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白藜芦醇促进软骨细胞肥大化的作用机制研究
唐翔宇1 , 曹震2 , 董世武2 , 武继民1     
1. 300161天津,军事医学科学院卫生装备研究所 ;
2. 400038重庆,第三军医大学生物医学工程学院生物医学材料学教研室
[摘要] 目的 探讨白藜芦醇(resveratrol,RES)对软骨前体细胞ATDC5肥大化的影响及其可能机制。 方法 通过CCK-8法研究不同浓度RES对ATDC5细胞活性的影响。建立软骨肥大化诱导体系,根据活性实验的安全浓度,设立对照组(0μmol/L)和RES组(1μmol/L、qRT-PCR和Westernblot法确定肥大化相关因子RUNX2、MMP13和COLX表达变化;甲苯胺蓝和免疫组化分析细胞外基质粘多糖及COLX、RUNX2表达;利用qRT-PCR检测软骨细胞肥大化经典通路WNT、IHH和FGF中相关因子的表达变化。 结果 RES安全使用浓度为1μmol/L;与对照组相比,在肥大化诱导14d后,RES组ATDC5细胞肥大化水平明显提升;RES组肥大化相关基因表达量在3、7、14d时明显增加;WNT和IHH途径中促肥大化因子β-atenin和GLI2的表达水平在RES组较对照组升高,而GLI3表达水平下降。FGF途径中PI3K的表达水平较对照组没有变化。 结论 RES通过激活β-catenin及GLI2,抑制GLI3,促进RUNX2表达,实现促进ATDC5肥大化的目的。
关键词: 软骨前体细胞     白藜芦醇     肥大化     软骨内成骨    
Effect of resveratrol on chondrocyte hypertrophy and related mechanism
Tang Xiangyu1 , Cao Zhen2 , Dong Shiwu2 , Wu Jimin1     
1. Institute of Medical Equipment,Academy of Military Medical Sciences,Tianjin,300161 ;
2. Department of Biomedical Material Sciences,School of Biomedical Engineering,Third Military Medical University,Chongqing,400038,China
Supported by the General Program of National Natural Science Foundation of China(30970724,31271007)and the Natural Science Foundation of Tianjin (13JCZDJC33400)
Corresponding author: Wu Jimin,E-mail:jiminwu@outlook.com.
[Abstract]: Objective To investigate the effec to fresveratrol(RES) on hypertrophic differentiation of pre-chondrocyte cells(ATDC5) and related mechanism. Methods ATDC5 cells were treate with basal culture medium with different concentrations of RES for 24h and 48h,followed by CCK-8 assay.The hypertrophy inducing system was established.ATDC5 cells were divided into control group(0μmol/L) and RES group (1μmol/L). The expression levels of hypertrophy-related factors including RUNX2,MMP13 and collagens X (COLX) were detected using qRT-PCR and Western blotting. Toluidine blue staining for GAG and immunohistochemistry for COLX and RUNX2 were performed.Expression levels of altered transcriptional factors and key molecules in canonical chondrogenic pathways including WNT,IHH and FGF were examined by qRT-PCR. Results RES with concentration below1μmol/L had no toxic effect in this experiment.After induction with hypertrophy medium for 14d,the hypertrophy of ATDC5 cells was increased after RES treatment. The treated ATDC5 cells showed a significant increase both at the mRNA and protein levels of hypertrophy-related genes including RUNX2, MMP13 and COLX on day3,day7,and day14.The expression levels of β-catenin and GLI2 in the RES group were increased and that of GLI3 was decreased significantly.Expression of PI3K was not changed in the RES group. Conclusion RES promotes hypertrophy of ATDC5 cells by up-regulating β-catenin and GLI2,down-regulating GLI3 and promoting expression of RUNX2
Key words: pre-chondrocyte cells     resveratrol     hypertrophy     endochondral ossification    

骨组织的形成有膜内成骨和软骨内成骨两种形式,其中软骨内成骨在骨骼发育过程中起主要作用[1]。了解软骨内成骨过程有助于理解人类骨骼疾病、骨损伤及骨修复的病理生理机制。间充质干细胞在膜内成骨过程中直接形成骨组织,而在软骨内成骨的过程中,骨髓间充质干细胞经历了分化为软骨细胞的中间过程。软骨内成骨开始于骨髓间充质干细胞聚集,之后骨髓间充质干细胞向软骨分化。软骨细胞成熟、增殖,并排列成生长板结构,成熟的软骨细胞会继续分化呈现肥大化表型。最后,肥大化软骨细胞发生终末分化继而凋亡。在此期间,血管组织侵入软骨细胞肥大化区域,新的骨组织替代肥大化软骨组织,形成骨骼[2]。因此,软骨细胞肥大化在软骨内成骨过程中作用显著,寻求促进软骨细胞肥大化的方法,有助于利用“软骨内成骨”途径修复骨缺损。

