Wang Yan, E-mail: wangyanflower@163.com
支气管哮喘是一种常见的由多种细胞和细胞因子参与的呼吸道慢性炎症性疾病[1, 2]。而气道壁的形态在哮喘病理过程中并不仅仅呈现出主要以嗜酸性粒细胞性炎症浸润,同时还伴随着特征性结构的变化,我们称之为气道重塑[3]。如今支气管哮喘气道重塑已被广泛认为发生于气道炎症早期[4],并随着炎症的持续而不断进展。气道重塑的主要病理特征包括:上皮杯状细胞化生,气道平滑肌肥大、增生,气道上皮下胶原沉积[5]。气道重塑的研究是近年来哮喘研究的一个热点,然而至今仍没有鉴定气道重塑模型的金标准,不同研究人员选择不同的激发时间来构建哮喘气道重塑小鼠模型,Qin等[6]雾化吸入激发8周,Lopez等[7]激发12周,而Shurin等[8]仅仅用了4 d,可见不同研究组构建气道重塑模型所用的激发时间相差甚大,使研究者们对气道重塑模型的构建产生诸多疑惑,而激发时间的长短是否会导致气道重塑模型的差异尚不清楚。本研究旨在通过观察不同雾化吸入激发时间哮喘小鼠的气道炎症和重塑相关的病理改变,以期探讨哮喘气道重塑的病理进展,摸索出合适的激发时间,为气道重塑模型的构建提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 动物及主要试剂4~5周龄雌性BALB/c小鼠36只,在SPF中饲养,由第三军医大学新桥医院实验动物中心提供,卵蛋白(ovalbumin,OVA)购自美国Sigma公司,氢氧化铝佐剂[(aluminumhydroxide,AL(OH)3)]购自美国Thermo公司,雾化器(ss-7B)购自江苏双盛医疗器械有限公司。
1.2 动物模型的分组与建立36只小鼠以随机数字表法分为6组,每组6只,即正常组和5个不同激发时间的模型组。各模型组第0、7、14天20 μg OVA腹腔注射致敏,注射体积为200 μL[含20 μg OVA溶于50 μL生理盐水+AL(OH)3 150 μL],第28~31天给予1% OVA雾化激发吸入35 min,每天1次,第35天起隔天1次,按雾化总时长2、4、6、8、10周分为2、4、6、8、10周组,正常对照组用等量生理盐水(NS)代替致敏和激发给药。
1.3 支气管肺泡灌洗各组末次激发24 h后每只小鼠用1%戊巴比妥钠200 μL腹腔注射麻醉后分离颈部组织,暴露气道,予24G型号的静脉留置针行气管插管,注入生理盐水行支气管肺泡灌洗,共2次,每次0.8 mL,平均回收率在80%以上,计细胞总数,离心后保留上清,100 μL生理盐水重悬沉淀后涂片,行HE染色,显微镜下计数至少300个细胞做嗜酸性粒细胞分类计数。
1.4 气道病理学分析打开胸腔,取左肺浸入4%多聚甲醛中固定24 h后,常规脱水石蜡包埋,切成5 μm厚切片。①进行 HE染色后对气道周围炎症细胞浸润程度进行0~4级 评分[9]:0分表示气道周围未见炎症细胞;1分表示气道周围可见少许炎症细胞;2分表示气道周围大部分区域被1层炎症细胞环绕;3分表示气道周围大部分区域被2~4层炎症细胞环绕;4分表示气道周围大部分 区域被4层以上炎症细胞环绕。②进行PAS染色后对气道上皮杯状细胞化生程度进行0~4级评分[10]:0分表示未见杯状细 胞化生;1分表示可见<25%的上皮细胞产生杯状细胞化生;2分表示可见25%≤上皮细胞<50%产生杯状细胞化生;3分表示可见50%≤上皮细胞<75%产生杯状细胞化生;4分表示≥75% 的上皮细胞产生杯状细胞化生。③利用Masson三色染色对内径在100~200 μm的气道基底膜厚度进行测量。光镜下每组随机选取10个视野进行评分和测量。
1.5 统计学分析采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析,数据以x±s表示。P<0.05表示差异有统计学意义。各组间比较采用单因素方差分析。
2 结果 2.1 各组小鼠细胞总数及嗜酸性粒细胞总数比较与正常组比较,各个激发时长的模型组的细胞总数和嗜酸性粒细胞总数均明显升高(P<0.001)。与2周组比较,10周组的细胞总数和嗜酸性粒细胞总数均明显升高(P=0.013,图 1)。
2.2 各组小鼠气道周围炎症细胞浸润程度比较正常组气道未见明显炎症浸润。与正常组比较,各气道重塑模型组气道均可见明显的气道炎症(P<0.001,图 2、3)。与2周组比较,其余4组气道周围炎症细胞浸润程度明显加重(P<0.01)。与4周组相比,10周组气道炎症细胞浸润更显著(P=0.038)。由此可见,随着激发时间的增加,气道炎症逐渐加重,并未出现随着激发时间延长导致免疫耐受而减轻气道炎症表现。
