肠缺血再灌注(ischemia reperfusion,I/R)是急性战创伤以及各种大型手术如肠绞窄性疝等多种急性病理刺激下的一种潜在的病理生理过程，能够引起肠黏膜形态学的改变，造成肠黏膜屏障(intestinal mucosal barrier)功能受损，导致肠道细菌位移和肠源性感染，进一步加重原发疾病，诱发全身炎症反应综合征和多脏器功能衰竭[1]。而完整的肠黏膜上皮细胞(intestinal epthelial cell,IEC)以及上皮细胞间的紧密连接(tight junction,Tj)是IEB的结构基础，参与维系IEB功能[2]。作为配体依赖激活的核转录因子，芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AhR)可通过与其配体如吲哚并[3,2-B]咔唑-6-甲醛[6-formylindolo (3,2-b) carbazole,FICZ]等结合并激活，诱导包括外源性代谢酶(xenobiotic-metabolizing enzyme,XME)在内的一系列下游目的基因表达[3]。研究发现，作为信号通路的关键调节分子，AhR可诱导多种细胞因子表达，参与机体多种重要生理学过程，如细胞的分化与凋亡、炎症反应等[4]。本实验模拟小鼠肠急性I/R，通过FICZ预处理活化AhR，观察其对肠黏膜形态功能以及紧密连接蛋白ZO-1表达与分布的影响，评估活化的AhR对小鼠肠急性I/R的防治作用。
1 材料与方法 1.1 试剂与器材蛋白酶抑制剂(PMSF)、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购自美国Millipore公司，FICZ购自ENZO公司，AhR一抗、ZO-1一抗购自Abcam公司，CYP1A1一抗购自Beyotime Biotechnology公司，蛋白测定试剂盒、RIPA裂解液、化学发光(ECL)检测试剂盒、辣根过氧化物酶(HPR)、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶试剂盒购自Boster公司，电泳仪与湿转仪购自Bio-Rad公司，凝胶成像分析系统购自Kodak公司，改良的Ussing灌流室(Using chambers)购自Physiologic Instruments公司，RT-PCR试剂盒购自TaKaRa公司。
1.2 实验动物及分组雄性C57BL/6小鼠18只，6～8周龄，体质量20～ 23 g，购自第三军医大学新桥医院实验动物中心。分 为3组(n=6)：假手术组、I/R组和FICZ干预组(I/R+ FICZ组)。其中假手术组、I/R组术后腹腔注射200 mL生理盐水，而I/R+FICZ组给予腹腔注射等量的FICZ(剂量为1 mg/只)溶液[5]。术前12 h，自由饮水。以0.2 mL 0.1%的戊巴比妥钠腹腔注射，麻醉后经腹正中线切开，探查并游离肠系膜上动脉(superior mesenteric artery,SMA)，夹闭30min后恢复血运。术毕缝合皮肤。术后6 h处死全部小鼠，分离提取小肠组织。
1.3 实验方法 1.3.1 观察小肠形态学变化取回盲部10 cm以上的小肠组织2 cm，多聚甲醛固定后制备石蜡切片。按步骤对石蜡切片行苏木精-伊红(HE)染色。光学显微镜(×400)下观察肠黏膜形态学变化。
1.3.2 小肠参照Chiu肠黏膜损伤评分根据小肠形态学改变，进行组织学评分，标准依据Chiu肠黏膜损伤评分[6]。
1.3.3 肠黏膜跨上皮电阻检测取小肠组织长约3 cm，沿系膜方向剖开肠管，生理盐水洗净，显微镜下剥离肠黏膜，将其安装在调试好的尤斯灌流仪上，测量电阻值[7]。重复4次。
1.3.4 Western blot检测AhR、CYP1A1、ZO-1的蛋白表达变化提取3组样品蛋白质，利用蛋白测定试剂盒检测蛋白浓度。蛋白上样，凝胶电泳恒压60 V，湿转恒流240 mA，转至甲醛浸泡过的PVDF膜。 5%TBST脱脂奶粉室温封闭2 h，适当比例稀释一抗于4 ℃ 过夜，依次进行洗膜15 min、二抗室温孵育2 h、洗膜15 min后，加入化学发光试剂曝光，利用分子成像软件分析数据。重复3次。