白藜芦醇(resveratrol,RES)是一种植物源非黄酮类多酚化合物。作为一种天然抗氧化剂,RES已被用于心血管保护[3]和癌症的治疗[4]。近年来,在骨组织中对RES的研究越发广泛[5-6]。在骨骼系统中,RES有促进纵骨生长的潜力[7]。也有研究发现,RES通过抑制PPARγ通路,减少脊髓损伤小鼠骨流失[8]。这些结果提示RES在成骨过程中具有重要作用。而其对软骨细胞的作用,尤其是软骨细胞肥大化的影响尚少见报道。因此,本研究利用软骨细胞肥大化诱导培养体系,探讨RES对ATDC5细胞肥大化进程的影响,并对其可能机制进行了初探。

1 材料与方法 1.1 细胞及细胞培养

ATDC5细胞株购于中科院上海细胞所。使用含90%DMEM/F12,10%FBS培养基,于37 ℃,5%CO2孵箱中培养ATDC5细胞。待ATDC5细胞融合率达到90%时传代。诱导ATDC5肥大化分化时,将ATDC5细胞铺于6孔板中,待细胞贴壁8 h后,使用含地塞米松1%,100 ng/L T3的软骨肥大化诱导培养基[9],并置于37 ℃,5%CO2孵箱中培养14 d。在软骨培养体 系中,设置对照组(0 μmol/L RES)及RES组(1 μmol/L RES),每2天更换新鲜肥大诱导培养基及RES。

1.2 CCK-8细胞活力检测

将ATDC5细胞以2×103个/孔接种于96孔板。待细胞贴壁后,换以不同浓度(0、0.1、0.5、1、5、10、20 μmol/L)RES(Sigma Aldrich)培养基培养24和48 h。将10 μL Cell Counting Kit-8(CCK-8,Dojindo Laboratories)加入每孔,于37 ℃孵育4 h。使用分光光度计读取450 nm波长下每孔光密度值。以无细胞,含CCK-8溶液孔作为空白对照。根据试剂盒使用手册计算细胞增殖与光密度之间对应关系。

1.3 qRT-PCR

使用TRIzol(TaKaRa Bio)提取培养于6孔板中细胞总mRNA,并进行浓度测定。使用PrimeScrip RT reagent Kit(TaKaRa Bio)逆转录每份样品1 μg总mRNA。检测软骨及肥大化软骨细胞相关基因ColX、MMP13、RUNX2以及β-catenin mRNA表达水平,并使用GAPDH为内参基因。引物由华大基因合成,序列见表 1

表 1 qRT-PCR引物序列
基因 引物序列
GAPDH正义链: 5′-GTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′
反义链: 5′-GGTGGTCCAGGGTTTCTTA-3′
COLX正义链: 5′-CTTTCTGGGATGCCGCTTGT-3′
反义链: 5′-GGGTCGTAATGCTGCTGCCTA-3′
MMP13正义链: 5′-TTGATGCCATTACCAGTCTCCG-3′
反义链: 5′-CACGGGATGGATGTTCATATGC-3′
RUNX2正义链: 5′-CCAACTTCCTGTGCTCCGTG-3′
反义链: 5′-ATAACAGCGGAGGCATTTCG-3′
β-catenin正义链: 5′-GAGTCTGAAGTCGGGACCAC-3′
反义链: 5′-GATCGTCGGCTGGAACAC-3′
GLI2正义链: 5′-GTCACCAAGAAACAGCGTAA-3′
反义链: 5′-GATGGCTTTGATATGTAGGC-3′
GLI3正义链: 5′-ACAGCTCTACGGCGACTG-3′
反义链: 5′-GCATAGTGATTGCGTTTC-3′
PI3K正义链: 5′-CTCACGCAGGACACTTTG-3′
反义链: 5′-GTTGGTGGGTTGTTGGTT-3′

