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Norrin对胃癌细胞凋亡的抑制作用
刘磊, 王斌, 李砚, 刘琴, 陈东风    
400042 重庆,第三军医大学大坪医院野战外科研究所消化内科
摘要目的 研究Norrin蛋白对胃癌细胞凋亡的抑制作用。 方法 采用免疫组化检测Norrin在151例不同病理分级的胃癌组织中的表达,并进行临床病理分析;Western blot检测不同胃癌细胞株中Norrin的表达情况;随后通过慢病毒转染技术构建Norrin低表达的胃癌细胞株BGC823,并以Western blot检测干扰效果;再以流式细胞术检测Norrin正常表达(Lv-sh-ctrl组)与低表达(Lv-sh-Norrin组)BGC823细胞凋亡的变化,最后使用Western blot检测Mcl-1、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3等凋亡相关蛋白的表达。 结果 Norrin在胃癌组织中的表达高于癌旁组织,且Norrin的表达高低与胃癌的Lauren分型、分化程度、TNM分期、术后生存率差异有统计学意义(P<0.05),而与性别、年龄、部位、直径、组织学类型差异无统计学意义(P>0.05);在胃癌细胞株中,Norrin在高中分化的SGC7901、AGS细胞中低表达,而在低分化的BGC823细胞中高表达;干扰Norrin基因表达可明显增加胃癌细胞的凋亡, Lv-sh-Norrin组细胞凋亡率(12.26±0.70)%相比于Lv-sh-ctrl组(7.58±0.68)%明显增加,P<0.05);同时Western blot结果显示,相比于Lv-sh-ctrl组,Lv-sh-Norrin组中抗凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-2蛋白表达减少;促凋亡分子Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达增加。 结论 Norrin通过抑制Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达,促进Mcl-1、Bcl-2蛋白表达,抑制胃癌细胞的凋亡。
关键词Norrin     胃癌     临床病理特征     凋亡    
Inhibitory effect of Norrin on apoptosis of gastric cancer cells
Liu Lei, Wang Bin, Li Yan, Liu Qing, Chen Dongfeng     
Department of Gastroenterology, Institute of Surgery Research, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400042, China
Corresponding author: Chen Dongfeng, E-mail: chendf1981@126.com
Abstract: Objective To investigate the inhibitory effect of Norrin on apoptosis of gastric cancer cells. Methods The expression of Norrin was detected in 151 gastric cancer tissues with different histological grades by immunohistochemistry, followed by clinic pathological feature analysis. The expression of Norrin in different gastric cell lines was evaluated by Western blot analysis. Gastric cancer cell line BGC823 with low expression of Norrin was constructed by RNA interference using shRNA plasmid. Western blot analysis was applied to confirm the effect of Norrin knockdown. Cell apoptosis in the Norrin normal-expression group (Lv-sh-ctrl group) and Norrin low-expression group (Lv-sh-Norrin group) was detected by flow cytometry. Finally, Western blot analysis was used to detect the expressions of apoptosis promoting proteins (Bax and cleaved Caspase-3), and apoptosis inhibiting proteins (Mcl-1 and Bcl-2). Results The expression of Norrin in the gastric tumor tissues was significantly higher than that in the para-tumor tissues. The expression of Norrin was associated with Lauren classification, histological grade, TNM stage and survival rate (P<0.05), rather than the gender, age, location, tumor size and histological diagnosis (P>0.05). Norrin was highly expressed in poorly differentiated BGC823 cells, but lowly expressed in well or moderately differentiated SGC7901 cells and AGS cells. The apoptotic rate of gastric cancer cells was significantly increased by Norrin knockdown. The apoptosis rate [(12.26±0.70)%] of the Lv-sh-Norrin group was higher than that [(7.58± 0.68)%] of the Lv-sh-ctrl group (P<0.05). Western blot analysis showed that Mcl-1 protein and Bcl-2 protein were down-regulated in the Lv-sh-Norrin group, while Bax protein and cleaved Caspase-3 were up-regulated. Conclusion Norrin inhibits the apoptosis of gastric cancer cells through down-regulation of Bax and cleaved caspase-3 and up-regulation of Mcl-1 and Bcl-2.
Key words: Norrin     gastric cancer     clinical pathological features     apoptosis    