1.3.5 实时荧光定量PCR分析CYP1A1 mRNA水平变化用TRIzol(Invitrogen)依照说明说提取肠上皮细胞总mRNA，用TaKaRa试剂盒将mRNA逆转录生成cDNA。按照SYBR Green试剂盒说明书进行扩增。Rotor-GeneQ分析软件处理数据，重复3次。见表 1。
| 引物名称 | 引物序列 | 产物长度(bp) |
| CYP1A1 | 上游5′-CCAAGAGCTGCTCAGCATAG-3′ | 188 |
| 下游5′-GGCATCCAGGGAAGAGTTAG-3′ | ||
| β-actin | 上游 5′-CTTCTTTGCAGCTCCTTCGTT-3′ | 206 |
| 下游5′-AGGAGTCCTTCTGACCCATTC-3′ |
将小肠组织行冰冻切片，4%多聚甲醛固定，PBS溶液清洗3次，每次10 min，5% BSA溶液封闭2 h，按比例稀释一抗于4 ℃过夜。依次进行PBS清洗10 min、Cy3标记的荧光二抗室温孵育2 h、PBS清洗10 min、DAPI染色15 min，PBS清洗10 min。封片后于激光共聚焦显微镜观察荧光变化。结果重复3次。
1.4 统计学分析计量资料以x±s表示，采用SPSS 13.0统计软件，行单因素方差分析。
2 结果 2.1 小肠组织形态学改变缺血再灌注6 h后处死小鼠，观察发现，与假手术组相比，I/R组小肠明显充血，水肿、变粗，而加入FICZ处理的小肠黏膜损伤得到明显改善。HE染色显示：假手术组绒毛整齐有序，结构完整，清晰可辨；I/R组绒毛排列紊乱，绒毛表面部分游离，肠上皮细胞大量坏死，结构不连续，破坏明显；I/R+FICZ组肠上皮细胞少量坏死，绒毛部分节段结构不连续，未见明显水肿，较I/R组显著改善，提示FICZ可明显改善小鼠肠急性I/R引起的肠黏膜形态学损伤(图 1)。根据Chiu肠黏膜损伤评分比较发现，I/R组评分明显升高(3.333± 0.516)，而加入FICZ处理后评分降低(2.167±0.408)。
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| A：假手术组；B：I/R组；C：I/R+FICZ组 图 1 各组小鼠小肠组织病理变化 (HE ×200) |
假手术组、I/R组和I/R+FICZ组的TER分别为 (147.60±15.94)、(87.84±10.87)、(108.60±8.80)cm2。 相比I/R组，FICZ处理组明显缓解了缺血再灌注引起的通透性增加(P＜0.05)。
2.3 小肠黏膜AhR表达与活性免疫荧光结果显示，与假手术组比较，I/R组小肠绒毛中AhR表达略有下降，I/R+FICZ组表达有所增加(图 2)；Western blot和RT-PCR结果显示，I/R组CYP1A1蛋白(0.565±0.081)和mRNA(0.054± 0.066)水平均有所降低，提示AhR活性下降；加入AhR内源性激动剂FICZ后CYP1A1蛋白(6.702±1.978)与mRNA(17.210±4.609)水平明显升高，说明AhR的活性得到显著提高(图 3)。与假手术组比较，I/R组小肠绒毛中AhR表达略有下降，FICZ处理后表达有所增加。
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| 图 2 免疫荧光检测各组小鼠小肠黏膜AhR表达情况 (×400) |
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| 1：假手术组；2：I/R组；3：I/R+FICZ组 图 3 Western blot检测各组小鼠小肠黏膜CYP1A1 蛋白表达 |
荧光免疫检测结果显示：紧密连接蛋白ZO-1沿着肠绒毛表面线性分布，荧光呈红色，胞浆、细胞核内未见表达。Sham组荧光连续，均匀分布；I/R组荧光明显弱化，表达分散，连续性受到破坏；而I/R+FICZ组有明显改善(图 4)。Western blot结果显示，与假手术组相比，I/R组ZO-1蛋白表达(0.338±0.089)下降，而FICZ干预后蛋白水平(0.567±0.066)得到恢复(图 5)。
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| 图 4 免疫荧光检测各组小鼠小肠黏膜ZO-1表达和分布情况 (×1200) |
