胃癌是我国最常见的消化系统恶性肿瘤之一,因其早期症状隐匿,加之目前我国早期胃癌发现率仍较低,大部分患者诊断时肿瘤已发展至中晚期。尽管现在对胃癌的认识有了很大的进步,诊疗手段也日益增多,但由于胃癌发生、发展机制仍未明确,故目前胃癌预后仍较差,5年生存率20%~25%[1]。 因此,明确胃癌发生的分子机制对胃癌的诊断及治疗具有重要意义。
Norrin基因位于X染色体p11.4位置上,编码的mRNA长度为2.1 kb,氨基酸长度为133个,其中C端富含半胱氨酸,结构域与TGF-β家族类似[2]。Norrin基因最早被发现参与视网膜血管形成,其机制与通过卷曲蛋白家族蛋白4(Frizzled-4)及低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LDL receptor related protein,Lrp5)结合激活Wnt通路相关[3]。近来研究表明,Norrin可通过与Frizzled-4及Lrp-5结合,进而参与结肠癌血管新生[4, 5]。肿瘤的发生、发展与血管新生关系密切,而Norrin在血管生成过程中发挥重要作用,因而Norrin与肿瘤发生可能存在联系。目前关于Norrin的研究集中在其与血管生成方面,而有关肿瘤细胞恶性生物学行为的研究很少。因此,我们针对消化系统常见恶性肿瘤胃癌,初步探讨Norrin在胃癌发生中的作用及可能的分子机制,以期为阐明胃癌发生、发展的分子机制提供实验证据。
1 资料与方法 1.1 材料及设备 1.1.1 临床资料选取1995年1月至2005年12月 在本院收治的胃癌患者151例,其中男性113例,女性38例。所有选取的胃癌标本术前未经放疗或化疗,且均为根治术手术标本;所有选取的癌旁标本为肿块边缘超过5 cm处取的组织,每例胃癌标本都选取了癌旁标本。收集临床资料并随访。本研究通过第三军医大学大坪医院野战外科研究所伦理委员会审查。
1.1.2 细胞株与Norrin shRNA慢病毒表达载体人胃癌细胞株SGC7901(高分化),AGS(中分化),BGC823(低分化)购于中国科学院上海细胞库。Norrin shRNA慢病毒表达载体及对照载体购于仑帝斯生物科技有限公司。
1.1.3 试剂及设备RPMI1640培养基、胎牛血清、青链霉素购自HyClone公司。SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购自ATGene公司。兔抗人Norrin抗体购自Abcam公司;鼠抗人Mcl-1、兔抗人Bcl-2抗体购自Novus公司;兔抗人Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3抗体购自CST公司;鼠抗人GAPDH抗体购自 Liankebio公司。辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗,免疫组织化学二抗均购自中杉金桥公司。ECL发光液购自Millipore公司。凋亡检测试剂盒购自贝博生物公司。凋亡检测使用BD Accuri C6流式细胞仪。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养人胃癌细胞SGC7901、BGC823培养于含有10%胎牛血清以及1%青链霉素的RPMI1640培养基内,AGS培养于含有10%胎牛血清 的F12培养基内,置于37 ℃、5% CO2、空气湿度为95% 的恒温孵箱内。
1.2.2 免疫组织化学检测免疫组织化学染色采用SABC法。组织标本经10%多聚甲醛固定后石蜡包埋切片,采用二甲苯脱蜡并梯度酒 精水化,3% H2O2室温封闭,枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0) 高压修复,滴加山羊血清封闭后,加Norrin抗体(1:200)4 ℃孵育过夜,PBS洗涤后按说明书操作加入二抗孵育、DAB显色并设立阴性对照。
