2. 730000 兰州，甘肃省人民医院临床检验中心 ;
3. 730030 兰州，甘肃省消化系肿瘤重点实验室
2. 2. Clinical Laboratory Center, Gansu Provincial People's Hospital, Lanzhou, Gansu Province, 730000 ;
3. Gansu Provincial Key Laboratory of Digestive System Tumor, Lanzhou, Gansu Province, 730030, China
血脂异常是心血管病的重要危险因素之一，血清甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipo-cholesterol，LDL-C)增高或高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipo-cholesterol，HDL-C)降低均可增加心血管病的发病危险[1-2]。全基因组关联研究(genome-wide association studies，GWAS)和病例对照研究表明，低密度脂蛋白受体(low-density lipid receptor，LDLR)基因rs688 C>T、载脂蛋白B(apolipoproteins B, APOB)基因rs693 C>T、载脂蛋白C-Ⅰ(apolipoproteins C-Ⅰ，APOC-Ⅰ)基因rs4420638 A>G位点与血脂水平相关[3-5]。但上述研究针对的均为欧洲人群，LDLR基因rs688 C>T、APOB基因rs693 C>T、APOC-Ⅰ基因rs4420638 A>G位点是否在中国人群中与血脂水平也存在相关性，仍需进一步的验证。本研究拟采用高分辨率熔解曲线分析(high resolution melting，HRM)技术，检测LDLR基因rs688 C>T、APOB基因rs693 C>T、APOC-Ⅰ基因rs4420638 A>G位点的基因多态性，分析其与兰州地区汉族人群血脂水平的相关性。
1 对象与方法 1.1 研究对象样本取自兰州大学第二医院2013年10月至2015年3月体检中心体检健康者462例，包括男性150例，女性312例，年龄(52.7±15.2)岁。纳入样本均排除各种心血管疾病、甲状腺疾病、肾上腺疾病、消化系统疾病、糖尿病，以及正在使用贝特类、他汀类、激素、胆固醇吸收抑制剂等影响血脂代谢相关药物者，且均为无血缘关系的兰州汉族人。本研究经兰州大学第二医院医学伦理学委员会批准，研究对象签署知情同意书。
1.2 主要试剂与仪器QuickGene-Mini80核酸仪及全血基因组DNA提取试剂盒(日本Fujifilm公司)，Nano-drop 2000微量蛋白质核酸检测仪(美国Thermal Scientific公司)，Rotor-Gene 6000实时荧光定量扩增仪(澳大利亚Corbett公司)，LC Green Plus染料(美国Biotium公司)，Cobas 8000自动生化分析仪及其配套试剂(Roche公司)。
1.3 基因组DNA提取收集研究对象EDTA抗凝的空腹静脉血5 mL，用全血基因组DNA提取试剂盒提取白细胞基因组DNA。通过微量蛋白质核酸检测仪及琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA样本纯度和完整性，所得DNA标本于-40 ℃的冰箱保存。
1.4 引物的设计与合成针对LDLR基因rs688 C>T、APOB基因rs693 C>T、 APOC-Ⅰ基因rs4420638 A>G位点用引物设计软件Primer Premier 5进行引物设计，通过Primer-BLAST、Two-state melting和uMelt软件对引物的特异性、有效性和可辨性进行验证，引物由上海生工生物公司合成，引物具体信息见表 1。
| SNP位点 | 基因 | 突变类型 | 引物序列(5′→3′) | 产物长度(bp) |
| rs688 | LDLR | C > T | 上游GGCCGCCTCTACTGGGTTGAC | 107 |
| 下游GGGTGGGCCAGCCTCTTTTCA | ||||
| rs693 | APOB | C > T | 上游AAGCCTACAGGACACCAAAATAAC | 125 |
| 下游ACATTCGGTCTCGTGTATCTTCTA | ||||
| rs4420638 | APOC-Ⅰ | A > G | 上游GCAATGTCACTATGCTACACTTTTCC | 50 |
| 下游CCTCATCTCGGGTAGACCACA |
1.5 PCR扩增与HRM分析
