2. 400014 重庆，重庆医科大学附属儿童医院：儿童发育疾病研究省部共建教育部重点实验室
2. Key Laboratory of Developmental Disease in Childhood of Ministry of Education, Children’s Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, 400014, China
心脏发育是一个极其复杂的过程，整个过程依赖一系列心脏发育核心转录因子如GATA4、MEF2C、Nkx2.5、Tbx5等的精确调控[1-2]。GATA4在心脏发育早期便开始表达，其缺失、突变、表达异常均将导致先天性心脏病的发生。
CBP/P300作为组蛋白乙酰化酶的两个亚型，广泛表达于多种组织，并介导组蛋白的乙酰化修饰，参与基因表达调控。CBP/P300可在心肌祖细胞中表达，且其活性受到抑制后可导致多种心脏发育核心转录因子表达的降低[3-4]，提示CBP/P300可能通过介导组蛋白乙酰化修饰参与调控GATA4的表达。为验证这一科学假说，本研究利用小鼠胚胎心脏组织研究正常胚胎心脏发育过程中GATA4的时序表达及其基因启动子区组蛋白H3K9乙酰化修饰水平的变化规律，并利用CBP/P300的特异性抑制剂CBP30干预心肌祖细胞，证实CBP/P300介导的组蛋白H3K9乙酰化修饰可调控GATA4的表达，通过探讨其具体作用机制，为进一步阐明胚胎心脏发育过程中GATA4的表观遗传调控网络奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物成年健康SPF级昆明小鼠，由重庆医科大学实验动物中心提供。实验细胞：心肌祖细胞，由美国芝加哥大学分子肿瘤实验惠赠[5]。
1.1.2 主要试剂高纯度总RNA提取试剂盒(百泰克，北京)，Real-time PCR逆转录试剂盒(TaKaRa, 日本)，SYBR Green试剂盒(KAPA，美国)，CHIP试剂盒(Abcam，英国)，核染色质提取试剂盒(Abcam，英国)，CBP30(Selleck，美国)，CHIP级抗H3K9ac抗体、抗CBP抗体(Abcam，英国)，CHIP级抗P300抗体(Millipore，英国)，胎牛血清和DMEM-F12培养基(HyClone，美国)，胰蛋白酶(Gibco，澳大利亚)，荧光定量PCR仪(Bio-Rad，美国)，超声仪(Diagenode, 美国)。
1.2 方法 1.2.1 胎鼠心脏标本提取下午5：00按雌 ∶雄=2 ∶1 合笼，次日早上检查阴栓，以观察到阴栓者计为胎龄0.5 d(E0.5) 。用二氧化碳处死孕鼠，取E11.5到新生0.5 d胎鼠心脏，并冻存于-80 ℃冰箱中。
细胞培养及干预：复苏心肌祖细胞，所用培养基为含10%胎牛血清和1%青霉素的DMEM/F12培养基，在CO2浓度为5%的37 ℃恒温培养箱中培养。在6孔板和直径100 mm培养皿中干预心肌祖细胞，分为空白对照组(正常对照组)，阴性对照组(DMSO组)和处理组(CBP30组)，其中处理组又分为不同浓度组(0.5、1、2 μmol/L和4 μmol/L)和不同时间组(6、12、24 h和36 h)。
1.2.2 总RNA提取及cDNA合成取E11.5到新生0.5 d胎鼠心脏组织50 mg于1.5 mL EP管中，加入1 mL组织裂解液，放入组织匀浆器中匀浆5 min，按照RNA提取试剂盒说明书操作，提取心脏组织总RNA。CBP30干预心肌祖细胞后，向6孔板中加入1 mL 组织裂解液，按照RNA提取试剂盒说明书操作，提取细胞总RNA。经核酸蛋白测定仪测定D(260) /D(280) 比值确定总RNA浓度，取800 ng RNA按照TaKaRa逆转录试剂盒操作说明将RNA逆转录为cDNA，反应体系为20 μL，反应条件为：42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存，所得cDNA冻存于-20 ℃备用。
