类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei，BP)是一种革兰阴性杆菌，主要存在水或土壤中，极易感染与传播，主要引起以肺炎和多发性脓肿为特点的类鼻疽病，该病诊断难，致病性强，治疗困难，死亡率高达40%，目前尚无针对类鼻疽的有效疫苗[1-3]。研究表明，类鼻疽杆菌在全球的分布范围正在逐步扩大，故加强类鼻疽的研究对疾病的防治具有重要意义[4]。类鼻疽杆菌致死因子1(Burkholderia lethal factor 1，BLF1)是类鼻疽杆菌被发现的第1个重要致病因子，进入机体后能够促进宿主细胞真核翻译起始因子4A(eukaryotic translation initiation factor 4A，eIF4A)的第339位谷氨酰胺(Gln339)脱酰胺变为谷氨酸(Glu339)，使其失去mRNA的解旋酶活性，抑制蛋白质的翻译起始阶段，进而抑制蛋白质的合成，使感染宿主细胞受到损伤，导致疾病的发生[5]。获取BLF1毒素并研究其致病机制对类鼻疽的诊断及防治具有重要意义。
近年来，随着蛋白合成抑制剂在抗肿瘤治疗方面的作用逐渐被认可，人们对蛋白质翻译起始因子eIF4A的抑制剂在靶向抗肿瘤治疗中的应用的关注度也越来越高[6-7]。BLF1作为潜在的eIF4A解旋酶活性抑制剂，能够抑制蛋白质的合成。那么我们可以设想，如果将该毒素递送至肿瘤细胞后，毒素是否具有广谱杀伤肿瘤细胞的作用呢？目前国内外尚少见关注于BLF1与肿瘤细胞的报道[8]。本研究拟通过基因工程技术重组表达BLF1(rBLF1)蛋白，初步研究BLF1对肿瘤细胞的杀伤作用，为进一步研究该蛋白在抗肿瘤治疗中的应用提供依据。
1 材料与方法 1.1 材料BPC006菌株、宿主菌E.coli XL1-Blue、pGEX-6P-2质粒、A549细胞为本实验室保存；细菌DNA基因组提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自 美国Omega公司；高保真DNA聚合酶、 BamHⅠ和XhoⅠ限制性内切酶、DNA连接酶、DNA Marker、蛋白Marker购自大连TaKaRa公司；PreScission protease(PSP酶)购于瑞士GE Healthcare公司； HRP标记山羊抗兔IgG抗体，购自北京中杉金桥公司；细胞计数试剂盒购于日本Dojindo公司。
1.2 方法 1.2.1 pGEX-6P-2-BLF1表达载体的构建以BPC006 株的全基因组DNA为模板，引物序列正义链： 5′-CGGGATCCATGCCCAACTCACTCGAAG-3′ (BamHⅠ);反义链：5′-CCGCTCGAGCTATTGCTTGCGCTGCTG-3′(XhoⅠ)，PCR扩增目的基因BLF1(636 bp)，将BLF1片段和pGEX-6P-2质粒同时进行BamHⅠ/XhoⅠ双酶切，酶切产物用DNA ligation mix于16 ℃连接4 h，连接产物转化E.coli XL1-Blue感受态细胞，在含氨苄的LB平板上37 ℃过夜培养，挑取阳性单克隆转接于氨苄抗性的LB液体培养基中过夜培养，提取质粒，进行BamHⅠ/XhoⅠ双酶切验证，将双酶切验证正确的质粒进行DNA测序。
1.2.2 rBLF1蛋白的表达和纯化阳性重组工程菌于37 ℃培养至D(600)为0.6~0.8，加入0.2 mmol/L IPTG于30 ℃诱导3 h后收集菌体，SDS-PAGE检测融合蛋白GST-BLF1的表达情况。菌体加入PBS缓冲液 重悬菌体，200 W超声裂解15 min，于4 ℃、12 000 r/min 离心20 min，分离上清和沉淀。将含有GST-BLF1融合蛋白的上清与Glutathione Sepharose 4B室温旋转结合4 h，4 ℃、12 000 r/min离心5 min，收集特异性结合GST融合蛋白的Glutathione Sepharose 4B，并加入等体积PBS缓冲液和PreScission protease(PSP酶)，于4 ℃旋转酶切过夜。4 ℃离心后收集上清，SDS-PAGE检测rBLF1蛋白的纯度。