胃癌是我国最常见的消化系统恶性肿瘤之一,因其早期症状隐匿,加之目前我国早期胃癌发现率仍较低,大部分患者诊断时肿瘤已发展至中晚期。尽管现在对胃癌的认识有了很大的进步,诊疗手段也日益增多,但由于胃癌发生、发展机制仍未明确,故目前胃癌预后仍较差,5年生存率20%~25%[1]。 因此,明确胃癌发生的分子机制对胃癌的诊断及治疗具有重要意义。

Norrin基因位于X染色体p11.4位置上,编码的mRNA长度为2.1 kb,氨基酸长度为133个,其中C端富含半胱氨酸,结构域与TGF-β家族类似[2]。Norrin基因最早被发现参与视网膜血管形成,其机制与通过卷曲蛋白家族蛋白4(Frizzled-4)及低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LDL receptor related protein,Lrp5)结合激活Wnt通路相关[3]。近来研究表明,Norrin可通过与Frizzled-4及Lrp-5结合,进而参与结肠癌血管新生[4, 5]。肿瘤的发生、发展与血管新生关系密切,而Norrin在血管生成过程中发挥重要作用,因而Norrin与肿瘤发生可能存在联系。目前关于Norrin的研究集中在其与血管生成方面,而有关肿瘤细胞恶性生物学行为的研究很少。因此,我们针对消化系统常见恶性肿瘤胃癌,初步探讨Norrin在胃癌发生中的作用及可能的分子机制,以期为阐明胃癌发生、发展的分子机制提供实验证据。

1 资料与方法 1.1 材料及设备 1.1.1 临床资料

选取1995年1月至2005年12月 在本院收治的胃癌患者151例,其中男性113例,女性38例。所有选取的胃癌标本术前未经放疗或化疗,且均为根治术手术标本;所有选取的癌旁标本为肿块边缘超过5 cm处取的组织,每例胃癌标本都选取了癌旁标本。收集临床资料并随访。本研究通过第三军医大学大坪医院野战外科研究所伦理委员会审查。

1.1.2 细胞株与Norrin shRNA慢病毒表达载体

人胃癌细胞株SGC7901(高分化),AGS(中分化),BGC823(低分化)购于中国科学院上海细胞库。Norrin shRNA慢病毒表达载体及对照载体购于仑帝斯生物科技有限公司。

1.1.3 试剂及设备

RPMI1640培养基、胎牛血清、青链霉素购自HyClone公司。SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购自ATGene公司。兔抗人Norrin抗体购自Abcam公司;鼠抗人Mcl-1、兔抗人Bcl-2抗体购自Novus公司;兔抗人Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3抗体购自CST公司;鼠抗人GAPDH抗体购自 Liankebio公司。辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗,免疫组织化学二抗均购自中杉金桥公司。ECL发光液购自Millipore公司。凋亡检测试剂盒购自贝博生物公司。凋亡检测使用BD Accuri C6流式细胞仪。

1.2 方法 1.2.1 细胞培养

人胃癌细胞SGC7901、BGC823培养于含有10%胎牛血清以及1%青链霉素的RPMI1640培养基内,AGS培养于含有10%胎牛血清 的F12培养基内,置于37 ℃、5% CO2、空气湿度为95% 的恒温孵箱内。

1.2.2 免疫组织化学检测

免疫组织化学染色采用SABC法。组织标本经10%多聚甲醛固定后石蜡包埋切片,采用二甲苯脱蜡并梯度酒 精水化,3% H2O2室温封闭,枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0) 高压修复,滴加山羊血清封闭后,加Norrin抗体(1:200)4 ℃孵育过夜,PBS洗涤后按说明书操作加入二抗孵育、DAB显色并设立阴性对照。

病理科两位医师双盲条件下进行光镜下阅片和评分。评分的标准采用Allred 评分系统(Allred scoring system),根据细胞染色的强度和阳性细胞比例进行评分:无阳性显色计0分,浅黄色为1分,棕黄色为2 分,棕褐色为3分;阳性染色细胞数占样本细胞数的百分比,0 %为0分,1%~25 %为1分,>25%~50%为2分,>50%~75%为3分,>75%~100 %为4分。将每个芯片点的阳染强度得分与阳染细胞比例得分相乘的值,作为其最终得分。得分≤5分计为Norrin低表达;≥6分计为Norrin高表达。