1.4 甲苯胺蓝及免疫组化染色

肥大化诱导ATDC5细胞14 d后,使用4 ℃ PBS清洗细胞2次,使用4%多聚甲醛固定30 min,再用4 ℃ PBS清洗2次。使用1%甲苯胺蓝染料(Sigma Aldrich)对细胞染色室温孵育30 min,后使用PBS清洗2次。免疫组化样品在固定后使用H2O2(ZSGB-BIO),山羊血清(ZSGB-BIO)各孵育10 min。使用对应一抗(Abcam)在合适浓度于4 ℃过夜。然后按免疫组化试剂盒使用手册进行操作,并使用Image-Pro plus 6.0进行图像分析。

1.5 Western blot分析

肥大化诱导培养ATDC5细胞达3、7、14 d时,使用4 ℃PBS清洗细胞2次后,用RIPA(Beyotime)裂解液于4 ℃冰上裂解30 min。使用BCA试剂盒(Beyotime)检测各细胞裂解液蛋白浓度。使用8% SDS-丙烯酰胺凝胶,以20 μg/孔上样并转膜于0.2 μm PVDF膜(Millipore)。使用5%脱脂奶粉封闭膜2 h,并按照各目的蛋白分子量大小进行剪膜。分别使用COLX、RUNX2一抗(Abcam),于4 ℃过夜孵育,后用二抗(Abcam)室温孵育2 h。洗净二抗后,使用DAB(Beyotime)试剂盒显影。

1.6 统计学分析

采用SPSS 12.0统计软件。数据以x±s表示。两组间使用双尾,非成对t检验进行差异性分析。

2 结果 2.1 CCK-8检测RES对ATDC5细胞活性的影响

通过CCK-8法分析不同浓度(0、0.1、0.5、1、5、 10、20 μmol/L)RES对ATDC5细胞活性的影响(图 1)。 结果显示,RES浓度低于1 μmol/L时,其对ATDC5活性没有影响。而RES浓度高于5 μmol/L时,ATDC5活力受到抑制(24 h,P<0.01; 48 h,P<0.05)。所以本实验中采取1 μmol/L RES作为实验安全浓度。

A:培养24 h;B:培养48 h;a:P<0.05,b:P<0.01,与RES组比较 图 1 不同浓度RES对ATDC5细胞活性的影响

2.2 RES抑制ATDC5细胞胞外粘多糖表达情况

通过甲苯胺蓝染色的方法检测细胞外粘多糖含量 变化。与对照组(0.153±0.011)相比,使用含1 μmol/L RES(0.111±0.056)肥大化诱导培养基的ATDC5细胞表达更少(P=0.03)的胞外粘多糖(图 2)。提示RES促进了ATDC5肥大化进程,从而减少细胞外粘多糖表达。

A:对照组;B:RES组 图 2 甲苯胺蓝染色观察肥大诱导14 d细胞外粘多糖变化

2.3 RES促进ATDC5细胞肥大化相关基因表达情况

为了进一步阐明RES促进肥大化过程的机制,采用qRT-PCR方法检测了肥大化软骨细胞相关基因的表达水平。RES处理组在3、7、14 d RUNX2、COLX和MMP13表达水平均高于对照组(图 3AC)。但随时间推移,肥大化相关基因表达较对照组增势减缓。结果提示,RES在促进软骨细胞肥大化早期作用更为明显。

A~C:qRT-PCR检测3、7、14 d肥大化相关基因表达;D:Western blot 检测3、7、14 d肥大化相关基因表达;E:免疫组化检测肥大诱导第14天COLX和RUNX2表达 a:P<0.05,b:P<0.01,与对照组比较 图 3 ATDC5细胞肥大化相关基因变化

Western blot检测了肥大化相关蛋白RUNX2和COLX在蛋白水平含量的变化。与mRNA表达水平类似,在含有RES肥大化诱导培养3、7、14 d后,其蛋白表达量较对照组均有提升(图 3D)。免疫组化检测了RES组与对照组14 d RUNX2和COLX的表达变化。结果显示,RES组RUNX2和COLX表达水平更高(图 3E)。提示,RES提高了ATDC5细胞肥大分化水平。

2.4 RES通过上调β-catenin和GIL2信号促进ATDC5细胞肥大化

在T3存在的肥大化诱导培养基中,RES明显促进了ATDC5细胞的肥大化进程。通过qRT-PCR的方法检验了软骨细胞肥大向分化过程中涉及的经典信号通路。发现在RES组中β-catenin的表达水平分别在3、14 d 明显上升(图 4A)。结果提示,RES通过促进WNT/β-catenin途径中β-catenin的表达,促进ATDC5肥大分化。另外,RES组中GLI2的表达水平在第3、7、14天均高于对照组,而GLI3表达水平与之相反(图 4BC)。由此推测,RES激活了IHH通路,从而促进细胞整体向肥大化分化。而在检测促进软骨细胞肥大 化通路中关键因子PI3K时,发现PI3K表达在3、7、14 d 均没有变化(图 4D)。这一结果提示,PI3K分子可能未参与RES介导的ATDC5细胞肥大化过程。

