2. 400030 重庆，重庆大学计算机学院 ;
3. 402560 重庆 铜梁，解放军77128部队 ;
4. 100080 北京，中国科学院计算技术研究所
2. College of Computer, Chongqing University, Chongqing, 400030 ;
3. No. 77128 Troop of PLA, Tongliang, Chongqing, 402560 ;
4. Institute of Computing Technology, Chinese Academy of Sciences, Beijing, 100080, China
埃博拉病毒病是由埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)感染引起的一种烈性传染病，主要以人和非人类灵长类动物易感，致死率高达25%～90%[1-3]。临床以发热及出血为主要特征，表现为急性起病、发热、肌痛、出血、皮疹和以肝、肾为代表的多器官损伤[4]。EBOV属于丝状病毒科(Filoviridae) 埃博拉病毒属(Ebolavirus)，有囊膜，为不分节段单链负股RNA。 EBOV 基因组长约19 kb，含有7个基因，其排列顺序为3′-NP-VP35-VP40-GP/sGP-VP30-VP24-L-5′。EBOV可分为5个亚型：扎伊尔埃博拉病毒(Zaire-EBOV)、苏丹埃博拉病毒(Sudan-EBOV)、本迪布焦埃博拉病毒(Bundibugyo-EBOV)、 塔伊森林埃博拉病毒(Tai Forest-EBOV) 和雷斯顿埃博拉病毒(Reston-EBOV)[5]。其中ZEBOV、SEBOV和BEBOV对人具有致命性，又以ZEBOV 致死率最高[2]。EBOV实验室确诊手段常用的方法有病毒分离培养，但存在盲目性且操作复杂敏感度不高；IgG-捕获ELISA和IgM-捕获ELISA[6-7]，但临床存在窗口期，不能在发病早期快速检出EBOV；荧光定量PCR具有快速、敏感、定量的特点，但之前针对EBOV的荧光定量PCR检测方法，大都针对ZEBOV和苏丹型EBOV糖蛋白设计通用探针引物[8-9]，无法区分型特异性。因此，本研究通过比对运算求得ZEBOV 型特异性核酸序列，设计引物探针建立了敏感、特异的ZEBOV荧光定量PCR检测方法。
1 材料与方法 1.1 主要仪器与试剂荧光定量PCR仪 ( Rotor-Gene Q，德国QIAGEN公司)；荧光定量PCR试剂购自宝生物(大连) 工程有限公司(TaKaRa One Step PrimeScript RT-PCR Kit)；样本核酸提取试剂购自德国QIAGEN公司(QIAamp Viral RNA Mini Kit)。
1.2 阳性模板合成从参考序列[10]中截出特异性核酸序列(KJ660348,11331-) 英潍捷基(上海)有限公司合成目标片段，构建质粒作为阳性模板。
1.3 引物与探针的设计、合成通过GenBank数据库，下载2014年从西非患者分离的3株ZEBOV株(KJ660348、KJ660347、KJ)[10] 及1976年从Mayinga分离的ZEBOV株(NC_) 并以此为目标，依托中国科学院计算技术研究所的Lambda-ICT系统，运用MUMmer软件进行匹配，再以匹配上的序列区段为基础，基于Insignia算法“同种求交”、“异种求并”，得到标签核酸序列，最后再通过BLAST与Nt库比较，筛选出最终的特异核酸标签[11]。从中选出一条序列(KJ660348,11331-11514，非编码区)交由英潍捷基(上海)有限公司设计合成TaqMan探针、引物，探针的5′端用荧光基团VIC标记，3′端用淬灭基团TAMRA标记(表 1)。
| 引物和探针 | 序列(5′→3′) | 长度(bp) | GC(%) | Tm 值(℃) |
| 正向引物 | CTTCCTCAAGCTTTTTTCTTAACCTACT | 28 | 36 | 58.4 |
| 反向引物 | TCACTAGAAATCCAATATACGAAATGGT | 28 | 32 | 58.5 |
| ZEBOV 探针 | VIC-TGAAACCTAACACACATGACCTGCGGG-TAMARA | 27 | 52 | 69.2 |
1.4 标准曲线的制备
由英潍公司提取交付的阳性质粒浓度为102.6 ng/μL，根据合成序列的A、T、G、C含量计算出其摩尔质量，乘以阿伏伽德罗常数6.02×1023得到病毒拷贝数，再用DEPC水作10倍系列稀释[12]，得5×107、5×106、5×105、5×104、5×103、5×102 、5×101拷贝/μL系列标准模板，采用优化好的条件进行扩增标准模板，得到各自的Ct值。以Ct值为纵坐标，起始模板浓度的对数为横坐标，制作扩增曲线和标准曲线。
1.5 准确性和重复性实验取5×106、5×105、5×104拷贝/μL 3个批次的质粒标准品，同一批次下每个样本作3次重复，再在同一反应条件下做3次重复实验，计算Ct值批内、批间变异系数(CV)。
