL-1β, IL-6 and IL-8 in the supernatant of medium. Flow cytometry was performed to detect cell apoptosis. Results The expression of Aggrecan and Col2a1 was significantly decreased in OGD model. The protein expression of p-Akt and p-mTOR was higher in AAV-BMP9 group than those in OGD and AAV groups (P<0.05). In addition, the levels of TNF-α, IL-1β, IL-6 and IL-8 were significantly decreased (P<0.05) and cell apoptosis was markedly reduced in HNPCs of AAV-BMP9 group. But, LY294002 treatment significantly reversed the above-mentioned effects induced by BMP9 overexpression in degenerative HNPCs. Conclusion BMP9 inhibits the inflammatory response and apoptosis of degenerative HNPCs through activating PI3K/Akt signaling pathway.
[Key words] bone morphogenetic protein 9     inflammatory response     cell apoptosis     nucleus pulposus cells    

椎间盘突出症是椎间盘退行性疾病之一,伴随着髓核功能的失调和髓核细胞的退变,具有发病率高,患者逐渐年轻化的特点[1]。髓核细胞是髓核的主要组成细胞,属于类软骨细胞,可以分泌蛋白聚糖(aggrecan)和Ⅱ型胶原(type Ⅱ collagen,Col2a1) 合成细胞外基质,进而维持髓核的稳态。在体内外多种因素的刺激下,髓核中蛋白聚糖解聚增多,Ⅱ型胶原变性及细胞外基质降解[2]。同时,由于炎症因子的增多,髓核细胞生物功能发生不可逆转的改变,导致椎间盘退行性疾病的发生[3]。髓核细胞凋亡也是椎间盘退行性疾病发生的重要机制。

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)属于转化生长因子β超家族的成员,具有诱导成骨分化的生物学效应[4]。有学者证实BMPs能够显著促进髓核细胞的胞外基质合成[5]。体外研究表明,BMP7可显著抑制髓核细胞的凋亡[6]。张健等[7]的研究也证实,BMP7能够促进小鼠髓核细胞的成骨分化,并与Notch信号通路密切相关。然而,对于BMP9在髓核细胞中的作用却少见相关报道。另一方面,研究表明IL-1β和IL-6等炎症因子参与调节多种成骨分化相关信号通路[8-9]。因此,本研究借助重组腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)将BMP9转染入人髓核细胞内,探究BMP9对退变髓核细胞炎症和凋亡的作用,并进一步研究了相关机制,为椎间盘突出症的治疗提供新的理论依据。

1 材料与方法 1.1 主要试剂和材料

DMEM培养液、胎牛血清、胰蛋白酶均购自美国HyClone公司;Aggrecan和Col2a1抗体及对应荧光二抗购自美国Invitrogen公司;AAV及AAV-BMP9由上海吉玛合成和提供;LY294002和RIPA蛋白裂解液购自美国Sigma公司;人髓核细胞(human nucleus pulposus cells, HNPCs)购自美国ScienCell公司;ELISA试剂盒购自上海联硕生物科技有限公司;总RNA抽提试剂盒、M-MLV逆转录酶和SYBR Premix Ex Taq Ⅱ购自大连宝生物工程有限公司;ECL发光试剂盒购自美国Amersham公司;流式细胞术凋亡检测试剂盒购自美国BD Biosciences公司;GAPDH、BMP9、Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR抗体及对应二抗均购自美国Invitrogen公司;引物合成由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 细胞培养和退变模型建立

HNPCs培养在添加10%的胎牛血清的DMEM培养液中,于37 ℃含有5% CO2的培养箱中连续培养。待细胞生长融合至约占培养皿底面积80%,用胰蛋白酶消化后按照1 ∶3的比例进行传代培养。为了建立退变HNPCs模型,将HNPCs培养液更换为无血清的无糖DMEM培养液,在1% O2/94% N2/5% CO2气体组分中培养12 h,模拟体内椎间盘退变微环境。根据实验分组,LY294002以30 μmol/L的浓度添加到培养液中用来抑制PI3K/Akt信号通路。

