2. 400038 重庆，第三军医大学西南医院：全军普通外科中心，全军临床病理学研究所
2. Institute of Pathology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400038, China
胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumor，GIST)起源于胃肠道间质的Cajar细胞，是消化道最常见的间叶组织肿瘤[1]。GIST的主要发病机制是原癌基因c-kit发生功能获得性突变，赋予了细胞恶性增殖的能力，进而产生肿瘤[2]。GIST的治疗策略主要以手术切除为主，但即使在手术完整切除后，仍有约50%的患者在2年内肿瘤复发[3]。目前对GIST在发生c-kit 基因突变后获得高增殖能力的分子机制仍有待于探索，而这也将对其治愈提供帮助。
SCIN是钙离子依赖性细胞骨架调控蛋白，主要表达于分泌细胞[4]。其主要功能是通过对肌动蛋白的切割、加帽等作用调控细胞骨架，进而调控囊泡运输、胞吐等细胞基本活动[5]。近年来，SCIN在肿瘤中的作用被日益发现并引起重视，SCIN的表达上调同膀胱癌对顺铂的抵抗有关[6]，在肺癌[7]和前列腺癌[8]中，SCIN具有促进肿瘤细胞增殖的作用。而在GIST中SCIN对增殖方面的调控作用仍然未知。
本实验中，我们使用慢病毒敲低SCIN以研究GIST细胞在体内和体外环境中增殖能力和克隆形成能力的变化，同时研究了伊马替尼作用于GIST细胞抑制其增殖后SCIN表达的改变，初步探讨了SCIN在GIST细胞中对增殖的调控作用，以期为GIST的治疗提供新的靶点。
1 材料与方法 1.1 实验材料及试剂GIST原代细胞由第三军医大学西南医院普通外科参照文献[9]报道前期构建。DMEM/F12培养基和胎牛血清(FBS)购于Gibco公司，TRIzol、cDNA逆转录试剂盒及qRT-PCR试剂盒购于TaKaRa公司。SCIN干扰慢病毒、SCIN及β-actin引物购于上海立菲生物科技有限公司。小鼠抗人SCIN单克隆抗体购于Santa Cruze公司，小鼠抗人β-actin单克隆抗体和HRP标记 的山羊抗鼠IgG购于碧云天生物技术有限公司，CCK-8 试剂盒购于Sigma公司，青霉素G和链霉素购于Invitrogen公司，Western blot的ECL显影液购于Thermo公司。8只雌性BALB/c裸鼠购于第三军医大学实验动物中心并培养于无病原体环境。甲磺酸伊马替尼购于Sigma公司。
1.2 实验方法 1.2.1 细胞培养GIST细胞培养于含10%FBS的DMEM/F12完全培养液中，放置于37 ℃、5%CO2、95%湿度的细胞培养箱内静置培养，待细胞汇合度达90%时，以1 ∶3传代。根据细胞生长状态，每天换液1次，每2天传代。传代时先去除培养基，使用37 ℃预热的PBS轻轻润洗细胞2次，吸净PBS后，加入胰酶消化液消化细胞，待细胞消化完全后，加入同等体积的含血清完全培养基终止消化。轻轻吹打细胞，将细胞悬液移入离心管，以800 r/min的速度离心5 min。去除上清液，加入完全培养基吹散细胞，将细胞移入新的培养皿中继续培养。
1.2.2 质粒构建及shRNA转染SCIN基因慢病毒载体的构建、鉴定测序、质粒抽提以及慢病毒包装均由上海立菲公司完成。稳定干扰SCIN的shSCIN(shSCIN 1、shSCIN 2)和对照序组(Mock)的序列如下：shSCIN 1 5′-GGAGAAAGGAGCAGAGTATGTAGCA-3′； shSCIN 2 5′-GGAGGTTGATGTTGATGCAAATTCA-3′；Mock 5′-TTACGCGTAGCGTAATACG-3′。转染步骤按说明书进行操作，将干扰SCIN的慢病毒加入汇合度约为50%的GIST细胞培养皿内，孵育8 h后，更换完全培养基，加入3 μg/mL浓度的嘌呤霉素筛选阳性感染细胞。敲低效率由qRT-PCR和Western blot检测，干扰效率达到90%者可用于后续实验。
