异基因造血干细胞移植(allogeneic stem cell transplantation，allo-HSCT)是可治愈血液系统恶性肿瘤的手段。然而，复发仍是导致移植失败的主要原因。且复发难治病例疗效差，病死率高，仍是临床面临的难题。移植后密切监测微小残留病灶(minimal residual diseases，MRD)可早期发现疾病复发，通过减停免疫抑制剂或供者淋巴细胞输注等处理，常可使患者再次达分子生物学缓解。但是，治疗后反应率低及急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-host disease，aGVHD)是导致治疗失败的主要原因。细胞因子诱导的杀伤(cytokine induced killer，CIK)细胞是一组以CD3⁺CD56⁺ T细胞为主要效应细胞的异质细胞群，可通过非特异性免疫杀伤作用清除肿瘤患者体内微小残留病灶^[1]。传统的DLI效果并不理想，allo-HSCT后联合供者型CIK细胞治疗复发难治血液肿瘤国内外已有报道^[2-3]。本研究就10 例在allo-HSCT后出现分子生物学复发(7例)以及形态学复发(3例)后经减停免疫抑制剂、化疗、供者淋巴细胞输注等治疗后形态学缓解，但MRD仍阳性的患者，输注供者型CIK细胞，并对其进行安全性及有效性的研究。

1 资料与方法 1.1 病例资料

收集我科2012年11月至2015年11月共10例患者，其中男性9例，女性1例，中位年龄24.5(10~41)岁。急性淋巴细胞白血病5例，急性髓系白血病4例，慢性粒单细胞白血病1例。移植前复发或未达完全缓解(complete remission，CR)6例，CR4例(其中2例 CR1、2例CR2)。具体患者特征见表 1。

1.2 移植方式

9例均为清髓性骨髓+外周血allo-HSCT，1例为清髓性非血缘脐血移植。单倍体移植6例，同胞全相合移植2例，同胞7/10相合1例，非血缘脐血全相合1例。急性淋巴细胞白血病患者预处理方案为TBI/Cy：TBI+CTX+ATG，急性髓系白血病及慢性粒单细 胞白血病患者预处理方案为改良的Bu/Cy：Bu+CTX+ Ara-C+ATG。

1.3 移植后复发及治疗

移植后每月行骨髓形态、活检，并通过流式细胞仪或PCR监测MRD。分子生物学复发经减停免疫抑制剂或供者淋巴细胞回输(donor lymphocytes infusion，DLI)治疗，骨髓形态学复发患者行减停免疫抑制剂、化疗、化疗+DLI治疗，治疗后评估疗效，形态学缓解但仍MRD阳性患者行CIK治疗。

1.4 CIK细胞采集、扩增及检测

采集供者外周血单个核细胞悬液80~120 mL，脐带血移植患者采集的是移植后患者的外周血(完全植入，供者型)。分离并洗涤后，调整细胞密度至 1×10⁶/L，转移至培养瓶中，加入适量RPMI1640培养液、 自体血浆和细胞因子IL-2、IFN-γ、OKT3成为细胞悬液，在37 ℃、5% CO₂条件下悬浮培养，于培养第4、7、10、13 天分别调整细胞密度，补充IL-2，同时进行细胞表型分析。培养结束后，流式细胞仪通过检测细胞的表面标志物鉴定CIK细胞的表型；并于细胞回输前计数CIK细胞；同时进行细菌、真菌学检测。

1.5 CIK细胞回输

CIK细胞自培养基收集后制成细胞悬液，6 h内回输，输注时间30 min左右。回输时行CIK 细胞表型鉴定、细胞活力检测及细胞计数。于培养第10~14天通过静脉途径回输。

1.6 不良反应及疗效观察

所有患者治疗前常规检查血常规、肝肾功能及心电图，治疗过程中严密监测患者心率、血压及血氧饱和度监测，发热时给予物理降温。治疗每个月随访血常规、肝肾功及微小残留病灶和骨髓形态、活检。

2 结果 2.1 移植后复发及治疗

10例患者大部分原发病为复发难治性，移植后均达血液学和分子生物学缓解，规律监测MRD。7例出现分子生物学复发，经DLI或减停免疫抑制剂治疗后MRD仍为阳性。3例患者形态学复发，其中1例因复发时仍有明显胃肠道GVHD，减停免疫抑制剂后原始粒细胞自10.5%下降至4%，达形态学缓解，未进一步化疗及DLI等治疗；另2例分别给予化疗、化疗+DLI后达完全缓解，但3例患者MRD阳性。CIK细胞治疗前所有患者均为形态学完全缓解，但MRD阳性。

2.2 细胞表型检测和细胞计数CIK

输注前的CIK细胞经过流式细胞仪检测，其表面标志物分别为(90.4±7.0)%CD3^＋、(71.2±6.6)%CD3^＋CD8^＋、(18.1±5.8)%CD3^＋CD56^＋、(72.3±7.2)%CD3^＋CD56^-、(5.5±4.4)%CD3^-CD56^＋(10位供者的均值)。10例患者输注2~8次不等供者CIK 细胞，平均每月输注1次。CIK细胞的回输数量为(1.35~7.23)×10⁹/kg，中位回输数量为(4.32±1.73)×10⁹/kg。

2.3 CIK输注不良反应

2例患者出现输注热，发生于输注后3 h及4 h，体温分别为38.7 ℃及39.3 ℃，持续4 h左右，经物理降温并使用解热药后热退，观察3 d，无反复。4例患者出现Ⅰ度皮肤及黏膜aGVHD，均出现于第2次输注之后，经常规抗GVHD处理后得到控制。1例患者输注4次后出现Ⅰ度 皮肤aGVHD，加用免疫抑制剂后控制，随后出现MRD阳性，再次减停免疫抑制剂后MRD转阴，但出 现Ⅳ度 皮肤、肝脏及消化道GVHD，最终死亡。