1.3 细胞转染及分组

取对数生长期的HNPCs接种于6孔培养板(2×105个细胞/孔),待细胞融合至80%,每孔加入病毒原液1.5 mL。24 h后,去除病毒工作液,加入含10% FBS的DMEM培养液继续培养48 h,检测细胞中BMP9的表达水平以验证转染效果。实验分为5组:Control组(正常培养的HNPCs)、OGD组(HNPCs进行氧糖剥夺处理)、AAV组(转染空载体病毒后进行氧糖剥夺处理)、AAV-BMP9组(转染AAV-BMP9后进行氧糖剥夺处理)、AAV-BMP9+LY294002组(AAV-BMP9组基础上添加PI3K抑制剂LY294002) 。

1.4 免疫荧光

取对数生长期的HNPCs接种于2.5 cm的免疫荧光培养皿中(1×103个细胞/皿),根据实验分组决定是否转染BMP9,转染步骤如上。随后用4%的多聚甲醛在冰上固定过夜,去除多聚甲醛并清洗后分别加入Aggrecan(1 ∶1 000) 和Col2a1(1 ∶1 500) 抗体在4 ℃条件下孵育过夜。去除一抗后紧接着在室温下用对应的荧光二抗(1 ∶4 000) 孵育30 min,随后用激光共聚焦显微镜(奥林巴斯FV1000显微镜)观察并照相。

1.5 实时定量PCR

采用总RNA抽提试剂盒提取各组细胞的总RNA,随后用M-MLV逆转录酶合成cDNA。实时定量PCR反应体系(20 μL):SYBR Premix Ex Taq Ⅱ混合液12 μL,cDNA模板2 μL,上下游引物各1 μL,灭菌蒸馏水4 μL。反应条件:94 ℃,10 min;40个循环(95 ℃,30 s;60 ℃,35 s;72 ℃,50 s);72 ℃,延伸`10 min。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作为内参基因,根据2-ΔΔCt计算方法计算基因相对表达水平(表 1)。

表 1 实时定量PCR引物
基因引物序列产物大小(bp)
BMP9上游: 5′-GGACCCGATGCGGTTAGAG-3′168
下游: 5′-ATCAAGTGGATGCCCCACAG-3′
GAPDH上游: 5′-GAATGGGCAGCCGTTAGGAA-3′137
下游: 5′-AGGAAAAGCATCACCCGGAG-3′

1.6 Western blot

去除培养液,每孔中加入2 mL RIPA裂解液,放置在冰上并不断震荡10 min,随后用细胞刮收集细胞裂解液,反复吹打后用Bradford法检测蛋白的浓度。选取10 μg 蛋白经10% SDS-PAGE(浓缩胶60 V,分离胶120 V)后,电转到PVDF膜上,用5%脱脂奶粉室温封闭2 h后,在4 ℃条件下分别与BMP9 (1 ∶1 000) 、Akt (1 ∶1 000) 、p-Akt (1 ∶800) 、mTOR (1 ∶1 000) 和p-mTOR (1 ∶600) 抗体孵育过夜,随后用辣根过氧化物酶标记的二抗(1 ∶3 000) 在室温下孵育2 h,用ECL发光系统检测目的条带。蛋白条带用Image Pro Plus 6.0软件进行灰度分析,并以GAPDH作为内参蛋白,计算蛋白的相对表达量。

1.7 酶联免疫吸附实验

收集细胞培养液,离心后收取上清液,按1 ∶100稀释后加入酶标反应孔中,在37 ℃条件下孵育1 h,随后用洗涤液洗涤3遍,每次3 min。每孔加入 100 μL酶标抗体,再次在37 ℃条件下孵育1 h,每孔加入100 μL TMB-过氧化氢尿素溶液,37 ℃下避光放置5 min,加入50 μL终止液终止反应,测定各孔在波长450 nm处的光密值[D(450) ],并根据标准曲线换算为浓度。

1.8 流式细胞术

HNPCs用不含乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)的胰蛋白酶消化后,经2 000 r/min,5 min离心用PBS重悬洗涤2次,加入500 μL binding buffer悬浮细胞。随后每管加入5 μL Annexin V-EGFP 和5 μL碘化丙啶(propidiumIodide,PI)混匀后避光反应15 min,用FACSCalibur cytometer流式细胞仪进行检测。

1.9 统计学分析

采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析,数据用x ±s表示,采用t检验和单因素方差分析方法。

2 结果 2.1 氧糖剥夺后HNPCs Aggrecan和Col2a1表达水平显著降低

HNPCs经12 h无血清无糖低氧处理后,采用免疫荧光检测细胞质中Aggrecan和Col2a1的表达水平。如图 1所示,与Control组相比,OGD组细胞质中Aggrecan和Col2a1的荧光强度显著降低,证明HNPCs合成Aggrecan和Col2a1的能力被无血清无糖低氧处理显著抑制,说明HNPCs退变模型建立成功。

