2. 400038 重庆,第三军医大学基础部实验动物学教研室
2. Department of Laboratory Animal Science, College of Basic Medical Sciences, Third Military Medical University, Chongqing, 400038, China
食物过敏(food allergy,FA)是一种常见的变态反应性疾病,由机体对某些食物蛋白产生异常的免疫反应所致。研究表明,食物过敏患儿的肠道菌群与正常儿童的肠道菌群组分存在差异[1-4]。食物过敏动物模型的研究结果亦是如此[5]。近年来,临床上也提出用粪菌移植治疗食物过敏的观点[6-7]。但迄今为止,肠道菌群变化与食物过敏的因果关系尚不明了。本研究通过观察无菌Balb/c小鼠移植不同粪便菌群后对卵清蛋白(ovalbumin,OVA)敏感性的变化,分析肠道菌群在食物过敏发生中的作用。
1 材料与方法 1.1 过敏和无过敏反应小鼠粪便的制备和采集选择30只SPF级Balb/c小鼠(5周龄,雌性,第三军医大学实验动物中心提供),用OVA加免疫佐剂AL(OH)3灌胃及腹腔注射诱导食物过敏,致敏成功后,分别选出过敏和无过敏反应的供菌小鼠,采集粪便。无菌环境中分别称取1 g粪便,加入100 mL 0.1 mol/L PBS(pH 7.2)缓冲液中混匀。取粪便混悬液与60%无菌甘油按3 ∶1的比例加入灭菌离心管,-80 ℃ 冻存备用。
1.2 实验分组及OVA致敏移植小鼠 1.2.1 实验分组无菌Balb/c小鼠(n=20,5周龄,雌性)由第三军医大学实验动物中心提供。饲养于专用的无菌隔离器中,饲养环境温度为20~26 ℃,湿度为40%~70%,光照周期明暗比为12 h ∶12 h。经60Co γ射线40 kGy辐照消毒的无菌、不含鸡蛋的特殊饲料,自由采食和饮水(饮水、垫料、鼠笼和饮水瓶等均采用高温高压灭菌,121 ℃,60 min) 。
无菌Balb/c小鼠随机分为两组,每组10只,移植过敏小鼠粪菌组为FA组,移植无过敏反应小鼠粪菌组为NR组。粪菌移植操作在隔离器中完成。移植后第3周,从两组中分别随机挑出7只进行OVA致敏,为实验组(FA-o组和NR-o组);两组中的另外3只予以等量生理盐水腹腔注射和灌胃,为生理盐水对照组(FA-c组和NR-c组)。
1.2.2 OVA致敏参考文献[8]报道的方法,按基础致敏、强化致敏和肠道激发的步骤处理各组小鼠。粪菌移植后的第3周和第7周定时取新鲜粪便,装于1.5 mL无菌EP管中,-80 ℃冻存备用。
1.3 粪便菌群总DNA提取分别取冻存备用的小鼠粪便20 mg,置于2 mL螺口管(BioSpec)中,加入700 μL裂解液[500 mmol/L NaCl,50 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0,50 mmol/L EDTA,4% SDS],250 μL 酚 ∶氯仿 ∶异戊醇(25 ∶24 ∶1)和0.2 g锆珠(0.5 mm,BioSpec)混匀,以最大速度研磨2 min,4 ℃下12 000 r/min 离心5 min,取上清液加入10 mol/L 乙酸铵250 μL,DNA随即使用2次酚 ∶氯仿 ∶异戊醇(25 ∶24 ∶1) 250 μL和氯仿250 μL提取,异丙醇沉淀。70%乙醇洗涤沉淀,风干后,每管加50 μL去离子水,再加入适量 DNAfree-RNAase(10 mg/μL),去除其中的 RNA,于37 ℃中孵育15 min,然后使用NaNodrop ND-1000测定DNA的含量。
1.4 PCR-DGGE分析 1.4.1 16S rRNA V3区PCR引物为大肠埃希菌16S rRNA基因341~534 碱基的片段[9],GC上游:5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCAC-GGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′,下游:5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′。PCR使用25 μL扩增体系:12.5 μmol/L Mix,上下游引物各 0.5 μmol/L,DNA模板为1 μmol/L,ddH2O 10.5 μmol/L。反应程序:94 ℃预变性5 min,包括30个循环,每个循环包括94 ℃变性30 s,65 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,最终延伸72 ℃ 7 min。PCR产物用1%琼脂糖电泳检测。
1.4.2 16S rRNA V6~V8 区PCR引物对应于大肠埃希氏菌16S rRNA 基因968~1 401 碱基的片段,GC上游:5′- CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCG- GGGGCACGGGGGG AACGCGAAGAACCTTAC-3′,下游: 5′-CGGTGTGTACAAGACCC-3′。下划线部分为GC夹子。 PCR反应体系和程序同1.4.1。为了纯化,第一次PCR 的产物稀释10倍作为Reconditioning PCR[10]的模板。扩增体系和反应程序均与第一次相同。
