2. 400037 重庆，第三军医大学新桥医院：急诊科 ;
3. Department of Chemistry, Purdue University, West Lafayette, IN 47907, USA
2. Department of Emergency, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400037, China ;
3. Department of Chemistry, Purdue University, West Lafayette, IN 47907, USA
肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一种以肺血管压力增高为主要特征的临床综合征，在各种损伤因素的长期作用下，肺血管的内膜、中膜及外膜细胞增殖，管壁增厚，并有血管周围炎症及局部血栓形成，最终导致肺血管腔狭窄，肺动脉压力增高。它的持续发展会导致一系列的心肺疾病，包括慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺源性心脏病等，其最终结果会导致右心负荷增加，右心衰竭甚至死亡[1]。肺血管重构是肺动脉高压最重要的病理基础[2]，以往的研究表明，肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells, PASMCs)的异常增殖和凋亡失衡在肺血管重构中发挥关键作用[3]，并且近来的研究证实，自噬对哺乳动物细胞具有强大的调控机制，自噬在肺血管疾病发病机制中扮演重要作用[4]，并且自噬缺乏与衰老、肿瘤、神经退行性病变、炎症、动脉粥样硬化等多种疾病相关[5]。那么通过自噬调控PASMCs的增殖进而逆转肺血管重构，是治疗PAH、COPD、肺心病的一个重要方向。
哺乳动物雷帕霉素蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)，一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是细胞应对生理条件及环境压力时调控自噬及生长的关键成分。研究表明，mTOR激活可以抑制细胞自噬，促进其增殖[6]，这些都表明了以mTOR作为靶点是治疗上述心肺疾病的新策略。而纳米载体因其转染效率高、低毒等特点被广泛应用于基因靶向治疗中。本实验旨在通过构建能够高效转载mTOR小干扰RNA的新型核酸纳米载体，将其转入肺动脉平滑肌细胞，观察纳米载药系统的转染效率，并研究其对肺动脉平滑肌细胞自噬和增殖的作用。
1 材料与方法 1.1 主要试剂SD大鼠由第三军医大学实验动物中心提供，胎牛血清(美国GIBCO公司)，高糖DMEM(美国Hyclone公司)，Opti-MEM(美国Invitrogen公司)，0.25%胰蛋白酶(美国Hyclone公司)，DAPI染色液(中国江苏碧云天生物技术研究所)，X-tremeGENE siRNA转染试剂(瑞士罗氏公司)，Cyto-ID®Green自噬染色试剂盒(美国Enzo Life Sciences公司)，细胞总蛋白提取试剂盒M-PER Mammalian Protein ExtractionReagent(Thermo fishe公司)，兔抗大鼠p-mTOR、LC3B多克隆抗体及β-actin单克隆抗体(美国Cell Signaling Technology公司)，辣根酶标记山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)。
1.2 方法 1.2.1 DNA寡核苷酸、mTOR小干扰RNA (siRNA)的设计与合成DNA序列由计算机程序SEQUIN设计[7]，DNA序列如下：mT-2A：5′-AGTACTTGTCAT-GTACCAGCTGCTGTTAGAGATTGAAGGACGGAATA-3′；mT-1A3：5′-TTCAATCTCTATCATTCCGTCCTTCAATC-TCTATCATTCCGTCCTTCAATCTCTATCATTCCGTCC-3′。在GenBank上检索到mTOR mRNA的序列，设计mTOR siRNA序列1：5′-AAGGCAGATTTGCCAACTATCTATAGT-3′，序列2：5′-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGCA-3′，序列3:5′-CAGCAGCUGGUACAUGACAAGUACUUU-3′，该序列在5′端用Cy3红色荧光标记。各序列均由上海生物工程有限公司合成。
