2. 400037 重庆,第三军医大学新桥医院妇产科 ;
3. 400037重庆,第三军医大学新桥医院超声科
2. Department of Obstetrics and Gynecology, Xinqiao Hospital, Chongqing, 400037, China ;
3. Department of Ultrasonography, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400037, China
宫颈肿瘤是女性常见肿瘤,其发病率高,全球年发病例数46 000,其中发展中国家占80%,我国每年新发病例占全球新发病例近30%,经过规范化治疗,其5年生存率达80%[1]。传统的宫颈癌治疗方式为实施子宫及盆腔根治性切除手术,近年来随着宫颈癌发病日趋年轻化,患者对生育及生活质量的要求逐渐增高,因此化学治疗逐渐受到重视,化疗后宫颈肿瘤的手术切除率约为48%~100%,5年生存率约为83%明显高于行传统手术及放疗的5年生存率(40%~50%)[2]。但肿瘤对化疗耐药反应及化疗药物的毒副作用使化疗应用受到限制,有学者曾利用超声增强化疗药物对肿瘤的杀伤作用,同时通过降低化疗药物的用量而减轻化疗对正常细胞的毒副作用[3]。本课题组前期研究发现不同强度、不同频率的超声波联合微泡介导的空化效应能对肿瘤内部微小血管产生不同程度的影响,高声压超声波多数造成肿瘤血管的损毁,血栓形成,肿瘤细胞结构破坏,低声压超声波可使肿瘤血管扩张,肿瘤血流灌注增强[4];此外,低能量超声产生的空化效应可以避免高声压高能量超声对细胞产生的直接破坏,如使细胞破裂,坏死[5]。因此,低频率低声压超声以其较小的副作用为优势更具有临床应用价值。本实验中,运用低频率低声压超声联合微泡辅助顺铂作用于宫颈癌Hela细胞,通过检测细胞的增殖凋亡情况研究超声联合微泡增强宫颈癌化疗的可行性。
1 材料与方法 1.1 实验材料与仪器人宫颈癌细胞株Hela由第三军医大学新桥医院中心实验室惠赠,DMEM高糖细胞培养基、胎牛血清、0.25%胰酶、青霉素-链霉素双抗、磷酸盐缓冲液(Hyclone,USA),细胞增殖与活性检测试剂盒(Dojindo,Japan),“脂氟显”微泡造影剂为第三军医大学新桥医院超声科自制并由刘政教授惠赠,核心气体为全氟丙烷,平均粒径2μm,浓度约为(4~9)×109/mL,顺铂(大连美仑),Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(BD, USA),Hoechst33342(碧云天);仪器:新型数字化超声空化治疗仪(DCT-700型,深圳市威尔德医疗电子有限公司生产),倒置荧光显微镜(Olympus CKX41),酶标仪(Bio-Rad),CO2恒温细胞培养箱,流式细胞仪(BD FACSCalibur)。
1.2 分组与方法 1.2.1 细胞培养及分组人宫颈癌Hela细胞在DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium, 改良杜氏伊格尔培养基)中培养,培养基含有10%的胎牛血清和1%青霉素-链霉素,并置于37℃、5% CO2孵箱中培养,每2~3 d传代1次,取对数生长期的Hela细胞以0.25%胰酶消化后,制备单细胞悬液用于实验;实验分为5组,顺铂组(P),超声+顺铂组(PU),超声+微泡+顺铂组(PUM),超声+微泡组(UM),空白对照组(C)。
1.2.2 超声辐照参数使用深圳市威尔德公司生产超声空化治疗仪,治疗头截面呈圆形,面积2.5 cm2,为平面式换能器,本实验将超声探头水平置于细胞培养皿液面内,与培养皿底部保持5~10 mm间距,并匀速旋转探头均匀辐照肿瘤细胞;超声参数设置为频率1 MHz,声压400 kPa,占空比1%,辐照时间60 s。
1.2.3 测定顺铂对Hela细胞的毒性作用及其联合超声微泡对细胞增殖活性的影响将顺铂标准品溶解于生理盐水中,使用细胞培养液稀释药物,使其终浓度分别为15、10、7.5、5、2.5、1μg/mL, 每组设3个复孔。取8×103/孔细胞接种于96孔板中,设立空白对照组,于37℃,5%CO2孵箱中培养24 h后,弃去培养基,加入CCK-8溶液10μL,37℃,5%CO2孵育1 h。用酶标仪检测各孔波长450 nm处光密度(A)值,并取平均值,同时设以空白培养基为对照,按公式计算细胞增殖率,计算细胞增殖抑制率=[(实验组A值-阴性对照组A值)/阴性对照组A值]×100%。用IC50计算软件计算出50%抑制浓度(IC50,half maximal inhibitory concentration),为后续实验提供浓度参考。
