2. 450002 郑州，河南省中医院：护理部
2. Department of Nursing, Henan Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou, Henan Province, 450002, China
椎间盘退变疾病与椎间盘结构崩塌和功能失调有关。近年研究报道全球有超过6亿人患有椎间盘退变疾病, 严重影响患者的工作和生活[1]，但其发病机制尚不完全明确。一般认为椎间盘退变疾病起自椎间盘内层髓核中的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的合成与降解失衡，主要表现为ECM含量降低、活细胞减少和促炎因子分泌增多[2-3]。目前，活性物质注射、基因治疗和细胞移植是椎间盘退变疾病治疗最有前景的三个领域[4-5]。研究报道骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem, BMSCs)能被诱导向中胚层细胞分化，发挥抗凋亡和抗炎的作用[6]，添加外源性细胞因子或基因能诱导其分化为类髓核细胞(nucleus pulposus cells, NPCs)，并发挥髓核细胞的生物功能[7]。人血管内皮素生长因子(humanvascular endothelial growth factor，hVEGF)和转化生长因子(transforming growth factor-β1, TGF-β1)具有协同作用，可增加退行性椎间盘中纤维环细胞Ⅰ型胶原的表达。在模拟微重力环境下，TGF-β1能提高BMSCs合成蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的能力，诱导BMSCs向NPCs分化[8]。细胞内的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)能通过转录因子的调节控制BMSCs的分化[9]。但目前关于VEGF和TGF-β1的协同作用对BMSCs分化的影响尚少见报道。本研究以兔BMSCs为细胞载体，转染腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)-VEGF和AAV-TGF-β1腺病毒载体，探讨VEGF和TGF-β1的协同作用对BMSCs增殖、分化的影响及其可能的机制，以期为椎间盘退变性疾病的细胞移植治疗提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 实验动物及材料3周龄健康清洁级新西兰大白兔，雄性，体质量1.2～1.8 kg，购于浙江大学医学实验动物中心。胎牛血清购于杭州四季青公司，DMEM/F12培养基购于HyClone公司，腺病毒载体AAV-pSNAV购自上海生工公司，pcDNA3(+)-VEGF和pcDNA3(+)-TGF-β1原核表达质粒由本实验室保存，CCK8试剂盒购于Sigma公司，鼠抗人VEGF、TGF-β1、SOX-9、CollagenⅡ、Aggrecan、P38、MAPKAPK2、HSP27和β-actin一抗及HRP标记的羊抗鼠二抗购于北京博奥生物技术有限公司，SB203580购于广州威佳科技有限公司，荧光倒置显微镜购于英国Andor公司，CO2培养箱购于美国Thermo公司，凝胶成像仪购于美国Bio-rad公司。
1.2 BMSCs的分离培养大白兔麻醉后于双侧股骨转子部位脱毛，16号骨髓穿刺针在股骨转子处抽取5 mL左右的骨髓液，1 000 r/min离心5 min后收集沉淀，PBS溶液清洗2次，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基稀释细胞至1×106/mL，并立即接入细胞培养瓶，于37℃，5% CO2饱和湿度的条件下培养。48 h后半量换液，待细胞长至90%左右按1∶3的比例传代，以后每3天进行1次全量换液，倒置显微镜观察各组细胞形态，第3代细胞用于对照和转染实验。