1.2.3 多克隆抗体的制备及鉴定2 mg纯化rBLF1蛋白制品，以等体积弗氏完全佐剂充分乳化后，皮下多点接种于新西兰大白兔，每间隔7 d接种1次，共接种3次，第3次加强免疫14 d后进行心脏取血，分离血清于－80 ℃保存备用。
rBLF1蛋白作为抗原包被酶标板(0.4 μg/孔)，5%的脱脂奶粉封闭，间接ELISA检测抗体效价，倍比稀释抗血清(1 ∶10 000~1 ∶1 280 000)，HRP标记的山羊抗兔IgG为二抗，未免疫家兔血清作为阴性对照，检测抗体滴度，结果判断标准：A样品≥2.1A阴性。
将目的蛋白条带转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)薄膜上，加入抗血清孵育后，以HRP标记的山羊抗兔IgG抗体检测rBLF1蛋白的特异性条带，牛血清白蛋白(BSA)作为对照。
1.2.4 动物毒性实验选取50只6周龄雌性BALB/c小鼠，分为5组，每组10只。其中4组分别经腹腔注射150、100、50、25 μg rBLF1蛋白，另1组注射同体积PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)作为对照，观察小鼠生存率。
1.2.5 细胞毒性实验将处于对数期生长的A549细胞加入96孔板中(1×103/孔)，5%CO2，37 ℃孵箱中培养。次日加入rBLF1蛋白以及5倍和10倍量的多克隆抗体中和后的rBLF1蛋白，每孔蛋白浓度分别为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 μg/mL；并设阳性对照：吡柔比星；阴性对照：0.01 mol PBS缓冲液 (pH 7.4)及空白对照。每隔48 h 更换1次药物，120 h后用CCK-8试剂盒检测活细胞的数量。
1.3 统计学处理数据采用GraphPad Prism 5统计软件进行处理。
2 结果 2.1 BLF1基因的扩增及原核表达载体pGEX-6P-2-BLF1的构建以BPC006株全基因组DNA为模板，经PCR扩增得到目的基因BLF1(636 bp)，重组质粒pGEX-6P-2-BLF1经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定目的片段与理论大小一致(图 1)，DNA测序结果与GenBank公布的BLF1基因序列一致。
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| M：DNA标准；1：BLF1基因扩增产物；2：质粒pGEX-6P-2经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切产物；3：重组质粒pGEX-6P-2-BLF1经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切产物 图 1 BLF1基因的扩增及重组质粒的鉴定 |
2.2 rBLF1蛋白的诱导表达
重组质粒pGEX-6P-2-BLF1转化E.coli XL1-Blue，菌液经IPTG诱导表达的GST-BLF1融合蛋白与预期蛋白相对分子质量一致，表达量达90%，且主要为可溶性表达(图 2)。
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| M：标准；1：菌液pGEX-6p-2/XL1-Blue；2：菌液pGEX-6p-2/XL1-Blue于30 ℃诱导3 h；3:菌液BLF1/XL1-Blue；4：菌液BLF1/XL1-Blue 30 ℃诱导3 h；5：菌液BLF1/XL1-Blue经超 声破碎后的沉淀； 6：菌液BLF1/XL1-Blue经超声破碎后的上清 图 2 融合蛋白在E.coli XL1-Blue中的表达 |
2.3 rBLF1蛋白的纯化
将表达的GST-BLF1融合蛋白纯化后，用PreScission protease(PSP酶)将GST标签切除，得到rBLF1，经SDS-PAGE检测表明rBLF1条带为23×103，与预期相对分子质量一致(图 3)。
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| M：标准；1：GST-BLF1融合蛋白；2：GST标签；3：rBLF1 图 3 rBLF1蛋白的纯化 |