1.2.3 Western blot 蛋白表达量检测GIST细胞先由PBS润洗，然后由RIPA裂解，裂解后的溶解液于4 ℃，15 000×g离心15 min，收集上清，提取总蛋白。蛋白浓度按BCA法测定。蛋白分离使用10% SDS-PAGE聚丙烯凝胶。分离后，采用半干转30 min转至PVDF膜上，使用5%脱脂奶粉于室温封闭2 h。封闭后孵育小鼠抗人SCIN单克隆抗体(1 ∶1 000)并于4 ℃过夜。二抗于室温孵育2 h，经ECL显影液显色后观察。内参使用β-actin。
1.2.4 总RNA提取及qRT-PCR一定量的GIST细胞经PBS润洗后，加入TRIzol裂解液裂解，并按照说明书要求提取总RNA。测定浓度后，按照说明书使用TaKaRa逆转录试剂盒进行逆转录并进行PCR扩增。SCIN cDNA的上游引物为5′-ATGGCTTCGGGAA-AGTTTATGT-3′，下游引物为5′-CATCCACCATATTGTGCT-GGG-3′，实验以β-actin为内参，其上游引物为5′-TTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′，下游引物为5′-CACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′。用2-ΔΔCt法计算各基因相对表达量。
1.2.5 细胞增殖检测Mock，shSCIN 1，shSCIN 2组 GIST细胞分别按照1000个/孔接种于96孔板，每孔加入0.1 mL含10%FBS的DMEM/F12培养基，于细胞培养箱中培养。分别于第1、2、3、4、5、6、7天时，将培养液换为0.1 mL含10%FBS的DMEM/F12及0.01 mL CCK-8溶液。在37 ℃继续培养1 h后，于450 nm处测定光密度值[D(450)]。
1.2.6 裸鼠皮下成瘤实验Mock及shSCIN 1组GIST细胞经过消化离心收集，以PBS重悬后进行计数。接种时每种分别计数5×105个接种于裸鼠腹股沟处皮下。接种后每天观察移植瘤生长情况，于3周后处死小鼠，取移植瘤标本并称质量。
1.2.7 平板克隆形成实验将处于对数生长期的GIST细胞计数后按照100/孔接种于6孔板中，每种细胞设置3个复孔，每孔加入含10% FBS的DMEM/F12完全培养基2 mL并置于培养箱中继续培养。每3~4天进行换液，于10 d后去除培养基，使用4 ℃预冷的PBS润洗细胞后，加4%多聚甲醛于室温下固定细胞20 min，然后用结晶紫溶液染色5 min。于光学显微镜下计数大于50个细胞的克隆数，并进行统计分析。
1.2.8 伊马替尼IC50测定将WT组GIST细胞分别按照1 000个/孔接种于96孔板，每孔加入0.1 mL含10%FBS的DMEM/F12培养基，放置于细胞培养箱中培养12 h，待细胞贴壁后，加入不同浓度(0.01~10 μmol/L)的伊马替尼，继续培养72 h。细胞存活率的测定按照CCK-8试剂盒说明书进行。抑制率=[D(450)处理组－D(450)空白组]/[D(450)对照组－D(450)空白组]；存活率=1－抑制率；进而计算出药物的IC50。
1.3 统计学方法应用SPSS 17.0统计分析软件，所有数据以x±s表示，移植瘤质量比较和增殖差异比较采用非参数检验，两组比较采用两样本独立t检验。
2 结果 2.1 SCIN慢病毒稳定干扰细胞的建立使用慢病毒敲低GIST细胞中的SCIN后，运用qRT-PCR在RNA水平检测SCIN的敲低效率。 SCIN的RNA表达在对照组(Mock组)和野生型组(wild type，WT组)中SCIN的表达量相似，而shSCIN 1组和shSCIN 2组SCIN的RNA表达量同Mock组相比干扰 效率均高于90%(干扰效率分别为92.94%、91.47%)。 Western blot结果显示，shSCIN 1组和shSCIN 2组shSCIN的干扰效率均较高(图 1)。
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| 1：WT组；2：Mock组；3：shSCIN 1组；4：shSCIN 2组 图 1 Western blot检测SCIN在各组GIST细胞中的敲低效率 |