病理科两位医师双盲条件下进行光镜下阅片和评分。评分的标准采用Allred 评分系统(Allred scoring system),根据细胞染色的强度和阳性细胞比例进行评分:无阳性显色计0分,浅黄色为1分,棕黄色为2 分,棕褐色为3分;阳性染色细胞数占样本细胞数的百分比,0 %为0分,1%~25 %为1分,>25%~50%为2分,>50%~75%为3分,>75%~100 %为4分。将每个芯片点的阳染强度得分与阳染细胞比例得分相乘的值,作为其最终得分。得分≤5分计为Norrin低表达;≥6分计为Norrin高表达。
1.2.3 Western blot检测将细胞以2×105/孔铺于6孔板上,提取总蛋白后于-20 ℃保存备用。根据蛋白相对分子质量配制相应分离胶和5%浓缩胶,上样量为50 μg,浓缩胶以60 V电泳 60 min、分离胶以 100 V电泳60 min。转膜条件为100 V,恒压湿转90 min。 之后加5%的脱脂奶粉室温封闭2 h。加入一抗(GAPDH、Norrin、Lrp5、Frizzled-4、Mcl-1、Bcl-2、Caspase-3、Cleaved Caspase-3、Bax抗体均稀释比为1 :1 000)4 ℃孵育过夜。采用TBST洗涤后室温孵育二抗(山羊抗兔1 :5 000;山羊抗鼠1 :5 000)2 h,再次洗涤后进行ECL显色,暗室曝光。然后用Image lab软件进行灰度值分析,每组实验重复3次。
1.2.4 慢病毒转染及筛选感染操作前1 d以2×104个细胞接种于24孔板上,待细胞生长密度在30%左右,采用MOI值为10的病毒液加入到细胞培养液中,并设立对照组。24 h后换液,扩大培养,5 d后采用终浓度为0.8 μg/mL的Puromycin筛选,2周后获得稳定细胞株,并采用Western blot检测验证。
1.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡将细胞以2×105密度铺于6孔板上,贴壁后收集处于对数生长期的各组细胞,用冰PBS洗2次,加入400 μL Annexin V结合液悬浮细胞,再加入5 μL Annexin V-FITC染色液,4 ℃ 避光孵育15 min,加入10 μL PI,4 ℃避光孵育5 min,30 min内使用流式细胞仪检测。每组实验重复3次以上。
1.3 统计学分析数据以x±s表示,采用SPSS 18.0统计软件,临床病理资料分析采用χ2检验;总体生存率采用Kaplan-Meier法计算,其比较采用Log-rank检验;凋亡率的比较采用t检验。检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 Norrin在胃癌中的表达与临床病理特征的关系通过免疫组化对151例胃癌组织标本中Norrin表达进行分析,结果显示:在癌旁组织呈淡黄色或呈阴性;而在胃癌组织中,Norrin主要表达在胞浆中,呈棕黄色弥漫状分布,Norrin在胃癌组织中表达含量明显高于癌旁组织(图 1)。临床病理资料统计分析显示,Norrin的表达高低与性别、肿瘤部位、直径、组织学类型差异无统计学意义(P>0.05),但与Lauren分型、肿瘤恶性程度、TNM分期密切相关(P<0.05)。结合Lauren分型可以看出,Norrin在弥漫型胃癌中的表达要高于肠型胃癌(P<0.05);在病理学分级中,随着分化程度的降低,Norrin的表达依次升高(P<0.05);随着TNM临床分期不断增加,Norrin的表达逐渐升高(P<0.01,表 1)。
临床特征 | 例数 | Norrin表达(%) | P值 | |
低 | 高 | |||
性别 | 0.543 | |||
男 | 113 | 50.4 | 49.6 | |
女 | 38 | 44.7 | 55.3 | |
年龄(岁) | 0.447 | |||
<60 | 68 | 45.6 | 54.4 | |
≥ 60 | 83 | 51.8 | 48.2 | |
部位 | 0.840 | |||
远端胃 | 44 | 47.7 | 52.3 | |
近端胃 | 107 | 49.5 | 50.5 | |
肿瘤直径(cm) | 0.736 | |||
≤5 | 106 | 48.1 | 51.9 | |
>5 | 45 | 51.1 | 48.9 | |