PCR反应体系总体积10 μL，包括10×PCR buffer 1 μL，10 mmol/L dNTP 0.2 μL，10×LC Green Plus荧光染料1 μL，50 mmol/L MgCl2 0.5 μL，Invitrogen Taq DNA polymerase(浓度5 U/μL)0.06 μL，20 μmol/L上、下游引物各0.20 μL，基因组DNA 1 μL，加DEPC水至总体积为10 μL。rs688与rs693两个位点的扩增条件：95 ℃预变性6 min，前10个循环为：92 ℃变性15 s，59 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s；后30个循环为92 ℃变性15 s，57 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s；72 ℃再延伸2 min。rs4420638位点扩增条件：96 ℃预变性6 min，前10个循环为：88 ℃变性10 s，72～62 ℃(每个循环降退火温度1 ℃)退火延伸45 s；后30个循环为88 ℃变性10 s，62 ℃退火延伸45 s；72 ℃再延伸2 min。HRM分析条件：96 ℃变性60 s，40 ℃退火60 s，收集70～90 ℃熔解曲线数据，分辨率为0.15 ℃/s。依据熔解曲线峰型和位置的改变进行基因分型，随机挑选不同特征峰的PCR产物各10例送上海生工生物公司测序验证。PCR扩增及HRM熔解均在Rotor-Gene 6000荧光定量PCR仪上进行。
1.6 血脂指标检测血脂指标在兰州大学第二医院检验中心Cobas 8000自动生化分析仪上检测，检测项目包括总胆固醇(total cholesterol，TC)、TG、HDL-C和LDL-C。各检测项目参考范围TC：2.30～5.80 mmol/L，TG：0.45～1.80 mmol/L，HDL-C：0.70～2.20 mmol/L和LDL-C：1.20～3.30 mmol/L。
1.7 统计学分析采用SPSS 21.0统计软件，计量资料数据以x±s表示。基因型频率、基因频率、Hardy-Weinberg平衡均采用SHEsis在线软件进行分析，不同基因型之间的各血脂指标比较采用单因素方差分析。在显性模型下，采用多元线性回归分析方法分析SNP位点与血脂水平的相关性。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 研究对象临床资料性别间各项临床资料的统计学结果见表 2。男性具有较高的收缩压(systolic blood pressure，SBP)、舒张压(diastolic blood pressure，DBP)、体质量指数(body mass index，BMI)、TG水平和较低的TC及HDL-C水平(P < 0.05)。两组间年龄、空腹血糖、LDL-C指标差异均无统计学意义(P > 0.05)。
| 性别 | n | 年龄(岁) | 收缩压(mmHg) | 舒张压(mmHg) | BMI(kg/m2) | 空腹血糖(mmol/L) | TC(mmol/L) | TG(mmol/L) | HDL-C(mmol/L) | LDL-C(mmol/L) |
| 男 | 150 | 53.00±14.60 | 131.84±21.93 | 78.52±10.68 | 24.04±2.88 | 5.04±1.28 | 3.76±0.63 | 1.38±0.64 | 1.04±0.21 | 2.50±0.58 |
| 女 | 312 | 52.48±15.42 | 124.71±16.76b | 74.27±8.45b | 22.72±3.28b | 5.06±0.89 | 3.94±0.88a | 1.18±0.46b | 1.29±0.26b | 2.49±0.84 |
| a: P < 0.05，b: P < 0.01，与男性比较 | ||||||||||
2.2 基因多态性检测结果
3个SNP位点的HRM基因分型如图 1所示。运用PCR-HRM分型技术成功地对所研究的标本进行了基因分型。Hardy-Weinberg遗传平衡结果显示所有SNP位点(rs688、rs693、rs4420638)均符合Hardy-Weinberg平衡(χ2值分别为1.780、2.228、2.734，P > 0.05)，说明本研究纳入研究对象具有群体代表性。rs688共发现CC、CT、TT 3种基因型，其基因型频率分别为64.9%、32.5%、2.6%，C和T等位基因频率分别为81.2%、18.8%；rs693共发现CC、CT 2种基因型，其基因型频率分别为87.0%、13.0%，C和T等位基因频率分别为93.5%、6.5%；rs4420638共发现AA、AG 2种基因型，其基因型频率分别为85.7%、14.3%，A和G等位基因频率分别为92.9%、7.1%。与SNP数据库的数据相比，本研究中rs688、rs693、rs4420638位点的基因型频率和基因频率与日本人、中国人十分接近，但与欧洲人群相差较大，如表 3所示。
|
| A~C：分别为rs693、rs4420638、rs688位点标准化熔解曲线；D~F：分别为rs693、rs4420638、rs688位点求导熔解曲线 图 1 APOB、APOC-Ⅰ以及LDLR各基因位点HRM分型 |
| SNP位点 | 人种 | 例数 | 基因型频率 | P | 基因频率 | P | |||
| AA | AB | BB | A | B | |||||
| rs688 C > T | |||||||||
| 欧洲人 | 226 | 0.354 | 0.442 | 0.204 | < 0.01 | 0.575 | 0.425 | < 0.01 | |