1.2.2 自组装携带mTOR小干扰RNA的核酸纳米材料(siRNA-NPs)将mTOR siRNA、mT-2A和mT-1A3的冻干干粉2 000 r/min 4℃离心5 min，分别加DEPC水稀释为0.2μg/μL，混匀；按mTOR siRNA、mT-2A和mT-1A3的摩尔比为3∶3∶1合成纳米材料。取mTOR siRNA溶液加入等体积的mT-2A溶液，放入90℃水浴中室温自然冷却至37℃，随后加入相应体积的mT-1A3溶液，充分混匀，37℃水浴30 min，室温下放置30 min，4℃放置20 min，得到携带mTOR siRNA的自组装核酸纳米材料。按上述步骤，不添加mTOR siRNA溶液则得到单纯的自组装纳米材料。
1.2.3 RPASMCs的培养RPASMCs从雄性SD大鼠肺动脉中分离得到，鉴定及培养的具体方法参照文献[8]，将RPASMCs培养于含青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL、10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中，置于条件为37℃、5%CO2的细胞培养箱中传代培养，选用第4～10代细胞用于实验。
1.2.4 实验分组本实验分4组:核酸纳米材料携带的mTOR siRNA组(siRNA-NPs组)、单纯纳米材料组(NPs组)、单独的siRNA组和空白对照组。
1.2.5 核酸纳米材料携带的mTOR siRNA转染RPASMCs转染前1 d将RPASMCs分别接种覆有盖玻片的24孔细胞培养板，每孔8×103个细胞。倒置显微镜下观察细胞生长情况，待培养板中细胞约60%～70%融合时开始转染。按照罗氏公司推荐的X-tremeGENE siRNA转染试剂操作说明制备转染混合液。以Opti-MEM稀释转染试剂及各实验组。siRNA-NPs组转染终浓度以siRNA计算为50 nmol/L，NPs组加入等量的单纯纳米载体，单独的siRNA组加入50 nmol/L的siRNA，空白对照组只加入等量培养液。置于37℃、5% CO2细胞培养箱中继续培养24 h。
1.2.6 激光共聚焦观察RPASMCs对核酸纳米材料携带的mTOR siRNACy3的摄取各实验组转染RPASMCs 24 h，用0.01 mol/L PBS洗涤细胞后，加入4%多聚甲醛500μL室温固定20 min，吸出固定液后用PBS洗涤3次，每次3 min，小心夹取出盖玻片，滴加DAPI 50μL染核，避光染色5 min，PBS洗涤5次，每次3 min，抗荧光淬灭封片剂封片，用激光共聚焦显微镜观察细胞摄取siRNACy3的情况。Image-Pro Plus 10.0软件对图像进行荧光半定量分析。
1.2.7 RT-PCR检测mTOR mRNA的表达采用TRNZOL提取细胞总RNA，使用核酸蛋白检测仪测定纯度并定量，光密度D(260)/D(280)比值均在1.9左右。依据RT-PCR试剂盒说明进行逆转录和扩增，引物由捷瑞生物工程有限公司合成。设计总反应体系为50μL，其中Premix Taq酶25μL，模板RNA 3μL，上下游引物各2μL，灭菌DEPC水18μL。mTOR上游引物: 5′-CGCAGGGAAGGTGATGAGGAAT-3′，下游引物: 5′-GCTAAGGAGCAGCCAGGGAGAT-3′，扩增产物片段长度为195 bp。β-actin上游引物: 5′-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3′，下游引物: 5′-AAAGAAAGGGTGTCGCA-3′，扩增产物片段长度为432 bp。扩增条件为：94℃5 min预变性；94℃变性40 s，54℃退火30 s，72℃延伸45 s，35个循环；72℃后延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，采用自动电泳凝胶成像分析仪进行图像扫描和分析。