2.4 多克隆抗体的制备
重组蛋白免疫家兔，ELISA检测结果显示，抗体滴度达1 280 000。以BLF1蛋白作为抗原制备的抗血清作为一抗，以山羊抗兔IgG作为二抗对rBLF1进行Western blot分析，在23×103出现特异性免疫印迹条带(图 4)。
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| M：标准；1：rBLF1；2：BSA 图 4 rBLF1多克隆抗体的免疫印迹检测 |
2.5 动物毒性实验
rBLF1通过腹腔注射于BALB/c小鼠后可引起动 物死亡。5 d内，小鼠基本无死亡；毒素蛋白剂量为25 μg 时，小鼠死亡率为10%，后期小鼠死亡率随着蛋白剂量的增加而升高(图 5)。
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| 图 5 rBLF1蛋白对BALB/c小鼠的致死作用 |
2.6 细胞毒性实验
正常生长的A549细胞折光性好，胞膜较清晰，胞质透亮。经rBLF1蛋白作用120 h后，可见96孔板内A549细胞贴壁减少，胞质圆缩，随着蛋白浓度的升高，细胞多见碎片或明显皱缩。经CCK-8试剂盒检测可见细胞存活率随着rBLF1蛋白浓度的增加而降低，呈剂量依赖性，而rBLF1蛋白经多克隆抗体中和后，细胞存活率增高，说明rBLF1能够杀伤A549细胞，而多克隆抗体能够抑制rBLF1蛋白杀伤作用(图 6)。
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| 图 6 rBLF1蛋白对A549细胞的毒性作用 |
3 讨论
BLF1作为类鼻疽杆菌的首个被发现的致死因子，在致病过程中发挥重要作用，于2011年被英国科学家Cruz-Migoni等[5]发现。BLF1由BPSL1549基因编码，结构类似于大肠杆菌细胞毒性坏死因子1(CNF1-C)，主要通过干扰蛋白质翻译起始，导致肌动蛋白细胞骨架的改变，并最终导致细胞死亡[9-10]。本研究采用pGEX载体，高效表达了GST-BLF1融合蛋白，并运用亲和层析方法纯化获得了纯度较高的rBLF1蛋白，经细胞和动物实验证实其具有生物学活性。
类鼻疽杆菌的致病机制尚不清楚，而BLF1作为其第1个被发现的能够导致死亡的毒力因子，在类鼻疽杆菌的致病中发挥着重要作用。类鼻疽的临床表现与多种疾病相似，故诊断极难，而BLF1作为类鼻疽杆菌的致死因子，能够引起强烈的免疫应答，其特异性的抗体检测将来可用于类鼻疽的实验室诊断。同时毒素BLF1的蛋白结构解析及其作用于细胞的分子生物学机制的研究，为寻找新型药物靶点奠定了坚实的理论基础，如将BLF1作为靶点研究新型的小分子药物，可用于钝化BLF1 的作用位点，阻止其脱酰胺作用，进而防止细胞损伤，阻止疾病的发生。因BLF1对细胞的毒性较高，Cruz-Migoni等[5]对其活性位点进行突变后，突变体C94S毒性显著下降，其谷氨酰胺脱酰胺酶活性受到抑制，将来可作为疫苗候选抗原。
BLF1作用靶点为蛋白翻译起始因子eIF4A 的解旋酶，能够抑制宿主细胞蛋白合成。本实验证实毒素rBLF1具有广谱细胞毒性，既能明显杀伤肿瘤细胞，同时也能杀伤正常细胞。但是从动物实验结果我们可看出，该毒素对正常小鼠致死剂量较高(与其他生物毒素如蓖麻毒素10 μg/kg相比)作用速度较慢(5 d以前未见死亡)，说明正常细胞对其可能具有一定耐受性。而肿瘤细胞生长旺盛，则更利于毒素的作用发挥。rBLF1表现出对肿瘤细胞比较敏感、具有耐受正常细胞的特点[11]，为毒素的抗肿瘤治疗提供了可行性。进一步我们正在探索毒素的治疗用药窗口剂量，使其在杀伤肿瘤细胞的同时不影响正常细胞的功能。另外，BLF1是一种生物毒素，作为肿瘤药物作用于机体后，对正常细胞仍然具有一定的毒副作用，为了降低其毒副作用，可采用靶向给药方式将毒素递送至肿瘤细胞，如可通过双特异性抗体技术、抗体融合技术将BLF1结合的单克隆抗体或整合素αVβ3配体RGD肽靶向呈递肿瘤靶细胞发挥其肿瘤杀伤作用[12-15]。
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