| 日本人 | 172 | 0.698 | 0.291 | 0.012 | 0.355 | 0.843 | 0.157 | 0.416 | |
| 中国人 | 86 | 0.674 | 0.302 | 0.023 | 0.903 | 0.825 | 0.174 | 0.880 | |
| 本研究 | 462 | 0.649 | 0.325 | 0.026 | - | 0.812 | 0.188 | - | |
| rs693 C > T | |||||||||
| 欧洲人 | 226 | 0.248 | 0.522 | 0.230 | < 0.01 | 0.509 | 0.491 | < 0.01 | |
| 日本人 | 172 | 0.860 | 0.140 | - | 0.792 | 0.930 | 0.070 | 0.858 | |
| 中国人 | 86 | 0.930 | 0.070 | - | 0.148 | 0.965 | 0.035 | 0.456 | |
| 本研究 | 462 | 0.870 | 0.130 | - | - | 0.935 | 0.065 | - | |
| rs4420638 A > G | |||||||||
| 欧洲人 | 118 | 0.661 | 0.305 | 0.034 | < 0.01 | 0.814 | 0.186 | < 0.01 | |
| 日本人 | 90 | 0.844 | 0.133 | 0.022 | 0.744 | 0.911 | 0.089 | 0.516 | |
| 中国人 | 90 | 0.756 | 0.244 | - | 0.026 | 0.878 | 0.122 | 0.133 | |
| 本研究 | 462 | 0.857 | 0.143 | - | - | 0.929 | 0.071 | - | |
| 表 3中各个SNP位点在不同人群中的基因型频率及基因频率数据均来自PubMed中的SNP数据库；AA、AB、BB表示的基因型分别为野生型、杂合突变型、纯合突变型；P值是本研究的数据分别与欧洲人、日本人和中国人的数据进行的χ2检验 | |||||||||
2.3 不同基因型之间血脂水平分析
方差分析发现，TC、LDL-C在LDLR基因rs688 C>T位点基因型之间的差异有统计学意义(P < 0.05)，且T等位基因携带者具有较高的TC和LDL-C水平；TC、TG在APOB基因rs693 C>T位点基因型之间的差异有统计学意义(P < 0.05)，且CT基因型具有较低的TC、TG水平；TG在APOC-Ⅰ基因rs4420638 A>G位点基因型之间的差异有统计学意义(P < 0.05)，且AG基因型具有较高的TC水平，见表 4。
| SNP位点 | 基因型 | TC | TG | HDL-C | LDL-C |
| rs688 | CC | 3.77±0.83b | 1.21±0.51 | 1.21±0.28 | 2.36±0.77b |
| CT+TT | 4.08±0.74 | 1.31±0.57 | 1.21±0.26 | 2.74±0.70 | |
| rs693 | CC | 3.91±0.85a | 1.27±0.56b | 1.21±0.29 | 2.52±0.80 |
| CT | 3.68±0.48 | 1.06±0.24 | 1.23±0.14 | 2.34±0.45 | |
| rs4420638 | AA | 3.86±0.80 | 1.22±0.47a | 1.21±0.27 | 2.48±0.75 |
| AG | 4.00±0.86 | 1.39±0.80 | 1.20±0.28 | 2.60±0.88 | |
| a: P < 0.05，b： P < 0.01，与同一位点另一个基因型比较 | |||||
2.4 血脂水平相关性分析
在显性模型下，分别以TC、TG、LDL-C、HDL-C为因变量，以性别、年龄、BMI、rs688 C>T、rs693 C>T、rs4420638 A>G为自变量，进行多元线性回归分析。结果发现，rs688 T等位基因携带者的TC、LDL-C水平显著高于CC纯合型(β=0.301，P < 0.01；β=0.335，P < 0.01)；rs693 T等位基因携带者的TC、TG水平显著低于CC纯合型(β=-0.250，P=0.027；β=-0.162，P=0.029)；rs4420638 G等位基因携带者的TG水平显著高于AA纯合型(β=0.180，P=0.016)，见表 5、6。
| 自变量 | TC | TG | ||||
| β | 95% CI | P | β | 95% CI | P | |
| rs688 | 0.301 | 0.145, 0.456 | < 0.01 | 0.042 | -0.061, 0.145 | 0.421 |
| rs693 | -0.250 | -0.470, -0.029 | 0.027 | -0.162 | -0.307, -0.017 | 0.029 |
| rs4420638 | 0.186 | -0.036, 0.408 | 0.101 | 0.180 | 0.033, 0.326 | 0.016 |
