2. 西南医院全军眼科中心,视觉损伤与再生修复重庆市重点实验室
2. Chongqing Key Laboratory of Visual Damage and Regeneration & Restoration,Department of Ophthalmology,Southwest Hospital,Third Military Medical University,Chongqing,400038,China
视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial，RPE)细胞是位于视网膜神经层和脉络膜之间的单层细胞，主要参与视循环、形成血-视网膜屏障、分泌营养因子、吞噬感光细胞脱落的外节等[1]。RPE的损伤会导致如视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)和年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)等致盲性疾病，这类疾病尚无有效治疗措施。研究发现RPE细胞移植有望替代受损的RPE细胞[2]，但RPE细胞的来源仍然是移植的最大瓶颈。
人胚胎干细胞 (human embryonic stem cell,hESC)由于具有无限的自我更新能力，并且能够分化成为体内的任何细胞类型，从而成为了治疗各类疾病的新希望。最近Schwartz等[3-4]报道利用hESC衍生的RPE细胞(hESC-RPE)治疗AMD和Stargart’s患者，证实了hESC-RPE细胞临床移植不仅是安全的，而且能显著改善视功能。但目前采用的是细胞悬液移植方式，使得RPE细胞在视网膜下腔聚集成团，不利于RPE细胞的存活，而且影响RPE细胞间的紧密连接，若在体内不能形成极性单层就不能很好发挥其全部功能，所以如何结合生物材料将RPE细胞形成单层成为了研究的热点。
石墨烯(graphene oxide，GO)是一种新型碳纳米材料，石墨烯薄膜具备独特的化学结构和优异的电学性质，对多种细胞具有很高的亲和性，可支持细胞的黏附、增殖及分化[5]。文献[6-7]报道石墨烯对细胞具有较大的毒性作用。目前尚不清楚石墨烯是否适合于构建组织工程化RPE细胞。为此我们初步探索了氧化 石墨烯对hESC-RPE细胞的毒性作用，并为今后制作石墨烯薄膜用于和RPE细胞复合形成单层结构打基础。
1 材料与方法 1.1 材料细胞来源：人胚胎干细胞株H1由协和医科大学基础医学研究所黄粤教授惠赠。GO来源：中科院高能物理研究所晏亮惠赠。主要试剂和仪器：H1 细胞培养基(steam cell公司)，Y-27632(Sigma公司)，基质胶Matrigel(BD公司)，KSR(Gibco公司)，CCK-8试剂盒(日本同仁公司)，DCFH-DA(Sigma公司)，共聚焦显微镜(Leica公司)，酶标仪(Thermo公司)，流式细胞仪(BD公司)。
1.2 方法 1.2.1 H1细胞培养与传代H1细胞每天换液，细胞至70%~80%融合后按1∶6比例单细胞传代，细胞悬液加入Y-27632(终浓度10 μmol/L)，24 h后换液，以克隆聚集生长。
1.2.2 H1细胞向RPE细胞分化采用自发分化法[8]诱导hESC细胞分化为RPE细胞，具体方法为hESC细胞传代后，使大约1周的时间细胞生长至超级融合；去除BFGF生长因子，在20 d左右色素灶开始出现；继续培养2周，将色素灶单独挑出，移到铺有基质胶的培养皿里；接着培养4周后传代，可以看到清楚的RPE细胞从色素灶单层爬出。
1.2.3 hESC-RPE细胞免疫荧光鉴定将诱导的RPE细胞(P3)接种在细胞玻片上，4%多聚甲醛(PFA)4 ℃固定15 min，PBS漂洗3遍后加入0.25% Triton X-100，室温10 min，封闭液[5%山羊血清、1%牛血清蛋白 (BSA)]室温孵育1 h，吸干封闭液后分别加入一抗Pax6、MITF、Bestrophin、ZO-1(均为Abcam公司) 4 ℃孵育过夜。再加入对应的二抗(Life Technologies公司)，37 ℃孵育1 h 后，DAPI 核染色，最后封片，共聚焦显微镜下观察。
1.2.4 hESC-RPE细胞吞噬实验将诱导的RPE细胞(P3)接种在24孔Transwell培养小室培养2周，取出大鼠视网膜剪成梅花状，展平后置于hESC-RPE细胞上方，使视网膜感光外节层直接接触hESC-RPE细胞，共培养48h后，取出视网膜，按上述细胞免疫荧光染色方法，一抗为rodopsin，hESC-RPE细胞轮廓用F-actin染色标记。
1.2.5 hESC-RPE细胞透射电镜观察将诱导的RPE细胞传至3代，用2.5%戊二醛固定后，PBS漂洗2次，30min/次，1%锇酸后固定2 h，PBS漂洗，丙酮梯度脱水，环氧树脂618包埋，半薄切片定位后，超薄切片，铀染，铅染，最后用TECNAI10透射电子显微镜观察。