2.3 各组小鼠气道上皮细胞杯状细胞化生程度比较正常组未见明显气道上皮杯状细胞化生。与正常组比较,各模型组均出现显著的气道上皮杯状细胞化生(P≤0.001,图 4、5)。与2周组相比,10周组杯状细胞化生程度明显加重(P=0.024),提示气道上皮杯状细胞化生在激发早期就可以出现,但随着激发时间明显延长至10周,气道上皮杯状细胞化生进一步加重,表明气道重塑的形成可以通过更长激发时间来获得更为明显的病理现象。
2.4 各组小鼠气道基底膜厚度比较与正常组比较,2、4、6周组的肺间质中可见明显的胶原纤维增生,但基底膜厚度未见明显差异,直到8周组和10周组的基底膜厚度明显增大,差异有统计学意义(P<0.05,图 6、7)。以上结果表明气道基底膜的增厚这一病理改变需要激发时间达到8周以后才能表现出来。
3 讨论气道重塑被认为是慢性哮喘难以治疗甚至逐渐恶化的至关重要的病理机制,寻找气道重塑的治疗策略可能是重症哮喘或难治性哮喘的治疗的关键[11]。因此,构建气道重塑动物模型对于研究气道重塑的发生机制及治疗方法具有重要作用。然而,目前仍缺乏构建气道重塑动物模型的标准方法和公认指标。通过雾化吸入或滴鼻给予过敏源等方式激发小鼠并不能简单构建气道重塑模型,因为很多动物模型都只能短时间维持气道重塑的表现。Lloyd等[12]发现长时间的激发会导致免疫耐受,Shinagawa等[11]在使用BALB/c小鼠气道重塑模型中发现嗜酸性粒细胞总数在2周时达到峰值,3周时就明显下降,Yiamouyiannis等[13]研究证明早期出现的嗜酸性粒细胞会逐渐减少,气道炎症和气道高反应现象会逐渐消失[11]。因此,在构建气道重塑模型时,嗜酸性粒细胞持续性的炎症能否得到持续维持显得尤为重要。
本研究结果显示,采用BALB/c小鼠,以氢氧化铝为免疫佐剂,给予OVA腹腔注射致敏小鼠,相隔2周后1% OVA雾化激发2周即可明显观察到杯状细胞化生,胶原纤维沉积增多等哮喘气道重塑的部分病理特征,然后随着激发时间延长,并未出现免疫耐受现象,嗜酸性粒细胞总数和气道炎症并未如上所述发生减少的现象而是逐渐增多,以10周组最显著。长时间的激发充分保障了病理现象进一步进展的可能。肺组织病理结果也表明,炎症细胞浸润在2周组较正常组,4周组较2周组嗜酸性粒细胞浸润明显加重,有统计学差异,而6~8周气道炎症细胞浸润与4周组相比虽未出现统计学差异,但呈现缓慢增加的趋势,并且一直持续到10周,且10周组嗜酸性粒细胞总数和气道炎症细胞浸润较2周组与4周组均显著加重。而且杯状细胞化生现象也呈现与气道炎症细胞浸润相似表现,2周时出现明显杯状上皮细胞化生,此后4~8周组较2周组虽随激发时间而呈现缓慢加重趋势但并未有明显统计学差异,直至10周组才较2周组显著加重。由此可见2周时即可见明显的杯状细胞化生,胶原纤维沉积增多证实了气道重塑可产生于炎症早期,与以往研究一致[4]。而不同的是,气道基底膜增厚并未在激发早期出现。2周时虽可见增多的胶原纤维沉积,但是气道基底膜厚度并未有变化。气道重塑过程中所谓的“基底膜增厚”指的是基底膜黏膜下层胶原纤维沉积,肌成纤维细胞增生,血管生成以及气道平滑肌肥大增生[14]。有研究表明,增多的胶原纤维主要来自于气道与有炎症细胞渗出的血管之间的肺间质[4],然后随着炎症细胞向气道浸润而逐渐迁移并沉积在气道基底膜下。本实验病理结果显示2周时即可见肺间质中有胶原纤维沉积,并随着炎症细胞的趋化而向气道迁移,直至8周时才可见明显的基底膜增厚,表明胶原纤维的产生,迁移,沉积需要一个缓慢的过程,而不能像杯状细胞化生现象一般早期即可出现。同样,10周组气道基底膜的增厚显著重于2周组。因此,本研究结果表明雾化激发时间最长的10周组气道炎症和气道重塑均最显著重于2周组,而出现典型气道基底膜增厚需要激发至少8周。
总而言之,我们有理由相信,构建一个较为完整的哮喘小鼠气道重塑模型,需要在不发生免疫耐受,保持慢性嗜酸性粒细胞炎症的前提下,能够呈现较为全面的气道重塑病理特征。而我们观察到气道重塑尽管发生在嗜酸性炎症早期,但也仅仅是部分现象比如杯状细胞化生,胶原纤维增生。而相对更重要的气道壁增厚包括气道下纤维沉积,平滑肌肥大增生则必须经过较长时间的持续激发,本实验条件下至少需要激发8周。本研究结果阐明了气道重塑病理特征的形成需要大约8周的时间激发,且长时间持续激发并未诱导免疫耐受而导致气道炎症的减轻甚至消失,为哮喘气道重塑模型的构建提供了重要参考。但停止激发以后气道炎症和气道重塑改变能否继续维持,且本研究中缺乏气道高反应性的检测,因此仍需进一步研究,为今后气道重塑的研究提供更多的依据。
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