1.6 特异性检测在相同条件下，以上海生工合成的本迪布焦EBOV、科特迪瓦EBOV、莱斯顿EBOV、苏丹EBOV、马尔堡病毒、西尼罗河热病毒、东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒相应区段非编码基因作对照，并随机选择本院感染科、呼吸科、血液科、普外科等科室19例住院患者的痰液或粪便复杂样本RNA、重庆市公共卫生中心住院患者10例痰涂阳性痰液样本DNA、大学城19例不明原因发热患者咽拭子样本RNA作为阴性对照。
2 结果 2.1 引物与探针浓度优化和扩增反应条件用5×107、5×106拷贝/μL阳性质粒模板，优选引物与探针的最佳浓度。结果表明，用0.2 μm/μL的引物和0.4 μm/μL的探针对阳性质粒检测所获结果最优。优化的荧光定量PCR循环条件为：42 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s ，72 ℃ 30 s，40个循环。
2.2 标准曲线的建立及荧光定量PCR灵敏性10倍系列稀释阳性模板质粒进行扩增，建立扩增曲线及标准曲线，标准品范围选5×107、5×106、5×105、5×104、5×103、5×102、5×101拷贝/μL。结果显示，阳性模板质粒拷贝数与相应Ct值相关系数R2＞0.99，该方法的灵敏性达到5×101拷贝(图 1)。
|
| A：扩增曲线；B：标准曲线 图 1 ZEBOV阳性质粒扩增曲线与标准曲线 |
2.3 荧光定量PCR的准确性和重复性
批内重复实验：取5×106、5×105、5×104拷贝/μL 3个批次的标准样品，每份样品做3个重复。批间重复实验：对上述3个批次标准样品，在同一反应条件下进行3次独立的荧光定量PCR检测。根据Ct算术平 均值计算CV，批内CV为0.88%～2.50%，批间CV为1.75%～3.31%。见表 2。
| 样本 | 批内重复实验 | 批间重复实验 | ||||||||||
| Ct 值 | CV(%) | Ct 值 | CV(%) | |||||||||
| 1 | 2 | 3 | x±s | 1 | 2 | 3 | x±s | |||||
| 5×106 | 21.84 | 21.94 | 20.96 | 21.58±0.54 | 2.50 | 21.45 | 21.79 | 21.00 | 21.41±0.40 | 1.85 | ||
| 5×105 | 26.69 | 26.75 | 26.26 | 26.57±0.27 | 1.01 | 25.85 | 25.88 | 24.41 | 25.38±0.84 | 3.31 | ||
| 5×104 | 30.05 | 29.55 | 29.66 | 29.75±0.26 | 0.88 | 30.27 | 30.79 | 29.73 | 30.26±0.53 | 1.75 | ||
2.4 荧光定量PCR的特异性
以合成的本迪布焦EBOV、科特迪瓦EBOV、莱斯顿EBOV、苏丹EBOV、马尔堡病毒、西尼罗河热病毒、东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒相应非编码区段重组质粒，及临床48例标本进行荧光定量PCR检测。以浓度为5×107、5×106拷贝/μL的质粒为阳性对照，再设阴性对照。结果见图 2，除ZEBOV阳性质粒有荧光响应起跳外，其余均无荧光起跳为阴性。
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| A：8种相似病毒对照；B：粪便、痰液RNA检测对照；C：痰液DNA、咽拭子RNA检测对照 图 2 8种相似病毒及48例临床样本对照特异性扩增曲线 |
3 讨论
以往的EBOV核酸检测，大多针对保守糖蛋白或核蛋白作为靶向目标设计探针引物，且方法多为在GenBank上下载多条序列，进而设计通用引物和探针[13-15]。而本研究通过以2014年从西非患者分离的3株ZEBOV株及1976年从Mayinga分离的ZEBOV株全序列为目标，依托中国科学院计算技术研究所超级计算平台，运用相应软件采用同种求交异种求并的方法，得到特异性标签核酸序列[11]。最后选出一条非编码区序列设计成探针引物进行验证，探求一条创新路径。本研究对阳性质粒7个稀释度样品进行扩增，结果显示，起始浓度与Ct值之间具有良好的线性关系，标准曲线相关系数＞0.99，表明阳性样品稀释准确且体系稳定高效。特异性检测中，48份临床标本及合成的8种病毒相关序列，仅阳性质粒样品为阳性，表明该探针特异性好。且本方法检测下限达到5×101拷贝，具有良好的灵敏性。
综上，本研究采用Insignia算法比对出核酸标签序列特异性强，设计TaqMan探针和引物建立的荧光定量PCR方法，灵敏度高、稳定性好，为ZEBOV的快速定性诊断提供了一种新方法，为EBOV病快速临床分子诊断研究提供了一种新的核酸探针区段选择思路。
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