1.2.6 GO制备及表征检测方法以石墨为原料，利用改进的Hummers法制备氧化石墨[9]。首先，分别取25 mL浓硫和0.500 0 g石墨于烧杯室温搅拌2 h，加入1.500 0 g高锰酸钾粉末，待混匀后37 ℃反应2 h后向反应液中缓慢加入20 mL去离子水搅拌30 min，依次加入50 mL去离子和双氧水(H2O2，30%)，待产物由棕色变为亮黄色，离心，用5%的HCl溶液离心洗涤数次后，将沉淀转入透析袋，透析1周除去残留的金属离子和酸，最后得到黑色的氧化石墨溶液。取10 mL 氧化石墨溶液，超声剥离4 h，得到黄棕色的悬浮液，即为氧化石墨烯。最后得到的氧化石墨烯分别做原子力显微镜、紫外-可见吸收以及拉曼光谱测试。
1.2.7 hESC-RPE细胞与GO共培养24h后细胞毒性检测采用CCK-8试剂盒检测细胞活力，具体方法为将RPE细胞接种到96孔板(6×104/孔)中，24 h后用DMEM洗2遍，根据实验设计加入浓度分别为0、12.5、25、50和100 μg/mL的GO(用DMEM稀释)，孵育24 h，DMEM洗2遍，按照100 ∶10(DMEM ∶CCK-8)的比例加入CCK-8，37 ℃孵育1 h后，分光光度仪检测(双波长法：450 nm+655 nm参考波长)。
1.2.8 hESC-RPE与GO共培养24h后凋亡检测RPE细胞接种到6孔板24 h后，待细胞密度达90%左右时，去上清，PBS洗3遍后，加入50 μg/mL的GO，并设空白组，孵育24 h后洗3遍，消化细胞用Binding Buffer重悬细胞，加入5 μL FITC Annexin V和5 μL PI室温避光孵育15 min，流式细胞仪检测(使用488 nm激发波长，525 nm发射波长)。
1.2.9 hESC-RPE与GO共培养24h后ROS检测RPE细胞接种到6孔板，待细胞密度达90%左右时，去上清，PBS洗3遍后，加入50 μg/mL的GO，孵育24 h后洗3遍，加入终浓度为10 μmol/L的DCFH-DA(PBS稀释)37 ℃孵育30 min后洗3遍，消化细胞后，用PBS重悬细胞，流式细胞仪检测(使用488 nm激发波长，525 nm发射波长)。
1.3 统计学方法采用SPSS 17.0统计软件，两组数据采用独立样本t检验，多组之间使用单因素方差分析。P<0.05被认为具有统计学差异。
2 结果 2.1 hESC及 RPE细胞的形态学观察hESC以单细胞传代后逐渐聚集生长，呈现典型的克隆样生长(图 1A)。ES超级融合后更换去除bFGF的培养基，20 d左右可出现肉眼可见的色素灶(图 1B)，该色素灶呈棕褐色，随着培养时间增多增大，且色素颜色会不断加深，单独挑出色素灶后可贴壁伸展并有RPE细胞从边缘呈单层片状爬出(图 1C)，形态较规则并富含色素颗粒，传代至3代后细胞呈典型的六角鹅卵石样上皮细胞形态，细胞间连接紧密(图 1D)。
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| A：hESC呈克隆样生长；B～D：hESC向RPE细胞诱导生长，先出现色素灶(B)，RPE细胞从色素灶爬出(C)，经过传代细胞呈六角鹅卵石样，细胞间连接紧密(D) 图 1 hESC及hESC-RPE细胞生长形态观察 |
2.2 hESC-RPE细胞鉴定结果
将hESC-RPE细胞传至P3代行细胞免疫荧光染色和透射电镜观察：可见PAX6和MITF染色表达在细胞核，阳性率高达99%以上(图 2A、B)；Bestrophin染色主要在胞膜和散在的胞浆里(图 2C)；ZO-1是上皮细胞紧密连接的标记，可见较规则的紧密网状结构(图 2D)；细胞内可见吞噬的红色标记的大鼠视网膜感光外节(图 2E)；透射电镜中观察到RPE细胞的微绒毛只位于顶端，胞浆中富含色素颗粒，细胞呈单层，细胞与细胞之间出现紧密连接，与体内RPE细胞结构相似(图 2F)。
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| A、B：荧光免疫细胞化学染色PAX6和MITF表达在细胞核；C、D：荧光免疫细胞化学染色Bestrophin和ZO-1主要表达在胞膜；E：细胞内可见吞噬的红色荧光外节；F：透射电镜可见与体内RPE细胞结构相似：微绒毛只位于顶端，胞浆中富含色素颗粒，细胞呈单层，细胞与细胞之间出现紧密连接 图 2 hESC-RPE细胞P3免疫荧光检测和透射电镜观察 |
2.3 GO的物理化学特征
经原子力显微镜检测，氧化石墨烯的尺寸约为100 nm，厚度约为1.2 nm，且表面平整，说明制备的氧化石墨烯溶液以单层为主(图 3A)。经紫外-可见光谱分析，可见GO在约227 nm处有一显著的吸收峰(π→π*)，并且在约300 nm处有一肩峰(π→σ)(图 3B)。经拉曼光谱分析，可知GO在1 355 cm－1和1 593 cm－1处出现两个特征峰(图 3C)，其中1 355 cm－1处的特征峰表明石墨经过强氧化之后，其有序的结构遭到破坏，产生了许多缺陷和出现了大量的无序结构。Raman光谱显示天然石墨的表征(图 3D)。