A:β-catenin表达;B:GLI2表达;C:GLI3表达;D:PI3K表达;a:P<0.05,b:P<0.01,与对照组比较 图 4 qRT-PCR检测WNT、IHH及FGF途径相关分子表达

3 讨论

RES作为一种天然多酚类物质,在多种细胞模型中被证实具有抗炎[10]和抗氧化[11]的作用。因此,研究人员认为RES具有治疗多种疾病的潜力,其中,包括骨组织相关疾病[7-8]。本实验中,我们发现RES能促进ATDC5细胞的肥大化进程,使之软骨内成骨能力增强。这个现象与早期研究发现RES饲雌兔能促进骨发育[7]现象一致。在诱导ATDC5细胞肥大化的过程中,RES促进RUNX2基因表达。作为受转录因子RUNX2直接调控的下游基因[12],COLX的表达量在RUNX2表达升高时增加。RES促进软骨细胞肥大化标志蛋白COLX表达的现象,提示RES能够促进细胞肥大化进程。同样,RUNX2蛋白水平的提升,进一步促进了MMP13的表达。MMP13能够降解构成软骨细胞外基质主要成分的Ⅰ型、Ⅱ型胶原[13]。在本实验中,MMP13表达量上升可能是RES组在诱导14 d后细胞外粘多糖含量下降的原因。但也有研究指出,RES能抑制hMSC软骨分化期间MMP13表达[14]。提示,RES参与了整个软骨内成骨过程,促进了软骨分化的同时,也加速了成熟软骨肥大化进程。

前期的诸多研究已证明WNT[15]、IHH[16]以及FGF[17]途径在调控软骨细胞肥大化过程中的关键作用。在生长板中,成熟的软骨细胞肥大向分化过程时表达WNT5A和WNT5B。而Wnt5a-/-小鼠表现为严重的软骨肥大化停滞[18]。选择性激活小鼠成熟软骨细胞内WNT下游分子β-catenin的表达,可以得到肥大型软骨细胞[19],说明β-catenin在成熟软骨细胞肥大分化过程中扮演重要角色。本研究发现RES组β-catenin表达量上升,因此我们认为RES通过激活WNT/β-catenin途径中β-catenin的表达促进软骨细胞肥大化。此外,WNT信号通路还与FGF信号通路共同调控软骨细胞肥大化[17]。有研究指出,在兔软骨细胞中,RES通过PI3K/Akt途径促进COLⅡ表达维持软骨形态[20]。但在诱导软骨细胞肥大化过程中检测FGF信号通路中关键因子PI3K分子表达时,没有发现PI3K表达变化。推测,RES促肥大化的过程中可能没有通过FGF/PI3K途径。前期的研究表明,IHH-/-小鼠表现出软骨内成骨进程受阻[16]。在调控软骨细胞肥大化过程中,IHH信号通路下游的GLI2和GLI3分子扮演相反的角色。Ohba等[21]发现抑制子形式GLI3(Glirep)抑制RUNX2转录功能,而GLI2分子却受到IHH下游信号分子SMO调控,生成GLI2A以促进RUNX2表达[22]。这与本研究中的发现一致,推测RES也通过激活IHH途径内GLI2,同时抑制GLI3达到促进ATDC5细胞肥大化的目的。在后续的研究中,将采用干扰相关基因的方法,进一步论证此推测。

总之,本研究证明了RES可加速ATDC5细胞肥大化进程。RES有望作为一种潜在药物,应用于基于软骨内成骨的骨损伤修复过程中。

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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201601132
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唐翔宇, 曹震, 董世武, 武继民.
Tang Xiangyu, Cao Zhen, Dong Shiwu, Wu Jimin.
白藜芦醇促进软骨细胞肥大化的作用机制研究
Effect of resveratrol on chondrocyte hypertrophy and related mechanism
第三军医大学学报, 2016, 38(12): 1392-1397
J Third Mil Med Univ, 2016, 38(12): 1392-1397
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201601132

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收稿: 2016-01-25
修回: 2016-03-17

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