取对数生长期细胞用于增殖活性测定实验,按照实验分组:顺铂组(P)使用顺铂终浓度为半数抑制浓度4.882μg/mL的培养液7 mL培养Hela细胞;超声+顺铂组(PU)在细胞培养皿内加入含4.882μg/mL顺铂的等量培养基后进行超声辐照;超声+顺铂+微泡组(PUM)在细胞培养皿中同时加入含4.882μg/mL顺铂和106/mL微泡的等量细胞培养液后进行超声辐照;超声+微泡组(UM)仅在培养基中加入106/mL微泡后进行超声辐照;空白对照组(C)加入等量培养液。将上述处理后的细胞接种于96孔板,每孔100μL, 每组设3个复孔。放入孵箱继续培养,分别检测24、48、72、96 h Hela细胞的增殖情况。
1.2.4 流式细胞仪检测及Hoechst33342染色评价细胞凋亡取对数生长期的Hela细胞按照8×105/皿接种于细胞培养皿中,按照前述分组、处理细胞并置于孵箱中培育24 h,收集所有悬浮及贴壁细胞,进行Annexin V-FITC/PI双染色,使用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。
将P组,PU组,PUM组,UM组,C组细胞弃去培养基,PBS漂洗2次后加入Hoechst33342染液1 mL,37℃孵箱染色30 min后,使用荧光显微镜观察并摄像,每组均随机选取高倍镜下5个视野,计数凋亡细胞个数,并根据每个视野镜下凋亡细胞数/每个视野镜下细胞总数=细胞凋亡率,比较各组细胞凋亡情况。
1.3 统计学处理数据以x±s表示,根据直线回归方程计算药物50%抑制浓度(IC50),使用SPSS 18.0软件进行统计分析,两组间比较行独立样本t检验,两组以上的比较行单因素方差分析。
2 结果 2.1 顺铂对Hela细胞的毒性作用的测定CCK-8检测结果显示,用不同浓度的顺铂处理细胞24 h后,细胞增殖受到不同程度的抑制,并且随着顺铂浓度的增加细胞的毒性作用增强。浓度为15、10、7.5、5、2.5、1μg/mL的顺铂作用Hela细胞24 h后的抑制率分别为:71%、71%、69%、58%、20%、18%。通过终浓度抑制率回归曲线图计算得出其IC50值为4.882μg/mL(图 1)。
2.2 各处理组细胞的增殖活性检测
分别检测各组细胞在24、48、72、96 h时生长情况,发现PUM组的生长明显受到抑制,增殖速度减慢,P组和PU组的肿瘤细胞在48 h前生长缓慢, 48 h时,PUM组、PU组、P组的抑制率分别为59%、42%、42%,但48h后生长速度明显加快,呈现持续的快速增长,对照组和UM组生长趋势大致相同无明显差异,此外,P组及PU组细胞增殖活性分别在60、72 h超过不含顺铂的对照组及UM组,而PUM组在48 h增殖活性稍有增高,但与对照组及UM组相比无明显增殖优势(图 2)。
2.3 各处理组细胞的凋亡检测
超声+顺铂+微泡组(PUM)在处理后24 h细胞凋亡率(Annexin V+PI-+Annexin V+PI+)为58.1%,单纯顺铂组(P)和顺铂+超声组(PU)的凋亡率分别为25.3%、41.5%,对照组(C)和超声+微泡组(UM)的凋亡不明显,根据图 3,比较各组凋亡率,可见PUM组肿瘤细胞凋亡明显高于P组、PU组,各组差异均有统计学意义(P < 0.05)(图 3)。
Hoechst33342染色后通过荧光显微镜观察A细胞分布均匀,图中可见弥漫的正常细胞核的低强度荧光,B可见仅有数个细胞胞核呈浓染致密的固缩状态,显示为高强度荧光,C、D、E显示凋亡细胞数量逐渐增多,细胞染色质密度增高,细胞核明显固缩、凝聚,形成典型的凋亡细胞,胞核蓝染高亮,且这类细胞在PUM组明显增多(图 4)。
3 讨论
目前, 超声联合微泡在临床肿瘤中的应用已不仅仅局限于对肿瘤的观察及诊断,其对肿瘤的治疗作用也逐渐崭露头角[6],以往的研究多是通过高声压高能量超声对肿瘤细胞造成损伤,损毁肿瘤微血管从而达到治疗肿瘤的目的[7],有学者发现低声压[8-9]产生的空化效应也会对细胞膜产生影响,易化药物进入肿瘤细胞而发挥作用,从而增强细胞毒性。国外的学者[10]使用低声压超声辐照头颈部鳞癌细胞系,认为微泡联合超声治疗(microbubble-mediated ultrasound therapy,MB-UST)能增强细胞膜对一种小分子荧光素的摄取,他们又使用荧光标记化疗药物,发现用超声联合微泡辐照组与单药治疗组相比,细胞内药物增加28%。Kotopoulis等[11]将MB-UST使用在胰腺癌化疗的患者中,经超声联合微泡治疗后的10例患者中,2例生存期超过1年,与胰腺癌传统化疗的生存期(仅3~6个月)相比,MB-UST显示出明显的优势,并使得此项研究备受关注;并且低声压超声激励联合化疗是诱导肿瘤细胞发生改变而增加其对化疗药物的敏感性,与通过超声击破载药微泡[12]的给药方式相比具有明显的优势,因后者药物装载有限,超声联合微泡的作用时间也受限制,制约了其使用范围,也较难达到预期治疗效果。