1.2.8 Western blot检测p-mTOR、LC3B蛋白的表达取各实验组细胞，加细胞蛋白裂解液提取总蛋白，置于冰上裂解约20 min后，用细胞刮收集细胞于灭菌EP管中，4℃12 000 r/min离心10 min，取上清用核酸蛋白检测仪测蛋白浓度，调整蛋白浓度体积一致，加入5×Loadingbuffer，煮沸10 min变性。分离p-mTOR、LC3B蛋白分别采用8%、12%分离胶，5%浓缩胶进行SDS-PAGE凝胶电泳。p-mTOR转膜条件为300 mA湿转300 min，LC3B转膜条件为300 mA湿转60 min。转膜后将PVDF膜置于5%脱脂奶粉室温封闭2 h，然后置于5%脱脂奶粉稀释的p-mTOR及LC3B一抗(1∶500)中4℃孵育过夜，次日用TBST漂洗3次，每次10 min，放入5℅脱脂奶粉稀释的辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(1∶5 000)抗体中室温孵育1h，TBST漂洗5次，每次5 min，ECL化学发光法显色，以β-actin内参蛋白进行校正。用QuantiScan软件对条带进行光密度值分析，将目标条带与β-actin条带的光密度值之比作为其蛋白表达水平的参数。
1.2.9 激光共聚焦观察核酸纳米材料携带的mTOR siRNA对RPASMCs自噬的影响各实验组转染RPASMCs 24 h。按照Cyto-ID®Green自噬染色试剂盒操作说明制备染色混合培养液，转染结束前30 min，用PBS轻轻洗涤细胞后，加入Cyto-ID®Green自噬染色混合培养液，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中避光孵育30 min。然后取出培养板，用PBS轻轻洗涤细胞1次，用4%多聚甲醛500μL室温固定20 min，吸出固定液后用PBS洗涤3次，每次3 min，小心夹取出盖玻片，滴加DAPI 50μL染核，避光染色5 min，PBS洗涤5次，每次3 min，抗荧光淬灭封片剂封片，用激光共聚焦显微镜观察细胞自噬的情况。Image-Pro Plus 10.0软件对图像进行荧光半定量分析。
1.2.10 透射电镜观察携带mTOR siRNA的核酸纳米材料处理RPASMCs后的细胞超微结构及自噬小体将各组细胞转染48 h后，终止培养，加入0.25%的胰蛋白酶消化细胞，离心，用PBS洗涤细胞2次，之后加入2.5%戊二醛固定，4℃过夜，送检。
1.2.11 MTT法测定RPASMCs的生长抑制率将RPASMCs以每孔1×103个细胞接种于96孔培养板中，终体积200μL，每组设5个复孔，置于孵箱(37℃、5%CO2)中培养24 h后进行细胞转染。各组转染48 h后每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20μL，继续孵育4 h，然后仔细吸弃培养孔内上清液，每孔加入150μL DMSO，振荡溶解10 min，酶标仪490 nm波长测定各孔光密度[D(490)]值，以无细胞，但添加等量培养液并相同处理的空白对照孔调零。实验重复3次。细胞生长抑制率=[1－实验组D(490)值/空白对照组D(490)值]×100%。
1.2.12 3H-TdR掺入法检测RPASMCs的增殖将RPASMCs胰酶消化后用含10%FBS的DMEM培养基制备细胞悬液，以1×105个/孔的密度将细胞接种于48孔培养板中，置于孵箱(37℃、5%CO2)中培养，直到细胞长至80%的融合度时，换用1%FBS的DMEM培养基培养16 h后进行转染，各组转染48 h结束培养，在结束培养前8 h，每孔加入10μCi 3H-TdR，终止培养后，吸弃上层清液，用预冷的PBS洗涤2次，加入0.25%的胰蛋白酶消化细胞，收集细胞并采用液体闪烁计数器测定其脉冲数。实验重复3次。
1.3 统计学处理使用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析，各实验至少重复3次，计量资料以x+s表示，多组间均数比较行单因素方差分析，两组均数间比较用配对t检验。
2 结果 2.1 mTORsiRNA对PASMCs靶蛋白mTOR mRNA的抑制情况结果显示序列3 siRNA处理组中mTOR mRNA表达显著低于NC siRNA组和空白对照组(P < 0.05)，序列1 siRNA处理组和序列2 siRNA处理组与空白对照组和NC siRNA组比较mTOR mRNA表达有所下降，但差异无统计学意义。空白对照组和NC siRNA组mTOR mRNA的表达无统计学差异(图 1)。