图 1 免疫荧光检测各组细胞质中Aggrecan和Col2a1的表达水平

2.2 AAV转染后BMP9表达水平显著升高

AAV转染HNPCs 24 h,经正常DMEM培养液培养48 h之后,建立退变模型,用实时定量PCR和Western blot检测BMP9的表达。如图 2A所示,AAV-BMP9组中BMP9的mRNA表达水平显著高于OGD组和 AAV组(P<0.01) 。Western条带(图 2B)和其对应的灰度分析结果(图 2C)也证明BMP9在蛋白水平过表达。

1: OGD组;2:AAV组;3:AAV-BMP9组 A:实时定量PCR检测各组BMP9 mRNA相对表达量;B:Western blot检测结果;C:各组BMP9蛋白相对表达量 a: P<0.01,与OGD组比较;b:P<0.01,与AAV组比较 图 2 各组AAV转染HNPCs后BMP9表达水平

2.3 BMP9的过表达激活了PI3K/Akt信号通路

在退变HNPCs模型中转染BMP9,Western blot检测结果显示,BMP9的过表达显著提高了p-Akt和p-mTOR的蛋白表达水平,与OGD组或AAV组相比差异有统计学意义(P<0.05,图 3)。此外,LY294002的加入显著逆转了BMP9对信号通路的激活效果(P<0.05) 。

1:Control组;2:OGD组;3:AAV组;4:AAV-BMP9组;5:AAV-BMP9+LY294002组 a:P<0.05,与Control组比较;b:P<0.05,与OGD组比较;c:P<0.05,与AAV组比较;d:P<0.05,与AAV-BMP9组比较;A:Western blot检测结果;B、C:Akt和mTOR蛋白半定量结果 图 3 Western blot检测各组转染BMP9后Akt和mTOR表达水平

2.4 BMP9的过表达显著降低了退变HNPCs中炎症因子的水平

酶联免疫吸附实验结果显示(图 4),OGD组中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的水平显著升高,与Control组相比差异有统计学意义(P<0.01) ;AAV-BMP9组中炎症因子的水平显著下降(P<0.05) ;AAV-BMP9+LY294002组中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的水平显著高于AAV-BMP9组(P<0.05) 。上述结果说明BMP9的过表达显著抑制了退变HNPCs的炎症反应。

1:Control组;2:OGD组;3:AAV组;4:AAV-BMP9组;5:AAV-BMP9+LY294002组 A:酶联免疫吸附检测TNF-α表达水平;B:酶联免疫吸附检测IL-1β、IL-6和IL-8表达水平 a: P<0.01,与Control组比较;b: P<0.05,与OGD组比较;c: P<0.05,与AAV组比较;d:P<0.05,与AAV-BMP9组比较 图 4 酶联免疫吸附检测各组TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的表达水平

2.5 BMP9的过表达显著抑制了退变HNPCs的凋亡

流式细胞术检测结果显示,与正常培养的HNPCs的凋亡率(3.67±1.04) %相比,退变HNPCs的凋亡率(25.67±0.97) %显著升高(P<0.01) ;BMP9的过表达能够显著降低退变HNPCs的凋亡率(9.02±0.78) %;相反,LY294002的加入使细胞凋亡率骤然升高(19.50±1.26) %,逆转了BMP9过表达对细胞的保护效果(图 5)。

图 5 流式细胞术检测各组细胞凋亡率变化

3 讨论

BMP家族属于TGFβ超家族的一员,在胚胎发育和骨形成方面发挥着重要的作用。大量研究表明BMP家族的成员——BMP-2和BMP-7能够促进骨发生[4-5, 10],但是家族其他成员在骨形成中的潜在作用尚不清楚。体内动物实验表明,在间充质干细胞中,BMP9诱导骨分化的能力强于BMP2和BMP7(BMP2和BMP7经常被用于骨缺陷相关疾病的治疗)[10]。因而本实验初步验证了BMP9在退变髓核细胞中的作用。本研究通过腺相关病毒介导的基因转染技术,成功地将BMP9导入HNPCs中。基因表达分析结果显示,转染后BMP9的表达水平显著升高,且在退变HNPCs模型中,Aggrecan和Col2a1的表达显著减少,说明该模型有效地模拟了椎间盘退变的微环境。在后续实验中我们发现,BMP9的过表达能够有效地抑制退变HNPCs的炎症反应和凋亡,保护HNPCs免受退变微环境的进一步损害。本实验研究成果为椎间盘退行性疾病的治疗提供了新的思路和理论依据。