铂类药物是目前治疗妇科肿瘤最为有效的化疗药物之一,有文献报道其反应率高达23%~50%,宫颈癌的化疗方案中,以顺铂为基础的联合方案应用最广泛[13]。2015年美国NCCN指南中针对宫颈癌的化疗无论是联合化疗还是单药化疗均将顺铂作为一线用药治疗复发或转移的宫颈癌患者[14]。尽管如此,顺铂耐药是制约其应用的一个重要因素,在卵巢癌中因铂类药物耐药,有62%卵巢癌患者最终复发或疾病持续存在[15],但耐药作用分子机制复杂,至今尚未明确。低频率低声压超声微泡联合顺铂的化疗对手术前需要利用化疗来局限病灶,缩小肿块的患者可能有着较为重要的临床意义,为此,本研究通过体外实验证实超声联合微泡能影响化疗药物作用下肿瘤细胞的增殖和凋亡。通过分析肿瘤细胞的增殖曲线,48 h时,顺铂组(P)、顺铂+超声组(PU)、顺铂+超声微泡(PUM)细胞生存率分别为75%、75%、58%,48~72 h,单纯顺铂组(P)及顺铂+超声组(PU)肿瘤细胞的增殖出现加快趋势(在此期间增殖率分别增加了49%、36%),推测是由于肿瘤细胞对顺铂产生了一定程度上的耐药引起的,相比之下,超声+微泡+顺铂组(PUM)的肿瘤细胞增殖速度改变不明显(增殖率增加了30%),72 h后,单纯顺铂组(P)和顺铂+超声组(PU)的细胞增殖活性已明显超过对照组(C)和超声+微泡组(UM), 而顺铂+超声微泡组(PUM)细胞仍增殖缓慢,数量较少,这可能是由于超声微泡联合顺铂的处理方案延缓了肿瘤细胞的耐药现象的产生。关于低频超声联合微泡介导的化疗对凋亡的影响,有学者认为与胞内药物浓度密切相关。董虹美等[3]运用高效液相色谱法测定各组细胞内化疗药物浓度,同样发现超声联合微泡作用后细胞内药物浓度为0.58μg/mL,较单纯药物组0.39μg/mL有了明显增高,这可能与超声联合微泡产生“空化效应”密切相关,即微泡在超声波作用下谐振,发生压缩膨胀、破碎等一系列形态变化,并在此过程中使肿瘤细胞膜表面产生大量微小孔隙,促进细胞的内吞作用,改变细胞膜表面的酶活性,使药物能快速大量进入细胞内,致使细胞凋亡增加。通过对各组处理后的细胞进行Hoechst33342染色及Annexin V+PI染色流式细胞仪分析,超声+微泡联合顺铂作用后,出现较多的典型凋亡肿瘤细胞,或许是由超声联合微泡增强了肿瘤细胞对药物的摄取而引起的。本部分结果也进一步印证了董虹美等的研究结论。另外有数据显示超声的频率、作用时间及药物剂量是影响凋亡和增殖的关键因素。Yang等[16]通过研究在超声微泡作用下阿霉素对K562细胞的毒性作用,比较了不同药物剂量,不同超声作用时间及频率对细胞的不同影响,发现超声频率轻微增加可增强阿霉素的抗肿瘤作用,延长超声作用时间同样可增强药物的疗效;这提示我们在低频超声联合微泡介导的宫颈癌化疗的基础理论研究中,超声辐照的强度、辐照持续时间、微泡造影剂浓度,微泡大小与空化作用的效应强度及作用的相关性仍需给予更多的关注并深入探讨研究。
[1] | PartridgeEE, Abu-Rustum N, Giuliano A, et al. Cervical cancer screening[J]. JNatl Compr Canc Netw,2014, 12 (3) : 333 –341. |
[2] | Dottino J A, Cliby W A, Myers E R, et al. Improving NCCN guideline-adherent care for ovarian cancer: Value of an intervention[J]. Gynecol Oncol,2015, 138 (3) : 694 –699. DOI:10.1016/j.ygyno.2015.06.013 |
[3] | 董虹美, 王志刚, 冉海涛, 等. 低频超声辐照微泡造影剂增强米托蒽醌对乳腺癌细胞的毒性作用[J]. 中国医学影像技术,2010, 26 (3) : 401 –404. DOI:10.13929/j.1003-3289.2010.03.041 |
[4] | 薛雯, 张莉, 李莎, 等. 超声峰值负压与肿瘤微循环阻断程度的相关性研究[J]. 中国超声医学杂志,2014, 30 (4) : 372 –375. |
[5] | 李莎, 张金龙, 崔海, 等. 微泡增强的超声空化效应对兔肌肉和肺微血管的损伤作用[J]. 第三军医大学学报,2013, 35 (22) : 2439 –2442. DOI:10.16016/j.1000-5404.2013.22.004 |