1.2.3 Western blot检测

将细胞以2×105/孔铺于6孔板上,提取总蛋白后于-20 ℃保存备用。根据蛋白相对分子质量配制相应分离胶和5%浓缩胶,上样量为50 μg,浓缩胶以60 V电泳 60 min、分离胶以 100 V电泳60 min。转膜条件为100 V,恒压湿转90 min。 之后加5%的脱脂奶粉室温封闭2 h。加入一抗(GAPDH、Norrin、Lrp5、Frizzled-4、Mcl-1、Bcl-2、Caspase-3、Cleaved Caspase-3、Bax抗体均稀释比为1 :1 000)4 ℃孵育过夜。采用TBST洗涤后室温孵育二抗(山羊抗兔1 :5 000;山羊抗鼠1 :5 000)2 h,再次洗涤后进行ECL显色,暗室曝光。然后用Image lab软件进行灰度值分析,每组实验重复3次。

1.2.4 慢病毒转染及筛选

感染操作前1 d以2×104个细胞接种于24孔板上,待细胞生长密度在30%左右,采用MOI值为10的病毒液加入到细胞培养液中,并设立对照组。24 h后换液,扩大培养,5 d后采用终浓度为0.8 μg/mL的Puromycin筛选,2周后获得稳定细胞株,并采用Western blot检测验证。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡

将细胞以2×105密度铺于6孔板上,贴壁后收集处于对数生长期的各组细胞,用冰PBS洗2次,加入400 μL Annexin V结合液悬浮细胞,再加入5 μL Annexin V-FITC染色液,4 ℃ 避光孵育15 min,加入10 μL PI,4 ℃避光孵育5 min,30 min内使用流式细胞仪检测。每组实验重复3次以上。

1.3 统计学分析

数据以x±s表示,采用SPSS 18.0统计软件,临床病理资料分析采用χ2检验;总体生存率采用Kaplan-Meier法计算,其比较采用Log-rank检验;凋亡率的比较采用t检验。检验水准α=0.05。

2 结果 2.1 Norrin在胃癌中的表达与临床病理特征的关系

通过免疫组化对151例胃癌组织标本中Norrin表达进行分析,结果显示:在癌旁组织呈淡黄色或呈阴性;而在胃癌组织中,Norrin主要表达在胞浆中,呈棕黄色弥漫状分布,Norrin在胃癌组织中表达含量明显高于癌旁组织(图 1)。临床病理资料统计分析显示,Norrin的表达高低与性别、肿瘤部位、直径、组织学类型差异无统计学意义(P>0.05),但与Lauren分型、肿瘤恶性程度、TNM分期密切相关(P<0.05)。结合Lauren分型可以看出,Norrin在弥漫型胃癌中的表达要高于肠型胃癌(P<0.05);在病理学分级中,随着分化程度的降低,Norrin的表达依次升高(P<0.05);随着TNM临床分期不断增加,Norrin的表达逐渐升高(P<0.01,表 1)。

A:癌旁组织;B:胃癌组织 图 1 免疫组化染色观察胃癌组织中Norrin的表达 (SABC×200)
表 1 胃癌组织中Norrin的表达与临床病理特征的关系
临床特征 例数Norrin表达(%) P
性别 0.543
    男11350.449.6
    女3844.755.3
年龄(岁) 0.447
    <606845.654.4
    ≥ 608351.848.2
部位0.840
    远端胃4447.752.3
    近端胃10749.550.5
肿瘤直径(cm)0.736
    ≤510648.151.9
    >54551.148.9
组织学分型0.307
    乳头状腺癌728.671.4
    管状腺癌11952.947.1
    黏液腺癌1735.364.7
    印戒细胞癌837.562.5
Lauren 分型0.043
    肠型7856.443.6
    弥漫型7341.158.9
组织学分级0.040
    良2969.031.0
    中4949.051.0
    低7341.158.9
TNM 分期0.001
    Ⅰ/Ⅱ7562.737.3
    Ⅲ/Ⅳ7635.564.5

患者生存率分析结果显示,在前50个月,Norrin高表达组出现删失患者频率高于Norrin低表达组;而在50个月后两组均未观察到删失患者。Norrin高表达患者的中位生存时间为(26.0±2.4)个月,低表达患者(72.0±5.3)个月,差异有统计学意义(P<0.01,图 2)。可见Norrin高表达患者生存率较Norrin低表达患者明显降低。

a:P<0.01,与Norrin高表达比较 图 2 胃癌组织中Norrin的表达与胃癌患者的生存分析
2.2 不同胃癌细胞系中Norrin蛋白的表达

Western blot检测3株人胃癌细胞SGC7901、AGS、 BGC823中的Norrin蛋白含量。结果显示Norrin在恶性程度相对较低、分化程度相对较高的SGC7901、AGS细胞中低表达,而在恶性程度相对较高、分化程度相对较低的胃癌细胞株BGC823中高表达(P<0.01,图 3)。