1.2.3 染色质免疫共沉淀(CHIP)分别取E11.5、 E14.5、E17.5胎鼠心脏组织50～70 mg，1%甲醛交联；对培养在100 mm培养皿中的心肌祖细胞进行CBP30干预后(2 μmol/L，6 h)，1%甲醛对细胞进行交联。用超声破碎仪切割DNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测，使切割的DNA片段长度在200~1 000 bp之间。分别用CHIP级抗H3K9ac、P300、CBP抗体进行染色质免疫共沉淀，得到的纯化DNA冻存于-20 ℃备用。
1.2.4 实时荧光定量PCR(Q-PCR)分别以RNA逆转录产物cDNA和CHIP产物纯化DNA为模板进行Q-PCR反应，按SYBR Green说明书进行操作。Q-PCR反应体系为10 μL(2×SYBR qPCR Master Mix solution：5 μL，正向引物：0.1 μL，反向引物：0.1 μL，DNA模版：1 μL，ddH2O：3.8 μL)。引物均由Primer Premier 5软件设计，由上海生工生物工程股份有限公司合成。GATA4基因引物序列为：上游 5′-CCCTCCCGCAC-GATTTCT-3′，下游 5′-AGAGGCCCAACTCGCTCAA-3′；β-actin基因引物序列为：上游 5′-CACACCCGCCACCAGTTCG-3′，下游 5′-GTCCTTCTGACCCATTCCCACC-3′；GATA4基因启动子区引物序列为：上游 5′-CACTGACGCCGACTCCAAACTAA-3′，下游 5′-CGACTGGG-GTCCAATCAAAAGG-3′。Q-PCR反应条件为：预变性95℃ 2 min，变性95 ℃ 10 s，退火60 ℃ 10 s，延伸72 ℃ 15 s，45个循环，每个样品均重复3次。所得数据由实时荧光定量PCR仪自带基于pfaffl原理的相对定量数据分析软件分析。
1.3 统计学分析采用SPSS 17.0统计软件，所有数据以x ±s表示，采用单因素方差分析进行组间比较，P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 心脏发育核心转录因子GATA4在小鼠胚胎心脏发育过程中的动态表达水平GATA4在胚胎心脏发育过程中呈由低到高的动态表达，GATA4 mRNA表达水平，E14.5组高于E11.5组，两两比较差异具有统计学意义(P＜0.05，图 1)。
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| 1：E11.5组；2：E12.5组；3：E13.5组；4：E14.5组；5：E15.5组；6：E16.5组；7：E17.5组；8：E18.5组；9：新生0.5 d组 a：P＜0.05，与E11.5组比较 图 1 RT-PCR检测小鼠胚胎心脏发育过程中GATA4 mRNA时序表达水平 |
2.2 胚胎心脏发育过程中GATA4启动子区组蛋白H3K9ac水平及与CBP/P300结合水平
CHIP-QPCR结果显示，E14.5组(1.168 0±0.073 4) GATA4启动子区抗H3K9ac抗体的CHIP沉淀DNA量明显高于E11.5组[(0.813 6±0.018 9) ，P＜0.05]。E14.5组抗P300(1.822 2±0.304 7) 和抗CBP抗体(1.382 2±0.124 3) 的CHIP沉淀DNA量明显高于E11.5组[分别为(0.978 7±0.036 9) 、(0.879 4± 0.171 6) ，P＜0.05]。
2.3 CBP30干预心肌祖细胞对GATA4表达的影响经RT-PCR检测，不同浓度(0.5、1、2、4 μmol/L)CBP30分别使心肌祖细胞GATA4表达量较正常对照组降低，且以2 μmol/L降低最明显(P＜0.05，图 2A)。2 μmol/L CBP30干预心肌祖细胞6、12、24、36 h后，GATA4表达量较正常对照组降低，且以6 h降低最明显(P＜0.05，图 2B)。
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| A：RT-PCR检测不同浓度CBP30处理心肌祖细胞后GATA4 表达水平 1：DMSO组；2：正常对照组；3：0.5 μmol/L CBP30组；4：1 μmol/L CBP30组；5：2 μmol/L CBP30组；6：4 μmol/L CBP30组；B：RT-PCR检测不同时间CBP30处理心肌祖细胞后GATA4表达水平 1：DMSO组；2：正常对照组；3：6 h组；4：12 h组；5：24 h组；6：36 h组 a：P＜0.05，与正常对照组比较 图 2 RT-PCR检测CBP30处理心肌祖细胞后GATA4表达情况 |