[6] | Ibsen S, SchuttCE, Esener S. Microbubble-mediated ultrasound therapy:areview of its potential in cancer treatment[J]. Drug Des Devel Ther,2013, 3 (7) : 375 –388. DOI:10.2147/DDDT.S31564 |
[7] | Liu Z, Gao S, Zhao Y, et al. Disruption of tumor neovasculature by microbubble enhanced ultrasound:apotential new physical therapy of anti-angiogenesis[J]. Ultrasound Med Biol,2012, 38 (2) : 253 –261. DOI:10.1016/j.ultrasmedbio.2011.11.007 |
[8] | Hwang J H, Brayman A A, Reidy M A, et al. Vascular effects induced by combined 1-MHz ultrasound and microbubble contrast agent treatments in vivo[J]. Ultrasound Med Biol,2005, 31 (4) : 553 –564. |
[9] | Wood A K, Sehgal C M. Areview of low-intensity ultrasound for cancer therapy[J]. Ultrasound Med Biol,2015, 41 (4) : 905 –928. DOI:10.1016/j.ultrasmedbio.2014.11.019 |
[10] | Heath C H, Sorace A, Knowles J, et al. Microbubble therapy enhances anti-tumor properties of cisplatin and cetuximab in vitro and in vivo[J]. Otolaryngol Head Neck Surg,2012, 146 (6) : 938 –945. DOI:10.1177/0194599812436648 |
[11] | Kotopoulis S, Dimcevski G, Gilja O H, et al. Treatment of human pancreatic cancer using combined ultrasound, microbubbles, and gemcitabine:aclinical case study[J]. Med Phys,2013, 40 (7) : 072902 . DOI:10.1118/1.4808149 |
[12] | 张丽, 谢明星. 超声靶向微泡击破介导基因转染或药物传输的研究进展[J]. 中国医学影像技术,2010, 26 (7) : 1366 –1369. DOI:10.13929/j.1003-3289.2010.07.012 |
[13] | Torre L A, Bray F, Siegel R L, et al. Global cancer statistics, 2012[J]. CA CancerJClin,2015, 65 (2) : 87 –108. DOI:10.3322/caac.21262 |
[14] | 周晖, 卢淮武, 彭永排, 等. 《2015年NCCN宫颈癌临床实践指南》解读[J]. 中国实用妇科与产科杂志,2015, 3 (31) : 185 –191. DOI:10.7504/fk2015020101 |
[15] | Yakirevich E, Sabo E, Naroditsky I, et al. Multidrug resistance-related phenotype and apoptosis-related protein expression in ovarian serous carcinomas[J]. Gynecol Oncol,2006, 100 (1) : 152 –159. |
[16] | Yang S, Wang P, Wang X, et al. Activation of microbubbles by low-level therapeutic ultrasound enhances the antitumor effects of doxorubicin[J]. Eur Radiol,2014, 24 (11) : 2739 –2753. DOI:10.1007/s00330-014-3334-3 |