1.3 AAV-VEGF和AAV-TGF-β1腺病毒载体的构建和转染及分组处理AAV-VEGF腺病毒载体的构建：以包含VEGF全序列的pcDNA3(+)-VEGF质粒为模板扩增，上游引物:5′-ATCGGAATTCATGAACTTTCGCTG-3′，下游引物:5′-ATCTGTCGACTCACCGCCTCGGCTT-3′，PCR扩增得到带有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点的DNA片段，用EcoRⅠ和SalⅠ同步双酶切PCR产物和腺病毒载体AAV-pSNAV，连T载转化感受态细胞DH5α，单克隆测序得到的含VEGF基因的腺病毒表达载体AAV-VEGF。AAV-TGF-β1腺病毒载体的构建按照与AAV-VEGF相同的方法进行。取第3代生长良好的BMSCs，5×104/孔铺96孔板，镜检细胞铺满70%左右时，将细胞分为4组：对照组：单独转染腺病毒空载体；AAV-VEGF组：单独转染AAV-VEGF腺病毒表达载体；AAV-TGF-β1组：单独转染AAV-TGF-β1腺病毒表达载体；VEGF+TGF-β1组：同时转染AAV-VEGF和AAV-TGF-β1腺病毒表达载体。转染腺病毒载体后的各组细胞，培养72 h后，倒置显微镜观察细胞形态。
1.4 Western blot检测蛋白表达收集各组BMSCs，加入0.25%胰蛋白酶消化后，用PBS缓冲液清洗细胞3次。加入65μL RIPA细胞蛋白裂解液，SDS-PAGE电泳分离蛋白。电泳结束后转膜，再用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入稀释1 000倍的鼠抗人VEGF、TGF-β1、SOX-9、CollagenⅡ、Aggrecan、SOX-9、CollagenⅡ、Aggrecan、P38、MAPKAPK2、HSP27和β-actin一抗，4℃轻摇过夜，加入稀释5 000倍的HRP标记的羊抗鼠二抗，室温孵育1 h。X线片曝光分析，结果用Image-Pro Plus处理，以目的蛋白与内参β-actin的灰度值比值表示蛋白的相对表达量。
1.5 流式细胞术检测细胞凋亡取培养48 h后的各组BMSCs，用4℃预冷的PBS洗涤2次，加入0.25%胰酶消化，收集后迅速加入0.5 mL 1×Annexin V结合缓冲液，低速离心后弃上清，另加结合缓冲液10μL和PI 5μL并混匀，于37℃避光孵育30 min。在流式细胞仪上设置激发波长488 nm和发射波长530 nm，检测细胞凋亡率。
1.6 CCK8检测细胞增殖转染腺病毒48 h后，收集细胞，1×104/孔铺96孔板，置于细胞培养箱培养0、24、48、72、96、120 h后，分别加入10μL CCK8试剂，37℃继续孵育2 h，用酶标仪检测450 nm处光密度值[D(450)]，每组设3个复孔，重复3次测量，计算细胞增殖倍数，做增殖曲线。
1.7 SB203580处理BMSCs用P38MAPK的特异阻滞剂SB203580处理第3代生长良好的BMSCs细胞，分为4组：对照组：单独转染腺病毒空载体；VEGF+TGF-β1组：同时转染AAV-VEGF和AAV-TGF-β1质粒；SB203580组：抑制剂SB203580用DMSO溶解后，加入培养基稀释至10μmol/L预干预细胞1 h后，在DMEM/F12培养基中培养；VEGF+TGF-β1+SB组：用10μmol/LSB203580干预细胞1 h后，转染AAV-VEGF和AAV-TGF-β1腺病毒载体到抑制剂干预后的细胞中。每组设置3个复孔，每3天换1次液，收集各组细胞按照前面的方法研究各组细胞的增殖，凋亡及蛋白表达情况。
1.8 统计学分析采用SPSS13.0统计软件，计量资料用x±s表示，行单因素方差分析，P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 腺病毒载体AAV-VEGF和AAV-TGF-β1的转染情况第3代BMSCs细胞被腺病毒载体AAV-VEGF和AAV-TGF-β1分别单独转染和共转染后，继续培养48 h，分别提取总蛋白。Western blot分析显示，与对照组相比，VEGF在AAV-VEGF组和VEGF+TGF-β1组的表达显著升高(P < 0.05)，在AAV-TGF-β1组中无显著变化，TGF-β1的表达在AAV-TGF-β1组和VEGF+TGF-β1组中显著升高(P < 0.05)，在AAV-VEGF组中无明显变化(图 1)。