参考文献[9]报道的方法,对PCR产物进行DGGE分析。DGGE使用8%聚丙烯酰胺凝胶,将100%变性梯度定义为包含40%(体积比)甲酰胺和7 mol/L 尿素,电泳采用DCodeTM Universal Mutation Detection System( Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA,USA),V3区使用30%~60%变性梯度,V6~V8区DGGE变性梯度为32%~56%。电泳缓冲液为1×TAE(pH 8.0)。 条件是220 V预电泳10 min,然后设定60 ℃ 和85 V电泳16 h。结束后,使用硝酸银进行染色,并拍照。
1.5 相似性非加权组平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA)聚类分析和主成分分析(principal component analysis,PCA)使用Quantity One 4.6.2对DGGE图谱进行数字化分析,检测条带的迁移位置和亮度,得到各泳道的条带数和亮度的数字化信息,得出关于条带位置和亮度的二维矩阵,然后采用UPGMA聚类法得到进化树。采用多变量统计对PCR-DGGE指纹图谱的数字化信息进行PCA分析,将前面获得的条带位置和亮度的二维矩阵转化为条带位置和相对亮度的二维矩阵。在SPSS 13.0中运行PCA分析,得到贡献率最大的两个主成分,再用Originlab 8.0软件绘制散点图。
1.6 PCR-DGGE凝胶回收与测序无菌手术刀片割下DGGE凝胶上有差异的条带,无菌双蒸水冲洗数次后放入1.5 mL EP管中,捣碎,加入100 μL无菌双蒸水,4 ℃静置16 h。取5 μL上清液为模板进行PCR扩增,引物序列不带GC夹子,其余PCR反应体系和程序同1.4.1。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,结果若为阳性就再进行一次DGGE。在胶上显示单一条带的,将PCR产物测序;若在DGGE胶上不为单一条带,则选择最亮条带重新割胶回收。
测序结果使用BioEdit软件去除载体序列,再登录NCBI网站,在GenBank中进行序列Blast比对,找到最相似的菌属,并向GenBank中提交该序列,获得序列登录号。
1.7 小肠组织HE染色观察粪菌移植后第7周,用脱臼的方法处死小鼠,剪取1 cm位于Tretiz韧带下方5 cm处的小肠,然后将标本固定于4%多聚甲醛24 h。梯度酒精脱水,石蜡包埋,切片(4 μm),HE染色。镜下观察并拍照。
1.8 统计学分析计量资料以x±s表示,采用SPSS 13.0软件进行统计学分析,多组间采用单因素方差分析,进一步的两组间比较采用Student-Newman-Keuls法(q检验),以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 肠道菌群结果分析 2.1.1 DGGE图谱粪菌移植后第3周,供体小鼠的大部分菌群分别在两组移植小鼠肠道内得到定植,如FA组中条带1、5、6、7、8、9、10、11,以及NR组中12、16、17、18和19(图 1)。由图 2可知,OVA致敏前,NR组与FA组相比,条带不同。NR组的优势条带7、8和9在FA组中很难检测得到,而FA组的优势条带2、3和10在NR组中未检出。OVA致敏后,条带7、8和9在NR-o组仍是优势条带,FA-o组的优势条带是10和11。NR-o与NR组相比,增加了条带1和4;而FA-o 与FA组相比,优势条带增加了5,条带2和3变得不清晰。
2.1.2 UPGMA聚类分析
对4组移植小鼠肠道菌群V6~V8区DGGE图谱的数字化信息进行UPGMA聚类分析得到如图 3所示的树状图,显示明显的聚类分离现象,FA组和FA-o组各成一簇,NR组和NR-o组也只有条带4和10聚在不同的聚类枝上。
2.1.3 DGGE图谱PCA分析
V6~V8区DGGE图谱PCA分析见图 4,其中4种颜色代表4个组,每一个点代表图 4中的一个样本在空间上所处的位置。除了个别标本,4组在空间分布上相对独立,表明四者菌群结构差异显著。其中NR与NR-o组向中间聚拢,说明这两组菌群结构相对相似。
2.1.4 DGGE条带测序结果
如表 1所示,在这11个条带中,条带1、4、6和9代表的细菌属于厚壁菌门,8、10和11代表的细菌属于变形杆菌门,其中8为δ-变形杆菌,10为γ-变形杆菌,11为β-变形杆菌。条带5和7分别属于酸杆菌门和柔膜菌纲中的支原体科。条带1、4、6、8和9在NR组和NR-o组占优势,说明过敏组厚壁菌门菌和δ-变形杆菌的量减少;条带10、11在FA组和FA-o组明显,说明过敏组γ-变形杆菌和β-变形杆菌的量增加。