PI3K/Akt通路是重要的抗凋亡信号通路,PI3K通过磷酸化的方式激活Akt和mTOR,从而激活或者抑制下游靶蛋白发挥调节作用。研究表明,PI3K/Akt信号通路会促进成骨细胞MC3T3-E1分化[11]。在骨关节炎软骨细胞及神经细胞中,炎症因子IL-1β可激活PI3K/Akt通路[12]。在OGD条件下,IL-6等细胞因子的水平及p-Akt和p-mTOR的磷酸化水平升高。Kaneshiro等[9]的研究证明了这一现象,即IL-6可通过激活PI3K/Akt信号通路负向调节成骨分化。另一方面,PI3K/Akt通路的激活又可抑制炎症反应[13]。本研究证明BMP9的过表达显著提高了p-Akt和p-mTOR的磷酸化水平,激活了PI3K/Akt通路,降低了炎症因子的水平。虽然近期的两项研究表明在胃癌组织及乳腺癌细胞系中,BMP9水平下降且BMP9过表达会抑制PI3K/Akt通路,促进细胞凋亡[14-15]。但是也有研究表明,在鼠胚胎成纤维细胞及脂肪前体细胞中,BMP9过表达会激活PI3K/Akt通路[16-17],说明在不同的细胞系中BMP9对PI3K/Akt信号通路的影响不同。LY294002是PI3K特异性的蛋白激酶抑制剂,被广泛用于PI3K/Akt信号通路的研究中。我们发现,LY294002加入HNPCs培养液中,显著抑制了PI3K/Akt通路相关效应分子的表达,并且LY294002能够逆转BMP9对退变HNPCs的保护作用,促进HNPCs的炎症反应和凋亡。据此推测,BMP9的过表达对HNPCs的保护很有可能是通过激活PI3K/Akt通路实现的。上述结果共同证明BMP9通过激活PI3K/Akt信号通路抑制退变HNPCs的炎症反应和凋亡。

髓核细胞是髓核中的主要细胞类型,能够合成并分泌大量蛋白多糖和Col2a1,并相互交联形成弹性胶状的黏液样基质,维持腰椎间盘的正常生理功能[18]。有研究报道髓核细胞在椎间盘退行性疾病的治疗中发挥了重要作用。Pratsinis等[19]报道多种生长因子在体内和体外均可促进髓核细胞的增殖和合成作用,提高髓核细胞的分泌能力。Okuma等[20]证实将体外培养的髓核细胞注入发生退变的兔纤维环内,能够显著减缓椎间盘的退变程度。此外,也有研究将髓核细胞和多种来源的干细胞共培养,发现髓核细胞可以促进干细胞的类髓核样分化[21]。从这些研究中可以看出,髓核细胞功能的恢复对于椎间盘退行性疾病的治疗具有重要意义。本研究证实BMP9的过表达可以显著改善退变模型中HNPCs的状态,减少应激状态下的炎症反应和凋亡。近期的研究表明,将BMP与其他生长因子联合或联合两种不同的BMP(如BMP2和BMP7联合)的基因疗法可更有效地促进骨形成[22],提示BMP9可以为椎间盘突出等疾病的治疗提供新的方向。

综上所述,本研究表明人为转染BMP9的过表达AAV,可以有效地保护退变状态的HNPCs,为椎间盘突出等疾病的治疗提供新的参考方向和理论依据。

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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201602089
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鲁花, 于露, 甄欢欢, 刘汝银, 岳宗进.
Lu Hua, Yu Lu, Zhen Huanhuan, Liu Ruyin, Yue Zongjin.
骨形态发生蛋白9激活PI3K/Akt信号通路抑制退变髓核细胞的炎症反应和凋亡
BMP9 inhibits inflammatory response and apoptosis of degenerative nucleus pulposus cells through activating PI3K/Akt signaling pathway
第三军医大学学报, 2016, 38(18): 2047-2052
J Third Mil Med Univ, 2016, 38(18): 2047-2052
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201602089

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收稿: 2016-02-25
修回: 2016-05-09

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