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| 1:空白对照组；2：NCsiRNA组；3：序列1转染组；4：序列2转染组；5：序列3转染组；a:P < 0.05，与空白对照组比较；b:P < 0.05，与单独NC siRNA组比较 图 1 RT-PCR检测各组RPASMCs靶蛋白mTOR mRNA的表达 |
2.2 PASMCs对siRNA-NPs-Cy3的摄取情况
图中细胞质中呈颗粒状均匀分布的红色荧光代表被PASMCs摄入胞内的siRNA-NPs-Cy3，在转染12 h后，siRNA-NPs组的红色荧光显著强于单独的siRNA组，而空白对照组、NPs组均未见红色荧光颗粒，提示siRNA-NPs组中Cy3红色荧光标记的mTOR siRNA被核酸纳米材料高效的转运到RPASMCs内(图 2A)。荧光密度半定量分析结果与激光共聚焦图一致(图 2B)。
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| 1:空白对照组；2：NPs组；3：单独siRNA组；4：siRNA-NPs组A:各组细胞摄取mTOR siRNACy3的激光共聚焦图像；B:荧光密度半定量分析结果；a:P < 0.05，与空白对照组比较；b:P < 0.05，与单独siRNA组比较 图 2 激光共聚焦观察RPASMCs内siRNA-NPs的摄取情况 |
2.3 siRNA-NPs对RPASMCs的mTOR、p-mTOR、LC3B的表达影响
结果显示siRNA-NPs组中mTOR mRNA及p-mTOR蛋白的表达显著低于单独的siRNA组、NPs组和空白对照组(P < 0.05)，空白对照组和NPs组的两者表达无统计学差异(图 3A、B)。与此同时，siRNA-NPs组中LC3BⅡ/Ⅰ蛋白的表达显著高于单独的siRNA组、NPs组和空白对照组(P < 0.05)，空白对照组和NPs组LC3BⅡ/Ⅰ蛋白的表达无统计学差异(图 3C、D)。
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| A:mTOR mRNA的RT-PCR检测结果；B:RT-PCR半定量分析结果；C: p-mTOR、LC3B蛋白Western blot检测结果; D:Western blot半定量分析结果; M：DNA标准(100~600 bp)；1:空白对照组；2：NPs组；3：单独siRNA组；4：siRNA-NPs组；a:P < 0.05，与空白对照组比较；b:P < 0.05，与单独siRNA组比较 图 3 RT-PCR及Western blot检测各组RPASMCs的mTOR、p-mTOR、LC3B的表达 |
2.4 siRNA-NPs对RPASMCs自噬的影响
细胞质中呈颗粒状均匀分布的绿色荧光是标记自噬小体的蛋白，其荧光强弱代表了自噬水平的高低。siRNA-NPs组细胞质中可见大量标记自噬小体的绿色荧光，且荧光强度显著高于单独的siRNA组、空白对照组和NPs组(P < 0.05)，此外空白对照组、NPs组可见低水平的绿色荧光，提示RPASMCs在正常生理条件下自噬水平较低，而核酸纳米材料携带的mTOR siRNA则明显诱导细胞自噬(图 4A)。荧光密度半定量分析结果与激光共聚焦图一致(图 4B)。
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| 1:空白对照组；2：NPs组；3：单独siRNA组；4：siRNA-NPs组A:各组Cyto-ID® Green dye标记的细胞自噬的激光共聚焦图像；B:荧光密度半定量分析结果；a:P < 0.05，与空白对照组比较；b:P < 0.05，与单独siRNA组比较 图 4 激光共聚焦观察各组对RPASMCs自噬的影响 |
2.5 RPASMCs各组细胞超微结构及自噬小体的变化
电镜图显示，空白对照组的细胞质中仅见见少量双层膜环绕的空泡状结构，即典型的自噬体或自噬溶酶体结构, 而siRNA-NPs处理后RPASMCs中的自噬小体明显多于空白对照组(P < 0.05，图 5)。提示核酸纳米材料携带的mTOR siRNA能明显诱导细胞自噬小体形成(图 5)。