条带编号 | 长度(bp) | 最相似菌属 | 相似度 |
1 | 388 | Lactobacillus rogosae | 93% |
2 | 418 | Candidatus Arthromitus sp | 99% |
3 | 418 | Candidatus Arthromitus sp | 100% |
4 | 375 | Eubacterium contortum | 98% |
5 | 486 | Edaphobacter aggregans | 86% |
6 | 359 | Clostridium scindens | 94% |
7 | 413 | Allobaculum stercoricanis | 93% |
8 | 421 | Desulfovibrio | 96% |
9 | 413 | Oscillibacter valericigenes | 95% |
10 | 418 | Delftia sp | 99% |
11 | 347 | Stenotrophomonas maltophilia | 93% |
2.2 OVA致敏后移植小鼠临床表现和肠道组织形态学改变
OVA致敏后FA-o组7只小鼠中6只出现不同程度的烦躁不安或抓耳挠腮、活动减少或俯卧不动、粪便变稀;NR-o组小鼠无明显临床表现。空肠组织HE染色可见,FA-o组小鼠空肠绒毛上皮细胞出现局灶性坏死、脱落,炎性细胞浸润等较严重的炎性病理改变,NR-o组肠绒毛断裂和炎性细胞浸润不明显,空肠组织形态结构完整,无明显病理变化(图 5)。FA-o组与NR-o组小鼠空肠组织形态学改变分别与其供体小鼠(图 6)相似。
3 讨论 3.1 无菌小鼠能较好地维持粪菌移植后的菌群结构,过敏和无过敏反应小鼠肠道菌群存在差异
粪菌移植后第3周的V3区DGGE图谱显示,与供体小鼠相比无论是过敏组还是无过敏反应组,条带多数一致,说明两组肠道菌群均得到了较好的定植,能代表过敏鼠和无过敏反应鼠的菌群结构。由于我们选择粪菌移植后的第3周检测,所以少数条带没有显示,可能与少数菌株因时间短尚未定植或尚未稳定,或其数量低于PCR-DGGE技术的检测限值(细菌数量大于总菌数量的1%才能被检出)有关。张晓婧等[11]在比较两种不同品系小鼠人源化菌群模型的肠道菌群研究中指出,两种小鼠定植的菌群条带随时间的推移而明显增加,到第4周趋于稳定。
为避免单个区域检测可能存在的片面性[12-13],对菌群16S rRNA的V6~V8区进行PCR-DGGE分析,结果显示,移植后第3周,两组移植小鼠菌群结构差异显著。DGGE图谱经Quantity One分析数字化转化而来的菌群聚类分析图和主成分分析图也表明,FA组和NR组粪便菌群不同,说明过敏小鼠和 无过敏反应小鼠的肠道菌群存在差异,这与人群的研究报道[14]一致。
本研究中,测序的11种菌主要为厚壁菌门和变形杆菌门。无过敏反应组中厚壁菌门的细菌占优势,过敏组中变形菌门的细菌占优势。这与Noval-Rivas等[15]的 研究结果一致,他们将IL-4受体基因突变(会增加食 物过敏的易感性)的小鼠和野生型对照小鼠用OVA致敏后比较菌群变化,发现IL-4受体基因突变小鼠的菌群中厚壁菌门的量减少,而γ-变形杆菌数量增加。
3.2 肠道菌群不同使小鼠对OVA的敏感性不同,肠道菌群异常可能是食物过敏的始动因素,肠道菌群可传递食物过敏的敏感性无菌Balb/c小鼠是具有一致基因背景的近交系小鼠[16],且无菌状态又避免了环境因素的干扰,因此它们具有完全相同的遗传背景。我们将过敏和无过敏反应小鼠的粪便分别移植给无菌小鼠后再用OVA致敏,移植了过敏小鼠粪菌的小鼠出现了明显的胃肠道过敏反应和较严重的肠道病理改变,而移植了无过敏反应小鼠粪菌的小鼠则无明显胃肠道反应及肠道病理改变。因肠道菌群的差异而引起移植小鼠对OVA致敏产生了不同的反应,说明肠道菌群不同使无菌小鼠对OVA的敏感性不同。因此,我们可以认为,肠道菌群的变化可能是导致食物过敏发生的始动因素。
另一方面,移植小鼠对OVA致敏后的表现分别与粪便供体小鼠对OVA致敏后的表现相似,说明小鼠对OVA的敏感性可以通过肠道菌群的水平移植来传递。有研究者将肥胖者的粪便移植给无菌小鼠后,能使移植小鼠的体质量增加[17-19]。Le-Roy等[20]将非酒精性脂肪肝小鼠和正常小鼠的粪便移植于无菌小鼠,然后给予相同的高脂饮食,结果移植了非酒精性脂肪肝小鼠粪便的小鼠出现非酒精性脂肪肝的症状,而移植了正常小鼠粪便的小鼠未出现类似症状。说明,患这些疾病的人或动物的肠道菌群可传递该病的易感性或者导致该病在另一个体发生。
综上所述,本研究证实肠道菌群异常可能是食物过敏发生的始动因素,肠道菌群还可通过宿主之间的粪菌移植来传递食物过敏的敏感性。但尚需更大样本量的随机对照试验,甚至直接将食物过敏患者的肠道菌群引入动物做深入研究,以进一步验证肠道菌群在食物过敏发生中的始动作用,为临床上食物过敏的诊治提供更准确而有效的理论依据。
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