急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一类造血干/祖细胞的恶性克隆性疾病，是成人急性白血病中最常见的类型。随着新的治疗手段的发展，约有80%的AML患者能获得初治血液学完全缓解，余下的20%仍然是临床治疗的难题，其治疗反应与患者年龄、体能状态、染色体核型、白细胞计数、细胞遗传学异常等密切相关。有报道指出尿激酶纤溶酶原激活物(urokinase type plasminogen activator,uPA)蛋白在多种肿瘤患者血清中高表达，参与肿瘤的发生、发展、浸润转移、血管生成及化疗耐药等，导致肿瘤患者的不良预后^[1-2]。在AML患者血清中，uPA蛋白的表达水平也较正常对照组明显升高，该蛋白不仅参与了白血病细胞的髓外浸润转移，还与AML患者出血并发症的发生密切相关^[3]。然而，uPA蛋白与AML预后之间的关系至今仍不明确。本研究采用双抗体夹心ELISA方法检测初治AML患者血清uPA蛋白表达量，探讨uPA蛋白与预后不良AML的关系，希望为AML患者带来新的预后判断标志。

1 材料与方法 1.1 研究对象及分组

收集第三军医大学新桥医院全军血液病中心2014年10月至2015年8月住院的初诊AML(非急性早幼粒细胞白血病)患者45例，年龄14~66(39.68±2.60)岁，包括男性21例、女性24例。其中25例为预后不良组(含M1、M6 各3 例，M2、M4各7 例，M5 5例)，10例为预后中等组(含M2 5例，M4、M5各2例，M6 1例)，10例为预后良好组(含M2 6例，M4、M5各2例)。记录其临床资料并收集其初始治疗前血清，另外从到本院体检的健康人群中(指血常规、肝肾功、电解质、血糖、血脂等均正常)选取10名志愿者，年龄23~48(36.2 ±8.6)岁，男性6名、女性4名。所有研究对象均知情同意。对以上45例初诊的AML患者采用MA、TA、TAE(M: 米托蒽醌,A: 阿糖胞苷,T: 吡柔比星,E: 依托泊苷)为主的方案化疗。初始化疗未缓解的患者，根据骨髓原始细胞下降比例(marrow blast decrease index，MBDI)继续选择原方案或者调整其它方案化疗，包括FLAG方案[FI:氟达拉滨，A:阿糖胞苷，G:粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)]，CEAG方案(C:阿克拉霉素，E:依托泊苷，A:阿糖胞苷，G:G-CSF)。所有患者诊断及预后分层参照成人急性髓系白血病(非急性早幼粒细胞白血病)中国诊疗指南(2011年版)^[4]和张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》^[5]。

1.2 主要试剂和仪器

Human uPA ELISA Kit购自美国RayBiotech公司,酶标仪为美国Thermo公司生产的Varioskan Flash酶标仪。

1.3 标本采集与保存

采用非抗凝管抽取初治AML患者和健康志愿者外周静脉血3 mL,室温放置30~60 min后,3000 r/min 离心10 min，然后将血清分装入0.5 mL Eppendorf管中,-80 ℃低温冷冻备用。

1.4 检测方法

按照试剂盒说明书进行。分别设空白孔,标准品孔和样品孔。在uPA抗体包被板上合适的孔内加入稀释好的标准品及样品100 μL，轻轻晃动混匀后4 ℃过夜。弃去液体，甩干后加入洗涤液,振荡30 s,甩去液体,重复4次。每孔加入酶标试剂100 μL,轻晃混匀,37 ℃温育30 min。弃去液体,甩干后加入洗涤液,振荡30 s,甩去液体,重复5次。每孔依次加100 μL 生物素化的抗体室温孵育1 h。弃去液体,重复洗涤(同前)。每孔依次加100 mL链霉亲和素溶液,轻轻摇晃室温孵育45 min。重复洗涤。加入底物试剂100 μL轻晃混匀,室温避光30 min,取出酶标板,每孔 加入终止液50 μL,终止反应。上机检测,以空白孔调零,在450 nm波长下测量各孔D(450)值。根据标准孔浓度和对应的D(450)值计算标准回归方程,再根据样品的D(450)值在回归方程上算出对应样品浓度。

1.5 统计学分析

统计学处理应用SPSS 18.0 统计软件，数据以x±s 表示，两两组间比较采用t检验，P＜0. 05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 初始治疗前AML患者与健康对照组血清uPA蛋白表达