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| 下排图为线框区局部放大观察，白色箭头标示典型的自噬小体结构 图 5 透射电镜观察mTOR siRNA对RPASMCs超微结构及自噬小体的影响 |
2.6 siRNA-NPs对RPASMCs的活性及增殖的影响
MTT结果显示空白对照组的生长抑制率为(1.10±0.85) %，NPs组抑制率为(2.50±1.90) %，单独siRNA组抑制率为(19.60±1.98) %，siRNA-NPs组抑制率为(50.90±1.67) %。siRNA-NPs组和单独siRNA组细胞生长抑制率显著高于其他各组(P < 0.01)，siRNA-NPs组细胞生长抑制率又显著高于单独siRNA组(P < 0.01)，NPs组和空白对照组细胞生长抑制率无统计学差异。同时，3H-TdR结果显示与空白对照组比较，siRNA-NPs组和单独的siRNA组的3H-TdR摄入量明显下降，分别降至80%、52%(P < 0.01)，说明mTOR siRNA处理RPASMCs后明显抑制其增殖。且siRNA-NPs组摄入量又显著低于单独的siRNA组(P < 0.01)，NPs组和空白对照组摄入量无统计学差异(图 6)。
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| 1:空白对照组；2：NPs组；3：单独siRNA组；4：siRNA-NPs组；a: P < 0.01，与空白对照组比较；b: P < 0.01，与单独siRNA组比较 图 6 3H-TdR检测各组对RPASMCs生长抑制的情况 |
3 讨论
小干扰RNA可高效特异地抑制靶基因，实现靶基因的表达下调，在疾病的基因治疗中显示出巨大的应用前景[9]。其发挥作用的关键在于小干扰RNA本身的沉默效应以及能否高效转染细胞，但RNA分子对核酸酶高度不稳定，半衰期短；聚阴离子性质致其不易被摄取；同时其电荷密度导致其充分水化，不易与一些蛋白相互作用而被迅速清除，这些性质导致小干扰RNA稳定性差，不易被细胞摄取[10]。因此，我们需要一个稳定、高效的基因装载体系来解决这些问题。而随着纳米技术的发展，通过DNA编程自组装纳米结构作为运载体来实现基因的高效运输。DNA最大的优势在于相对于RNA更稳定，与其他的药物传递材料相比，核酸自组装纳米制剂一般具有以下优点[11-12]：生物相容性高；合成简单，操作性强；能够缓控释放；毒性低；易被标记等。
本研究运用一种新型的自组装核酸纳米材料携带mTOR小干扰RNA转染RPASMCs，显著下调mTOR mRNA及蛋白的表达，增强细胞自噬水平，进而抑制RPASMCs的增殖。表明自组装核酸纳米材料携带的mTOR小干扰RNA，两者形成稳定的运载体系，小干扰RNA在核酸纳米载体的保护下，不易聚集且不易被血浆中的各种酶降解；且核酸纳米结构分子量小，易被细胞摄入，能够高效的转染进入RPASMCs，并在其胞浆内稳定释放发挥生物学效应。相对于单独小干扰RNA，由核酸纳米载体运载的小干扰RNA能够更多地进入细胞内，有效的下调靶蛋白mTOR表达，诱导细胞自噬，引起自噬性细胞死亡，抑制RPASMCs的增殖。本实验证实了自噬调控药物作为治疗PAH的重要作用，并且提供了一个安全、高效、稳定的载药体系，为肺高压等心肺疾病的治疗提供实验基础。
哺乳动物雷帕霉素靶蛋mTOR信号通路是调节细胞自噬、增殖、凋亡的中心环节[13]，研究发现在低氧肺动脉高压小鼠模型肺组织及低氧下人PASMCs中mTORC1较正常显著增高[14]；mTORC2通过AMPK调控肺血管平滑肌细胞的增殖和存活，下调mTORC2能诱导平滑肌细胞凋亡，抑制其增殖[15]。说明mTOR治疗PAH的重要靶点，抑制其表达或活性，能明显抑制平滑肌细胞增殖，这些实验均证实我们结果的有效性和可靠性。
综上所述，本课题研究的核酸自组装纳米材料具有天然、非免疫原性、低毒等优越性，其携带的mTOR小干扰RNA能够被RPASMCs高效摄取，显著下调靶蛋白mTOR的表达，从而诱导RPASMCs的自噬，抑制细胞的增殖。这种新型材料结合靶蛋白mTOR小干扰RNA载药系统有望成为治疗肺动脉高压肺血管重构的新靶点。
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