2.2 敲低SCIN抑制GIST细胞的增殖能力
在SCIN稳定敲低后，我们又使用CCK-8方法检测了GIST细胞的增殖能力，结果显示shSCIN 1组和shSCIN 2组细胞增殖均受到明显抑制，抑制效果从第2～7天差异均有统计学意义(P＜0.05，表 1，图 2)。以上结果表明，敲低SCIN可以明显抑制GIST细胞的增殖能力。
| 培养时间(d) | Mock组D(450) | shSCIN 1组 | shSCIN 2组 | ||
| D(450) | P | D(450) | P | ||
| 1 | 0.108 3±0.008 2 | 0.107 7±0.008 4 | 0.88 | 0.113 3±0.013 1 | 0.88 |
| 2 | 0.157 9±0.013 5 | 0.121 3±0.012 5 | 0.029 | 0.132 0±0.020 3 | 0.029 |
| 3 | 0.322 4±0.044 0 | 0.159 9±0.008 6 | 0.021 | 0.162 2±0.021 1 | 0.021 |
| 4 | 0.685 5±0.032 7 | 0.281 6±0.013 1 | 0.021 | 0.226 1±0.022 7 | 0.021 |
| 5 | 0.920 9±0.045 1 | 0.439 9±0.025 4 | 0.021 | 0.330 0±0.029 2 | 0.021 |
| 6 | 1.053 8±0.039 6 | 0.619 1±0.029 5 | 0.021 | 0.527 9±0.035 2 | 0.021 |
| 7 | 1.117 1±0.041 4 | 0.731 5±0.026 7 | 0.021 | 0.689 9±0.082 0 | 0.021 |
| P值为shSCIN组的D(450)值与当天Mock组D(450)值相比较的差异 | |||||
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| 图 2 CK-8法检测敲低SCIN对各组GIST细胞增殖能力的影响 |
2.3 敲低SCIN抑制GIST细胞移植瘤的生长
我们选取了Mock组和shSCIN 1组GIST细胞进行移植瘤实验，每组细胞分别接种于4只裸鼠。观察发现Mock组最早于第7天出现肉眼可见肿瘤，而shSCIN 1 组最早于第12天出现肉眼可见肿瘤。3周后，所有裸鼠均形成肉眼可见肿瘤。观察发现Mock组肿瘤均大于shSCIN 1组，且Mock组移植瘤质量明显重于shSCIN 1组，差异具有统计学意义[Mock 组vs shSCIN 1组=(0.334 1±0.016 5)g vs (0.175 0±0.045 6)g，P＜0.01，图 3。以上结果表明敲低SCIN可以抑制GIST细胞移植瘤的生长。
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| 图 3 敲低SCIN抑制两组GIST细胞移植瘤的生长 |
2.4 敲低SCIN降低GIST细胞的克隆形成能力
我们检测了WT组、Mock组和shSCIN 1组GIST细胞的克隆形成能力，实验结果表明敲低SCIN显著降低GIST细胞的克隆形成能力(图 4)。shSCIN 1组的克隆形成数为(59.67±5.68)，显著低于Mock组细胞的克隆形成数[(123.33±2.52)，n=3，P＜0.01]。
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| A：WT组；B：Mock组；C：shSCIN 1 组 图 4 敲低SCIN降低各组GIST细胞克隆形成能力 |
2.5 伊马替尼抑制GIST细胞中SCIN的表达
我们首先测定了WT组GIST细胞的IC50值，结果为：IC50=0.57 μmol/L。我们选取了0.57 μmol/L的伊马替尼处理WT组GIST细胞，并分别在第1、3、5天时使用Western blot检测SCIN的表达量(图 5)。结果显示WT组GIST细胞在第1天时仍能够检测到SCIN的表达，第3天时表达明显减弱，第5天时表达更低。以上结果表明伊马替尼处理GIST细胞可以抑制GIST细胞中SCIN的表达。