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| A：GO的原子力显微镜观察；B：GO的紫外-可见光谱检测，内置图片为GO溶解在ddH2O后的大体照片；C：GO的拉曼光谱检测；D：天然石墨的拉曼光谱表征 图 3 GO的物理化学特征 |
2.4 CCK-8细胞活性检测结果
将hESC-RPE细胞与浓度分别为0、12.5、25、50 μg/mL和100 μg/mL的GO共培养24 h后加入CCK-8检测，结果显示12.5～100 μg/mL的GO处理后与空白组(0 μg/mL)相比均无统计学差异(图 4)。
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| 图 4 CCK-8检测不同浓度GO对hESC-RPE细胞活性的影响 |
2.5 细胞凋亡检测结果
将hESC-RPE细胞与浓度为50 μg/mL的GO液共培养24 h后，通过细胞流式仪凋亡检测，可见空白组与GO组差异无统计学意义(图 5)。
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| 图 5 流式细胞仪检测GO对hESC-RPE细胞凋亡的影响 |
2.6 氧化应激实验结果
将hESC-RPE细胞与浓度为50 μg/mL的GO共培养24 h后检测两组的ROS水平，通过流式细胞仪检测结果显示GO处理后对hESC-RPE细胞的ROS水平没有显著影响(图 6)。
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| A：两组细胞ROS荧光强度检测结果；B：两组细胞荧光强度统计结果 图 6 流式细胞仪检测GO对hESC-RPE细胞ROS水平的影响 |
3 讨论
Schwartz等[3-4]首次报道应用hESC分化而来的RPE细胞作临床移植取得了成功，这对人胚胎干细胞衍生的细胞运用于眼科临床具有非常重要的意义。由hESC分化为RPE细胞有自发分化和诱导分化两种，本实验采用让hESC过度融合生长后进行自发分化，经过20 d去除BFGF培养基的培养，可以观察到少量棕褐色的色素灶出现，随着继续的培养色素灶会增多增大，颜色会由浅至深，实验证明该方法是成熟稳定的。并且在促进RPE细胞形成中，未添加相关信号通路，这对于今后的临床应用提供了一定的安全保障。本实验发现由hESC分化的RPE细胞，呈六角鹅卵石样上皮细胞形态，细胞间连接紧密，胞浆中富含色素颗粒，具有吞噬功能，电镜观察到微绒毛只位于顶端，细胞呈单层，细胞与细胞之间出现紧密连接，这些表现都与体内RPE细胞结构非常相似。
目前RPE细胞移植主要为两种方法：一种是将细胞悬液直接注入视网膜下腔；另一种是将长有单层RPE细胞的载体放入视网膜下[10]。但是这种载体多为不降解的膜，进入体内势必影响移植效果。如果能结合组织工程材料，增加或携带神经营养因子的分泌[11]，且具有高度降解功能[12]，这些条件对于今后RPE细胞的移植是非常有益的。本实验中拟选用氧化石墨烯作为RPE细胞的培养基质，但它对RPE细胞的生物相容性是我们研究首先需要考虑的问题。Yan等[13]将人RPE细胞系(ARPE19)暴露于5～100μg/mL 的GO，研究GO的生物相容性。但这种细胞系与体内RPE细胞具有较大差异[13]，并不能真实地反应出GO的生物毒性。而hESC-RPE细胞与体内RPE细胞十分接近[14]，并且hESC-RPE细胞更接近临床实际需求，因此使用hESC-RPE细胞来研究GO的生物相容性更具有说服力。
石墨烯纳米材料在生物医学领域中具有巨大的潜在应用，它拥有独特的物理、化学和力学特性，可支持成纤维细胞、骨髓间充质干细胞和神经干细胞等多种细胞的生长[15-17]，目前GO在生物医学领域的研究主要集中在功能化修饰、靶向治疗、药物缓释、生物传感器和生物监测等方面，有关GO对细胞毒性作用研究少见报道，对眼部细胞影响的相关报道甚少。本研究将hESC-RPE细胞暴露于12.5～100 μg/mL的GO来研究GO的生物相容性，发现该浓度的GO对于hESC-RPE细胞无显著细胞毒性，而既往研究发现50 μg/mL的 GO已诱发皮肤成纤维细胞、骨髓间充质干细胞等细胞的生物毒性，这可能与RPE细胞具有抗氧化应激能力有关[18]，同时也提示GO诱发的细胞毒性具有细胞选择性。经过本研究的初步探索，可见GO对于hESC-RPE细胞具有较好的生物相容性，有望作为hESC-RPE细胞的移植载体，用于构建基于石墨烯薄膜的组织工程化RPE，使RPE细胞单层生长到载体上再移植入体内能发挥其最大的作用，从而挽救视功能。
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