A:Western blot检测结果;B半定量分析结果 1:SGC7901; 2:AGS;3:BGC823;a:P<0.01,与SGC7901和AGS比较 图 3 Western blot检测Norrin在不同胃癌细胞系中蛋白 表达情况
2.3 Norrin低表达的人胃癌细胞株BGC823的建立

采用带有Norrin shRNA慢病毒载体转染人胃癌细胞株BGC823,嘌呤霉素筛选后,采用Western blot验证Norrin的干扰效果。在转染空载病毒的BGC823细胞(Lv-sh-ctrl组)中,Norrin条带明显;而在转染带有Norrin干扰序列病毒的BGC823细胞(Lv-sh-Norrin组)中,Norrin条带淡且模糊,强度明显弱于Lv-sh-ctrl组,Lv-sh-Norrin组Norrin蛋白含量明显低于Lv-sh-ctrl组(P<0.01,图 4)。说明Norrin蛋白干扰效果显著,Norrin敲低的BGC823细胞株构建成功。

1:Lv-sh-ctrl组;2:Lv-sh-Norrin组;A:Western blot检测结 果;B:半定量分析结果 a:P<0.01,与Lv-sh-ctrl组相比较 图 4 Western blot检测Norrin敲低效果
2.4 干扰Norrin对BGC823细胞凋亡的影响

流式细胞仪检测结果显示,Lv-sh-Norrin 组BGC823细胞凋亡率(12.26±0.70)%,较Lv-sh-ctrl组BGC823细胞凋亡率(7.58±0.68)%明显增加(P<0.01,图 5)。提示干扰Norrin可促进胃癌细胞凋亡。

A:Lv-sh-ctrl组;B:Lv-sh-Norrin组 图 5 流式细胞仪检测Norrin敲低后BGC823细胞凋亡的变化
2.5 干扰Norrin后BGC823细胞Norrin的协同分子和凋亡相关分子的表达变化

Western blot检测结果显示,Norrin的协同分子Frizzled-4、Lrp5蛋白含量在Lv-sh-ctrl组和Lv-sh-Norrin组之间差异无统计学意义(P>0.05,图 6),说明Norrin的表达水平并不明显影响BGC823细胞中Frizzled-4和Lrp5蛋白含量,提示干扰Norrin并不通过影响Frizzled-4和Lrp5的含量来发挥对凋亡的作用。

A:Western blot检测结果;1:Lv-sh-ctrl组;2:Lv-sh-Norrin组;B半定量分析结果 a:P<0.05,与Lv-sh-ctrl组比较 图 6 Western blot检测干扰Norrin后BGC823细胞中Frizzled-4、Lrp5、Mcl-1、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白的表达

Western blot检测结果显示,Lv-sh-Norrin组中的抗凋亡分子Mcl-1、Bcl-2蛋白表达较Lv-sh-ctrl组明显降低(P<0.05);而促凋亡分子Bax以及凋亡执行分子Cleaved Caspase-3蛋白表达量较Lv-sh-ctrl组明显增加(P<0.05,图 6)。说明干扰Norrin可能通过下调抗凋亡分子Mcl-1、Bcl-2和上调促凋亡分子Bax、凋亡执行分子Cleaved Caspase-3的蛋白含量发挥促进BGC823细胞凋亡的效应。

3 讨论

胃癌的发生、发展是多因素共同作用的结果,严重危害人类健康。目前世界范围内,胃癌在所有恶性肿瘤中,发病率位居第4位,病死率居第2位[6]。我国是胃癌的高发地区,发病率和死亡率均在世界水平的2倍以上[7]。由于目前有关调控胃癌发生、发展的分子机制尚不清楚,中晚期胃癌的治疗效果不尽人意,因而探讨胃癌形成的分子机制,对于提高胃癌临床诊疗效果具有十分重要的意义。文献[4, 5]报道在结肠癌细胞系、结肠癌组织中检测到Norrin的表达,并认为其促进了结肠癌的血管生成,说明Norrin不仅仅在视网膜、内耳、脑等组织器官中表达,发挥其生物学作用[8, 9],还可能与肿瘤有密切关系。目前胃癌中尚少见Norrin的报道,为了初步探讨Norrin在胃癌发生、发展中可能发挥重要的作用,我们首先检测了151例不同病理分 级的胃癌组织中Norrin表达情况,并进行了临床病理分析,随后成功构建Norrin低表达胃癌细胞株,借此研究Norrin对胃癌凋亡的影响,以寻找治疗胃癌的新靶点。