组织学分型 | 0.307 | |||
乳头状腺癌 | 7 | 28.6 | 71.4 | |
管状腺癌 | 119 | 52.9 | 47.1 | |
黏液腺癌 | 17 | 35.3 | 64.7 | |
印戒细胞癌 | 8 | 37.5 | 62.5 | |
Lauren 分型 | 0.043 | |||
肠型 | 78 | 56.4 | 43.6 | |
弥漫型 | 73 | 41.1 | 58.9 | |
组织学分级 | 0.040 | |||
良 | 29 | 69.0 | 31.0 | |
中 | 49 | 49.0 | 51.0 | |
低 | 73 | 41.1 | 58.9 | |
TNM 分期 | 0.001 | |||
Ⅰ/Ⅱ | 75 | 62.7 | 37.3 | |
Ⅲ/Ⅳ | 76 | 35.5 | 64.5 |
患者生存率分析结果显示,在前50个月,Norrin高表达组出现删失患者频率高于Norrin低表达组;而在50个月后两组均未观察到删失患者。Norrin高表达患者的中位生存时间为(26.0±2.4)个月,低表达患者(72.0±5.3)个月,差异有统计学意义(P<0.01,图 2)。可见Norrin高表达患者生存率较Norrin低表达患者明显降低。
2.2 不同胃癌细胞系中Norrin蛋白的表达Western blot检测3株人胃癌细胞SGC7901、AGS、 BGC823中的Norrin蛋白含量。结果显示Norrin在恶性程度相对较低、分化程度相对较高的SGC7901、AGS细胞中低表达,而在恶性程度相对较高、分化程度相对较低的胃癌细胞株BGC823中高表达(P<0.01,图 3)。
2.3 Norrin低表达的人胃癌细胞株BGC823的建立采用带有Norrin shRNA慢病毒载体转染人胃癌细胞株BGC823,嘌呤霉素筛选后,采用Western blot验证Norrin的干扰效果。在转染空载病毒的BGC823细胞(Lv-sh-ctrl组)中,Norrin条带明显;而在转染带有Norrin干扰序列病毒的BGC823细胞(Lv-sh-Norrin组)中,Norrin条带淡且模糊,强度明显弱于Lv-sh-ctrl组,Lv-sh-Norrin组Norrin蛋白含量明显低于Lv-sh-ctrl组(P<0.01,图 4)。说明Norrin蛋白干扰效果显著,Norrin敲低的BGC823细胞株构建成功。
2.4 干扰Norrin对BGC823细胞凋亡的影响流式细胞仪检测结果显示,Lv-sh-Norrin 组BGC823细胞凋亡率(12.26±0.70)%,较Lv-sh-ctrl组BGC823细胞凋亡率(7.58±0.68)%明显增加(P<0.01,图 5)。提示干扰Norrin可促进胃癌细胞凋亡。
2.5 干扰Norrin后BGC823细胞Norrin的协同分子和凋亡相关分子的表达变化Western blot检测结果显示,Norrin的协同分子Frizzled-4、Lrp5蛋白含量在Lv-sh-ctrl组和Lv-sh-Norrin组之间差异无统计学意义(P>0.05,图 6),说明Norrin的表达水平并不明显影响BGC823细胞中Frizzled-4和Lrp5蛋白含量,提示干扰Norrin并不通过影响Frizzled-4和Lrp5的含量来发挥对凋亡的作用。
Western blot检测结果显示,Lv-sh-Norrin组中的抗凋亡分子Mcl-1、Bcl-2蛋白表达较Lv-sh-ctrl组明显降低(P<0.05);而促凋亡分子Bax以及凋亡执行分子Cleaved Caspase-3蛋白表达量较Lv-sh-ctrl组明显增加(P<0.05,图 6)。说明干扰Norrin可能通过下调抗凋亡分子Mcl-1、Bcl-2和上调促凋亡分子Bax、凋亡执行分子Cleaved Caspase-3的蛋白含量发挥促进BGC823细胞凋亡的效应。