2.4 CIK细胞治疗反应

截至2015年11月，移植后中位随访时间21(9~34)个月，中位生存时间18(9~31)个月，中位无病生存时间10.5(4~20)个月。输注CIK中位次数3(2~8)次，直至MRD转阴或形态学复发后停止输注。1例输注2次无效，MRD持续阳性，最终形态学复发死亡。9例患者MRD转阴，评价为有效。其中1例10个月后再次复发死亡，1例因MRD再次阳性减停免疫抑制剂后出现重度GVHD死亡，另7例患者无病存活。输注CIK后中位随访时间为10(3~14)个月，中位生存时间8(3~14)个月，中位无病生存时间8(0~14)个月，其中5例患者输注CIK后的无病生存期长于移植后的无病生存期。见表 2。

3 讨论

异基因造血干细胞移植后复发是治疗失败的主要原因，预后极差。移植后出现MRD的患者形态学复发风险大。Kroger等^[4]研究表明急性白血病患者在异 基因造血干细胞移植后MRD阳性，其复发率是25%~ 90%。因此，在allo-HSCT后规律监测MRD至关重要^[5]，可及早通过减停免疫抑制剂、DLI等提高移植物抗白血病效应来中止复发进展。但是，AML、ALL患者在allo-HSCT后复发时撤停免疫抑制剂，再次缓解率低，且有增加GVHD的风险。DLI是一种主要的治疗策略，已被证明对移植后复发的恶性血液病患者有效，其中对CML 复发患者的疗效最好，其次为AML，但是对淋巴系统恶性肿瘤如ALL患者的疗效较弱^[6]。且这种形式的被动性免疫治疗可以产生显著的毒性，急性GVHD和骨髓发育不全是治疗后死亡率高的主要原因，这一定程度限制了DLI的临床应用。

CIK细胞是一组体外扩增的CD3⁺T 细胞，但同时有NK细胞标记如CD56⁺和NKG2D，因此兼具T 淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和NK 细胞的非MHC限制性杀瘤特性^[1]。有研究证实，CIK 细胞可通过多种途径杀伤肿瘤细胞^[7-8]，且可能不会产生类似供体淋巴细胞输注所导致的严重GVHD^[9]。近年来，有学者研究CIK 细胞在动物骨髓移植模型中的作用，结果显示，CIK细胞在体内具有明确的抗肿瘤活性，且移植物抗宿主病(GVHD)更轻，提示在移植术后维持治疗方面有较好的应用前景^[10-11]。陈林等^[2]分析了11 例接受allo-HSCT 以及CIK 细胞输注的恶性血液病患者，治疗后其原发肿瘤均获完全缓解，4例患者移植后2~4 个月再次复发，其中3例经供者CIK 输注、停用免疫抑制剂后重获完全缓解，治疗后中位生存时间9(2~53) 个月。Laport等^[3]对18例移植后复发患者输注CIK细胞治疗，仅2例患者出现Ⅰ~Ⅱ度aGVHD，1例患者出现局限性cGVHD。5例患者输注CIK后的缓解期比异基因造血干细胞移植后更长。说明CIK细胞治疗耐受性良好，诱发GVHD风险小，且对高危患者有增强移植物抗白血病(graft versus leukemia，GVL)的作用。

目前，大部分中心在移植后MRD阳性时通过迅速减停免疫抑制剂或预防性DLI，可使患者再次达到分子生物学缓解。本研究10例患者中，大部分患者原发病为复发难治性，移植后均达分子生物学缓解。但预计移植后复发风险高，规律监测MRD，在分子生物学及形态学复发后，采用减停免疫抑制剂、DLI、化疗或化疗+DLI等处理后，形态学完全缓解，MRD阳性。考虑继续DLI 治疗可能会导致严重的GVHD，尤其是在单倍体移植患者中，发生重度GVHD的概率更高，故尝试进行了供者型CIK细胞治疗。治疗后大部分患者无病生存期长，复发率明显低于文献^[12]报道。1例患者系异基因干细胞移植后形态学复发，该情况在国内外报道中均属难治病例，减停免疫抑制剂后虽达完全缓解，但原始粒细胞比例仍高，仅通过单纯供者CIK 细胞输注再次得到分子生物学缓解，在减停免疫抑制剂前未出现明显并发症，可见CIK治疗疗效确切，安全性高。但3个月后MRD再次阳性，说明CIK细胞作用持续时间短，需反复输注。本组研究病例也提示，供者CIK 细胞输注有助于延长异基因干细胞移植术后无病生存时间，减少血液学复发率，但病例数偏少，其疗效仍需进一步验证；而另1 例患者治疗无效，估计与肿瘤细胞负荷过大有关。本研究中2 例患者在初次输注CIK 细胞后3~4 h出现寒战、发热症状，可能与细胞液中含有IL-2 等细胞因子有关，经对症处理后均好转。

本研究表明，虽然部分患者输注CIK 细胞后出现了GVHD，但程度轻，治疗后迅速缓解。因此，异基因造血干细胞移植后出现复发的患者经治疗后MRD仍阳性，输注体外培养的供者CIK 细胞防治高危组血液肿瘤移植后复发的这种新方法有一定可行性。

综上所述，CIK 细胞治疗不良反应小、安全、患者耐受性好，因此被广泛应用于肿瘤化疗后进一步清除MRD，减少血液学复发率，成为造血干细胞移植后维持治疗较为理想的选择。但本研究由于病例数较少，未进行肿瘤病种分类、危险分层、移植后形态学复发与分子生物学复发之间CIK治疗的疗效差异等分析，但经过长期随访观察到疗效较好，可进一步扩大病例数及延长随访时间来观察疗效。