2.4 CBP30干预心肌祖细胞后GATA4启动子区组蛋白H3K9ac水平及与CBP/P300结合水平
CHIP-QPCR结果显示，CBP30组GATA4启动子区抗H3K9ac抗体的CHIP沉淀DNA量明显低于正常对照组(P＜0.05，图 3)。CBP30组抗P300和抗CBP抗体的CHIP沉淀DNA量明显低于正常对照组(P＜0.05，图 4)。
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| 1：DMSO组；2：正常对照组；3：CBP30组 a：P＜0.05，与正常对照组比较 图 3 CHIP-QPCR检测心肌祖细胞中GATA4启动子区组蛋白H3K9ac水平 |
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| 1：DMSO组；2：正常对照组；3：CBP30组 A：CHIP-QPCR检测GATA4启动子区与CBP结合水平；B：CHIP-QPCR检测GATA4启动子区与P300结合水平 a：P＜0.05，与正常对照组比较 图 4 CHIP-QPCR检测心肌祖细胞中GATA4启动子区与CBP/P300结合水平 |
3 讨论
先天性心脏病是人类最常见的出生缺陷性疾病，报道显示，全球每1 000个新生儿中，有10~12个患有先天性心脏病[6]。在众多的先天性心脏病患儿中，发生基因突变或染色体变异的仅占20%，其余80%患儿的基因与染色质无异常，提示表观遗传修饰在很大程度上影响着心脏发育[7]。研究表明，胚胎期间GATA4 的缺失或突变均可引起心脏发育异常[8-9]，而胚胎后期或生后GATA4失活，则可引起严重心功能缺陷，导致心衰发生[10]。本研究发现，GATA4表达量在胚胎心脏发育早期和中期随着心脏发育成熟而增加，在E14.5天达到峰值，文献[11]报道此时心脏正处于腔室特化和生长期，表明GATA4与心脏发育成熟密切相关。本研究还发现，随着GATA4在胎鼠心脏中表达量增加，GATA4启动子区组蛋白H3K9ac水平及与CBP/P300结合水平也随之升高，提示GATA4在胎鼠心脏中表达可能受到组蛋白H3K9和CBP/P300的调控。GATA4的正确时序表达及正常活性是心脏结构发育及功能维持的基础。表观遗传是调控基因时序表达的主要机制[12]，但针对GATA4的具体表观遗传调控方式尚不清楚。
组蛋白乙酰化修饰由组蛋白乙酰化酶催化，可使染色质的空间结构变得疏松, 利于基因表达。CBP/P300属于组蛋白乙酰化酶的两个亚型，广泛参与各种组蛋白的乙酰化修饰。如抑制P300的乙酰化酶活性可降低组蛋白H3乙酰化水平[13]。本课题组前期研究发现，用酒精干预孕鼠可提高胎鼠心肌细胞中组蛋白H3K9的整体乙酰化水平，促进GATA4表达，表明组蛋白H3K9的乙酰化修饰对GATA4的表达有调控作用，但其具体调控机制不清。本研究从介导组蛋白乙酰化修饰的CBP/P300入手，通过使用CBP/P300特异性抑制剂CBP30干预心肌祖细胞。CBP30可竞争性与CBP/P300的布罗莫结构域结合[14]，阻碍CBP/P300与其辅助因子CREB结合形成转录复合物，从而抑制CBP/P300与基因启动子区结合。本研究发现，在CBP30干预组，伴随心肌祖细胞GATA4表达量的下降，GATA4启动子区的CBP/P300结合水平明显降低，表明CBP/P300在GATA4启动子区受到了抑制，而此时GATA4启动子区组蛋白H3K9乙酰化水平也有显著降低。上述结果表明CBP/P300可通过介导启动子区组蛋白H3K9乙酰化调控GATA4的表达。
本研究明确了GATA4在小鼠胚胎心脏发育过程中的时序表达趋势，从表观遗传学组蛋白乙酰化修饰的角度探讨了GATA4的调控机制，为GATA4异常表达导致的心脏发育障碍提供了新的治疗靶点。
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