3 讨论胃癌的发生、发展是多因素共同作用的结果,严重危害人类健康。目前世界范围内,胃癌在所有恶性肿瘤中,发病率位居第4位,病死率居第2位[6]。我国是胃癌的高发地区,发病率和死亡率均在世界水平的2倍以上[7]。由于目前有关调控胃癌发生、发展的分子机制尚不清楚,中晚期胃癌的治疗效果不尽人意,因而探讨胃癌形成的分子机制,对于提高胃癌临床诊疗效果具有十分重要的意义。文献[4, 5]报道在结肠癌细胞系、结肠癌组织中检测到Norrin的表达,并认为其促进了结肠癌的血管生成,说明Norrin不仅仅在视网膜、内耳、脑等组织器官中表达,发挥其生物学作用[8, 9],还可能与肿瘤有密切关系。目前胃癌中尚少见Norrin的报道,为了初步探讨Norrin在胃癌发生、发展中可能发挥重要的作用,我们首先检测了151例不同病理分 级的胃癌组织中Norrin表达情况,并进行了临床病理分析,随后成功构建Norrin低表达胃癌细胞株,借此研究Norrin对胃癌凋亡的影响,以寻找治疗胃癌的新靶点。
在本研究中,免疫组织化学结果显示Norrin在胃癌组织中的表达量明显高于癌旁组织,提示Norrin很可能为促癌因子,参与胃癌的发生、发展。分析临床病理资料显示,Norrin表达与胃癌的分化程度及TNM临床分期密切相关。既往研究证明病理学分级和TNM分期都可作为胃癌患者预后的指标,病理学分级越恶性、TNM分期更高,患者预后相对越差,5年生存率相对越低[10, 11]。本组胃癌患者的生存分析显示,Norrin表达含量高的胃癌患者生存率要明显低于Norrin表达含量低的患者。这些结果提示Norrin表达含量越高的胃癌患者,其病理学分级和TNM分期越高,与胃癌患者预后越密切。以往研究表明Lauren分型与胃癌预后有关,弥漫型胃癌比肠型胃癌预后相对较差[12]。本研究发现,Norrin在弥漫型胃癌中阳性率要高于肠型胃癌,也提示Norrin的含量高低与Lauren分型一样,影响胃癌患者生存时间。此外,我们的Western blot结果也证实Norrin的表达与胃癌细胞株恶性程度有关,恶性程度相对较高的BGC823细胞中的Norrin蛋白含量明显高于恶性程度相对较低的SGC7901和AGS细胞。以上这些结果都提示,Norrin可能参与了胃癌的发生、发展并影响胃癌患者的预后。
通过采用Norrin shRNA干扰技术,本研究发现,干扰Norrin可促进人胃癌细胞BGC823的凋亡,这提示Norrin可能通过抑制凋亡而促进胃癌细胞存活,为胃癌细胞的增殖、侵袭、转移提供了前提。众所周知,细胞凋亡是正常细胞在一些不可避免的压力下,受到机体精确调控的一种程序化死亡模式;原有的凋亡调控机制丧失是肿瘤发生、发展的重要原因[13]。其中,胃癌细胞的恶性增殖正是促凋亡-抗凋亡稳态失衡的结果。研究表明,在胃癌的发生、发展过程中,以Mcl-1、Bcl-2等为代表的抗凋亡蛋白过度表达、Bax等促凋亡蛋白受抑是胃癌细胞恶性生长的重要机制,与上调凋亡执行分子Cleaved Caspase-3,进而引发凋亡密切相关[14, 15]。本研究发现在恶性程度较高的人胃癌细胞株BGC823中敲低Norrin后,造成抗凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-2减少,促凋亡蛋白Bax增加,共同导致下游凋亡关键分子Cleaved Caspase-3增加,促进凋亡的发生,这些结果提示Norrin在减少胃癌细胞凋亡,维持胃癌细胞存活中的重要性。另有研究报道,Wnt/β-catenin途径受到抑制可促进胃癌细胞凋亡[16, 17]。我们推测Norrin通过与Frizzled-4和Lrp5结合激活Wnt通路,进而抑制胃癌细胞凋亡。本研究还发现,在干扰Norrin后,BGC823细胞中Frizzled-4和Lrp5蛋白表达含量无明显变化,提示Norrin与frizzled-4和lrp5结合后通过调控下游分子而引起的凋亡,并不是通过影响Frizzled-4和Lrp5蛋白含量发挥作用。
综上所述,我们认为,Norrin通过上调抗凋亡分子Mcl-1、Bcl-2和下调促凋亡分子Bax,从而抑制人胃癌细胞BGC823凋亡;并参与胃癌的发生、发展、影响患者的预后和生存时间。这对于探讨胃癌发生、发展的分子机制具有重要理论价值,对胃癌的治疗可能具有潜在的临床意义。
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