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| 1：第1天；2：第3天；3：第5天 图 5 estern blot检测伊马替尼处理WT组不同时间GIST细胞SCIN的表达 |
3 讨论
GIST是人类最常见的肉瘤[10]，由于c-kit基因(75%~80%)或PDGFRA基因(＜10%)发生功能获 得性突变[11-12]，导致其编码的受体酪氨酸激酶(RTKs) 表达增高，这是GIST细胞获得恶性生长增殖能力最关键的改变[13-14]。KIT蛋白作为RTK家族的重要成员，其过表达和活化在GIST中最为常见，其在GIST中的活化包括两种形式，第一种是由于c-kit基因发生功能获得性突变而导致KIT蛋白发生非配体依赖性的自身磷酸化，另一种则是配体依赖性的活化[14]。由于两种形式的KIT活化均可以激活PI3K，因此推测GIST中PI3K/AKT通路是激活的，而文献[15]报道也证实了GIST细胞中KIT活化的两种方式均参与调控肿瘤增殖，且主要通过PI3K/AKT通路。但是在c-kit基因突变后，KIT的过表达在产生并维持其恶性增殖方面的作用非常复杂[16]，其中的具体分子机制仍然有待于探索，而掌握调控GIST生长增殖的具体分子机制对GIST的治愈至关重要。
SCIN在调控肿瘤细胞增殖中的作用已日益被发现。在肺癌细胞系A549和H1299中，敲低SCIN可以通过上调Cyclin B1和p21而导致细胞周期停滞于G0/G1期，进而使肺癌细胞的增殖和克隆形成能力降低[7]。而在前列腺癌的PC3细胞系中，敲低SCIN则通过上调p16和p21的表达使细胞周期停滞于G0/G1期，抑制细胞的增殖能力[8]。SCIN在两种肿瘤中均通过p21来调节细胞增殖。据文献[17]报道PI3K/AKT通路的激活会抑制其下游通路中p21的表达，进而使细胞周期由G1期向S期进展，促进细胞的增殖。由此我们推测SCIN在GIST中调控增殖的机制可能与肺癌和前列腺癌类似，敲低SCIN可能通过上调p21的表达，解除GIST细胞中PI3K/AKT通路的活化对p21的抑制作用，使细胞周期停滞，进而抑制细胞的增殖。在我们的实验结果中，敲低SCIN不仅可以抑制GIST细胞的增殖和克隆形成，也能抑制其移植瘤的生长，均与此机制相符，支持这一推论。
RTKs抑制剂伊马替尼能够抑制KIT蛋白的自身磷酸化并高效阻断PI3K/AKT通路，从而抑制GIST细胞的增殖[18-20]。本实验观察到随着伊马替尼作用时间的增加，细胞增殖受到抑制后，SCIN表达在第1、3、5天逐渐降低，这可能是由于SCIN参与PI3K/AKT通路下游关于细胞周期的调控，并可能在细胞周期调控中扮演功能性分子，在伊马替尼抑制GIST细胞的增殖后，其表达也随增殖能力的降低而降低，但是其中具体机制仍有待于探索。
结合我们的实验结果，我们认为SCIN在GIST肿瘤组织中具有调控细胞增殖的作用，其对增殖的调控可能是作为PI3K/AKT下游通路中的功能性分子而参与对细胞周期的调控。值得注意的是，在伊马替尼抑制了GIST细胞的增殖后，SCIN的表达亦随之降低，因而可以认为SCIN不仅参与调控GIST细胞的增殖，也可以反映伊马替尼对GIST细胞增殖的抑制程度，其在GIST细胞中的表达量与其增殖能力具有较强的相关性。而在GIST中，如果针对SCIN作为治疗靶点，或许可以抑制肿瘤细胞的增殖能力，进而抑制肿瘤生长及复发。但是相关研究仍有待于进一步探索。
总之，我们的实验证明了敲低SCIN能够显著抑制GIST细胞的克隆形成能力和在体内及体外的增殖能力，伊马替尼在抑制GIST细胞增殖的同时也可降低SCIN的表达。我们的研究加深了SCIN在GIST中作用的认识，同时也丰富了GIST细胞增殖和伊马替尼对其作用机制的认知。我们认为SCIN或许可以作为伊马替尼对GIST细胞增殖的抑制程度的反映指标或成为GIST的治疗靶点。
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