初始治疗前AML患者外周血血清uPA蛋白表达水平为(702.30±52.00)pg/mL，健康对照组外周血血清uPA蛋白表达水平为(228.30±28.03)pg/mL，二者比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 不同预后组AML患者初始治疗前血清uPA蛋白表达

预后不良组、预后中等组、预后良好组AML患者初始治疗前血清uPA蛋白水平分别为(938.80±52.59)、(468.60±64.45)、(344.80±33.04)pg/mL；预后不良组AML患者血清uPA蛋白表达水平明显高于预后良好组及预后中等组，差异具有统计学意义(P＜0.05)；预后中等组与预后良好组AML患者血清uPA蛋白水平差异无统计学意义(P＞0.05)。

3 讨论

随着细胞毒药物、靶向治疗及造血干细胞移植术的发展，AML临床疗效及总体生存率得到了明显提高，但难治性AML因其自身特点化疗耐药、完全缓解率低、并发症多、生存期短，仍然是临床治疗的难题，其中位生存期短于1年^[6]。

uPA是由成纤维细胞、单核细胞、中性粒细胞、肿瘤细胞等合成和分泌的一种丝氨酸蛋白水解酶，通过与其特异性受体uPAR结合而活化，参与许多病理生理调节过程，包括创伤后组织修复、组织再生、血管生成、炎症及肿瘤的发生发展等。大量证据表明：uPA在许多恶性肿瘤中高表达，其表达的上调与肿瘤细胞的增殖、粘附、迁移、侵袭、转移、肿瘤血管生成及化疗耐药等密切相关^[2]。正因为其在实体肿瘤中广泛而肯定的作用，靶向uPA的治疗^[7]，包括uPA抗体、uPA抑制剂及一些中药抗uPA^[8]的研究等也成为了当前研究的热点。近年来，uPA蛋白的表达与血液系统疾病之间的关系也逐渐被认识。在复发及发生了远处转移的AML患者血清中，uPA蛋白表达明显上调。uPA蛋白在AML患者血清中的表达还与FAB分型有关，在单核细胞亚型(M4、M5)中表达最高^[9]，这一结论在本研究中得到了进一步证实。文献^[10]报道，uPA基因包含了一段与转录因子RUNX/AML家族相同的染色体13 bp回文结构，提示uPA可能与AML的发病有关。作为纤溶系统主要成分之一，uPA蛋白一方面通过调节基底膜、细胞外基质降解，促进肿瘤细胞的黏附、髓外侵袭及转移，导致患者皮肤黏膜的浸润、肝脾淋巴结肿大、中枢神经系统受累等。另一方面，uPA蛋白通过激活纤溶系统导致纤溶亢进，促进AML患者出血并发症的发生^[4]。然而，uPA蛋白与AML患者预后之间的关系至今仍不明确。

本课题组前期应用蛋白芯片技术对AML患者血清507种蛋白表达进行检测时发现，uPA蛋白是预后良好组与预后不良组的差异表达分子^[11]。为了进一步验证我们前期蛋白芯片结果及探索uPA蛋白表达与AML预后之间的关系，在本研究中，我们首先用ELISA法检测了收集的初治AML患者及健康体检者外周血血清uPA蛋白表达量，再对其中预后不良组、预后中等组、预后良好组AML患者血清uPA蛋白水平与正常对照组进行统计学分析，分组标准参照《成人急性髓系白血病(非急性早幼粒细胞白血病)中国诊疗指南(2011年版)》，结果提示uPA蛋白在AML患者血清中的表达明显高于正常对照组；uPA蛋白在预后不良组AML患者血清中的表达明显高于预后良好组及预后中等组。本课题组提出了uPA蛋白表达与AML不良预后有关，为AML患者提供了新的预后判断标志，为个体化治疗选择提供可靠的方法和依据。但是，由于样本含量较少，失访率高，本研究尚有许多不足之处，我们只是初步验证了前期蛋白芯片结果，主要着眼于对现象的观察，而未对uPA蛋白导致AML患者不良预后的具体作用机制进行深入探讨。uPA蛋白是否参与了AML患者的染色体突变、化疗耐药、疾病复发？

总之，在接下来的研究中，我们将扩大样本含量，延长随访时间，进一步验证uPA蛋白与AML预后之间的关系；我们将在细胞实验中深入探索uPA蛋白在难治性AML中的具体作用机制，为AML患者的诊疗提供新的思路。