在本研究中,免疫组织化学结果显示Norrin在胃癌组织中的表达量明显高于癌旁组织,提示Norrin很可能为促癌因子,参与胃癌的发生、发展。分析临床病理资料显示,Norrin表达与胃癌的分化程度及TNM临床分期密切相关。既往研究证明病理学分级和TNM分期都可作为胃癌患者预后的指标,病理学分级越恶性、TNM分期更高,患者预后相对越差,5年生存率相对越低[10, 11]。本组胃癌患者的生存分析显示,Norrin表达含量高的胃癌患者生存率要明显低于Norrin表达含量低的患者。这些结果提示Norrin表达含量越高的胃癌患者,其病理学分级和TNM分期越高,与胃癌患者预后越密切。以往研究表明Lauren分型与胃癌预后有关,弥漫型胃癌比肠型胃癌预后相对较差[12]。本研究发现,Norrin在弥漫型胃癌中阳性率要高于肠型胃癌,也提示Norrin的含量高低与Lauren分型一样,影响胃癌患者生存时间。此外,我们的Western blot结果也证实Norrin的表达与胃癌细胞株恶性程度有关,恶性程度相对较高的BGC823细胞中的Norrin蛋白含量明显高于恶性程度相对较低的SGC7901和AGS细胞。以上这些结果都提示,Norrin可能参与了胃癌的发生、发展并影响胃癌患者的预后。

通过采用Norrin shRNA干扰技术,本研究发现,干扰Norrin可促进人胃癌细胞BGC823的凋亡,这提示Norrin可能通过抑制凋亡而促进胃癌细胞存活,为胃癌细胞的增殖、侵袭、转移提供了前提。众所周知,细胞凋亡是正常细胞在一些不可避免的压力下,受到机体精确调控的一种程序化死亡模式;原有的凋亡调控机制丧失是肿瘤发生、发展的重要原因[13]。其中,胃癌细胞的恶性增殖正是促凋亡-抗凋亡稳态失衡的结果。研究表明,在胃癌的发生、发展过程中,以Mcl-1、Bcl-2等为代表的抗凋亡蛋白过度表达、Bax等促凋亡蛋白受抑是胃癌细胞恶性生长的重要机制,与上调凋亡执行分子Cleaved Caspase-3,进而引发凋亡密切相关[14, 15]。本研究发现在恶性程度较高的人胃癌细胞株BGC823中敲低Norrin后,造成抗凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-2减少,促凋亡蛋白Bax增加,共同导致下游凋亡关键分子Cleaved Caspase-3增加,促进凋亡的发生,这些结果提示Norrin在减少胃癌细胞凋亡,维持胃癌细胞存活中的重要性。另有研究报道,Wnt/β-catenin途径受到抑制可促进胃癌细胞凋亡[16, 17]。我们推测Norrin通过与Frizzled-4和Lrp5结合激活Wnt通路,进而抑制胃癌细胞凋亡。本研究还发现,在干扰Norrin后,BGC823细胞中Frizzled-4和Lrp5蛋白表达含量无明显变化,提示Norrin与frizzled-4和lrp5结合后通过调控下游分子而引起的凋亡,并不是通过影响Frizzled-4和Lrp5蛋白含量发挥作用。

综上所述,我们认为,Norrin通过上调抗凋亡分子Mcl-1、Bcl-2和下调促凋亡分子Bax,从而抑制人胃癌细胞BGC823凋亡;并参与胃癌的发生、发展、影响患者的预后和生存时间。这对于探讨胃癌发生、发展的分子机制具有重要理论价值,对胃癌的治疗可能具有潜在的临床意义。

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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201601139
中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准,
由第三军医大学主管、主办

文章信息

刘磊,王斌,李砚,刘琴,陈东风
Liu Lei, Wang Bin, Li Yan, Liu Qing, Chen Dongfeng
Norrin对胃癌细胞凋亡的抑制作用
Inhibitory effect of Norrin on apoptosis of gastric cancer cells
第三军医大学学报, 2016, 38(10): 1154-1159
J Third Mil Med Univ, 2016, 38(10): 1154-1159.
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201601139

文章历史

收稿:2016-01-26
修回:2016-03-17

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