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| 1：假手术组；2：I/R组；3：I/R+FICZ组 图 5 Western blot检测各组小鼠小肠黏膜ZO-1蛋白表达 |
正常肠黏膜屏障是由机械屏障、免疫屏障、化学屏障与生物屏障共同构成的复杂屏障系,参与抵御肠道细菌入侵，调控肠道内物质运输，维持机体内环境稳态。其中，机械屏障由完整紧密排列的肠上皮细胞和细胞间的紧密连接共同构成。然而，各种急慢性病理条件下，肠黏膜结构遭到破坏，屏障功能受损，引起肠道细菌转位，继发肠源性感染，诱发全身炎症反应综合征，严重时可导致多器官功能衰竭，危及患者生命[1, 8, 9]。
AhR是多环芳香烃类物质的重要代谢产物，在人体内分布广泛，表达水平非常低。近来研究发现，AhR是一种依赖配体激活的转录因子。在未与配体结合时，AhR与热休克蛋白90(90 kDa heat shock protein,HSP90)、磷蛋白 P23等多种蛋白结合均可形成受体复合物。一旦与其配体结合，会以配体依赖的方式进入细胞核，与AhR核转位子(AhR nuclear translocator,ARNT)形成异源二聚体，特异性结合于AhR反应元件(AhR-responsive elements,AhREs)，诱导包括外源性代谢酶 (Xenobiotic-Metabolizing Enzyme,XME) 在内的一系列下游目的基因表达[3, 4]。FICZ是AhR最常见的内源性配体，在实验研究中作为强效激动剂被广泛使用[10]。有研究表明，在各种病理模型中，AhR参与肠道免疫，调控炎症反应，保护肠黏膜屏障。Furumatsu等[11]研究发现，在IBD患者肠黏膜中，AhR表达水平与对照组相比明显下降；同时给予IBD动物AhR激动剂可明显缓解肠道炎症症状，IFN-γ、TNF-α等炎性细胞因子表达明显下降。然而 AhR活化在I/R模型中对肠黏膜屏障的影响目前尚不十分清楚。
本实验发现，FICZ活化AhR可以通过上调紧密连接蛋白ZO-1表达和维持其上皮细胞间分布来减轻小鼠在中对肠屏障的损伤作用。肠急性I/R机制是各种原因引起的肠急性缺血对机体造成明显损害，而再灌注后损伤在原有的基础上加重，导致再灌注损伤[12]。实验中，我们首先通过HE染色、组织学评分以及通透性检测明确了肠急性I/R的损伤，在此基础上加入FICZ后，肠道结构与功能损伤得到明显改善。文献[13]报道，细胞色素P450 1A1(Cytochrome P450 1A1,CYP1A1)属重要的I相解毒酶，是AhR调控的直接靶基因，通常通过检测CYP1A1的蛋白与mRNA表达来反映AhR活性的高低。因此，实验运用Western blot和RT-PCR检测CYP1A1的表达，用以评估AhR的活性。结果显示，肠急性I/R条件下，CYP1A1表达下降，说明AhR活性降低；而在此基础上给予FICZ处理后CYP1A1表达升高，提示AhR活性增加。这表明激动剂FICZ在肠急性I/R下，可明显上调AhR的活性，确实起到激动作用。另文献证实，作为紧密连接蛋白主要成员，ZO-1参与构成紧密连接，直接调节肠黏膜细胞间通透性，影响肠道菌群位移及物质运输[14]。我们发现，I/R损伤条件下，ZO-1表达下降，荧光显示其连续性断裂；给予FICZ预处理后，ZO-1表达得以恢复，荧光下连续性得到维持。表明FICZ活化AhR可能参与调控紧密连接蛋白表达与分布，改善肠黏膜屏障通透性，从而起到保护作用。文献[15, 16]报道，在缺氧caco-2细胞中，MLCK-pMLC信号通路受到激活，降低了ZO-1的表达，并引起ZO-1的重新分布，继而损伤细胞屏障功能。据此，我们考虑MLCK-pMLC信号通路的抑制是否就是肠急性I/R条件下AhR活化维持ZO-1表达与分布的潜在作用机制，但尚需进一步验证。综上所述，小鼠肠急性 I/R 模型中AhR的活化能有效的缓解小鼠IEB功能损伤，而紧密连接蛋白ZO-1表达和分布的维系是保护机制的重要作用点。同时本实验结论为AhR激动剂FICZ在未来防治肠急性I/R损伤提供较可靠的理论依据。
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