| 性别 | 0.312 | 0.146, 0.478 | < 0.01 | -0.124 | -0.233, -0.014 | 0.027 |
| 年龄 | 0.001 | -0.004, 0.006 | 0.694 | -0.001 | -0.004, 0.002 | 0.561 |
| BMI | 0.037 | 0.012, 0.062 | 0.004 | 0.027 | 0.010, 0.043 | 0.002 |
| 自变量 | HDL-C | LDL-C | ||||
| β | 95% CI | P | β | 95% CI | P | |
| rs688 | 0.041 | -0.007, 0.089 | 0.096 | 0.335 | 0.189, 0.480 | < 0.01 |
| rs693 | -0.044 | -0.112, 0.025 | 0.209 | -0.152 | -0.359, 0.054 | 0.148 |
| rs4420638 | 0.025 | -0.044, 0.094 | 0.484 | 0.147 | -0.061, 0.355 | 0.165 |
| 性别 | 0.229 | 0.178, 0.281 | < 0.01 | 0.138 | -0.017, 0.294 | 0.081 |
| 年龄 | 0.000 | -0.001, 0.002 | 0.604 | -0.003 | -0.007, 0.002 | 0.269 |
| BMI | -0.015 | -0.023, -0.008 | < 0.01 | 0.053 | 0.030, 0.077 | < 0.01 |
3 讨论
本研究采用PCR-HRM分型技术成功地对所研究的标本进行了基因分型，并获得LDLR基因rs688 C>T、APOB基因rs693 C>T、APOC-Ⅰ基因rs4420638 A>G位点在兰州地区汉族人群中的分布特点。与PubMed网站中的SNP数据库中的数据相比，本研究中rs688 C>T、rs693 C>T、rs4420638 A>G位点的基因型频率和基因频率与日本人、中国人比较接近，但与欧洲人群相差较大，提示SNP位点的等位基因的突变具有显著的种族差异性。
LDLR基因rs688位点位于LDLR基因的第12外显子中，虽然发生的是C>T的同义突变，但有研究表明该位点是一个功能性的突变位点，能够影响第12外显子的转录[6-7]。Gao等[8]发现rs688突变可影响LDLR的转录以及LDLR在细胞表面和溶酶体中的分布，最终使血浆TC、LDL-C的水平上升。在不同人种中的研究也表明rs688位点与TC水平增高相关[9-10]。本研究发现rs688 T等位基因具有较高的TC和LDL-C水平，与上述研究结果一致。但一项针对墨西哥西南部女性人群的研究表明rs688与血浆TC、LDL-C没有相关性，导致这种不同结果的原因可能与人种以及女性人群的绝经情况有关[11]。研究表明rs688位点对女性血浆TC、LDL-C的影响与女性绝经与否有关[7]。
APOB基因rs693位点位于APOB基因的第26号外显子中，虽然发生的是C>T的同义突变，但该位点与血脂水平密切相关，其原因可能是该位点与APOB基因或者是其他与血脂有关的基因相互关联[12]。Kathiresan等[13]研究发现rs693 T等位基因与LDL-C及TG水平的升高相关。Rodrigues等[14]通过病例对照分析发现rs693位点T等位基因携带者具有更高的TC和LDL-C水平。一项针对科威特人的研究发现rs693位点与TG、TC水平没有相关性[15]。但本研究发现rs693位点的T等位基因携带者具有更低的TC、TG水平，与上述研究结论不一致。多因素分析显示多种环境因素与血脂谱相关，这种差异性也可能与环境因素或环境-基因相互作用对血脂谱的影响有关。同时遗传背景、人种、环境因素以及研究的样本量都可能引起研究结论的不一致[12]。
APOC-Ⅰ基因rs4420638位点靠近APOC-Ⅰ基因的3′端，发生的是A>G的突变。Teslovich等[16]在对欧洲、东亚、南亚等国家人群进行候选基因研究以及Meta分析发现rs4420638基因型具有增高TC、LDL-C水平同时降低HDL-C水平的趋势。Park等[17]在韩国人群研究中发现rs4420638 G等位基因具有较高的LDL-C、TG水和较低的HDL-C水平。Liu等[18]在我国上海人群研究中发现rs4420638基因型与TC、TG、LDL-C水平增高有关，但未见与HDL-C水平显著相关。本研究发现rs4420638是TG水平的独立危险因素，但未发现其与TC、HDL-C、LDL-C水平相关。综上所述，rs4420638基因多态性对血脂代谢有着重要影响，但在不同种族中其对血脂谱的影响不同。
本研究运用HRM分型技术成功对所研究的标本进行了基因分型，发现rs693、rs688、rs4420638基因多态性在中国汉族人群中广泛存在，且具有显著的种族差异性。同时发现rs688、rs693、rs4420638位点与中国兰州地区汉族人群血脂水平相关。由于本研究纳入的是某一地区的汉族人群，样本量相对较小且单一，上述发现仍需经多中心大样本的研究进一步验证。
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