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| 1：对照组；2：AAV-VEGF组；3：AAV-TGF-β1组；4：VEGF+TGF-β1组 图 1 Western blot检测BMSCs中VEGF和TGF-β1的蛋白表达水平比较 |
2.2 AAV-VEGF和AAV-TGF-β1诱导分化后对BMSCs细胞形态的影响
在倒置显微镜下观察各组细胞形态，未转染腺病毒表达载体的兔骨髓间充质干细胞多为长梭形，少数为多角形。单独转染AAV-VEGF和AAV-TGF-β1的BMSCs细胞密度增加，且少部分细胞由长梭形回缩成类圆形、圆形及不规则形态，在细胞内的中央位置可观察到清晰的细胞核。这种现象在AAV-VEGF和AAV-TGF-β1共转染的BMSCs细胞中更加明显，细胞密集生长并能观察到大量的圆形或类圆形细胞聚集。从对照组到单独转染、共转染VEGF+TGF-β1组，细胞质颜色逐渐加深，分化细胞显著增加(图 2)。
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| A:对照组；B：AAV-VEGF组；C：AAV-TGF-β1组；D：VEGF+TGF-β1组 图 2 倒置显微镜观察各组BMSCs细胞形态 |
2.3 AAV-VEGF和AAV-TGF-β1对BMSCs细胞凋亡的影响
流式细胞术检测BMSCs细胞凋亡情况，与对照组比较，单独转染AAV-VEGF和AAV-TGF-β1的BMSCs细胞凋亡减少(P < 0.05)，VEGF+TGF-β1组的BMSCs细胞凋亡较单独转染组显著降低(P < 0.01, 图 3)。
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| A:对照组；B：AAV-VEGF组；C：AAV-TGF-β1组；4：VEGF+TGF-β1组 图 3 流式细胞术检测AAV-VEGF和AAV-TGF-β1对BMSCs细胞凋亡的影响 |
2.4 AAV-VEGF和AAV-TGF-β1对BMSCs细胞增殖的影响
CCK8检测细胞增殖情况显示，与对照组相比，AAV-VEGF组、AAV-TGF-β1组和VEGF+TGF-β1组细胞增殖能力均显著升高(P < 0.05)；共转染AAV-VEGF和AAV-TGF-β1质粒的细胞比单独转染AAV-VEGF和AAV-TGF-β1的细胞增殖能力明显提高(P < 0.05，图 4)。
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| a: P < 0.05，与其余3组比较 图 4 AAV-VEGF和AAV-TGF-β1对BMSCs细胞增殖的影响 |
2.5 AAV-VEGF和AAV-TGF-β1对BMSCs细胞成骨分化的影响
Western blot结果表明，与对照组相比，SOX-9、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达在AAV-VEGF组和AAV-TGF-β1组有所增加，VEGF+TGF-β1组表达显著升高(P < 0.01)，VEGF+TGF-β1组表达明显高于AAV-VEGF组和AAV-TGF-β1组(P < 0.05，图 5)。
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| 1：对照组；2：AAV-VEGF组；3：AAV-TGF-β1组；4：VEGF+TGF-β1组 图 5 Western blot检测AAV-VEGF和AAV-TGF-β1对BMSCs细胞成骨分化的影响 |
2.6 AAV-VEGF和AAV-TGF-β1对BMSCs细胞P38 MAPK信号通路的调节
Western blot检测结果表明，与对照组相比，P38、MAPKAPK2和HSP27蛋白在AAV-VEGF组和AAV-TGF-β1组表达有所增加，VEGF+TGF-β1组表达明显提高(P < 0.01)，且明显高于AAV-VEGF组和AAV-TGF-β1组(P < 0.05，图 6)。
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| 1：对照组；2：AAV-VEGF组；3：AAV-TGF-β1组；4：VEGF+TGF-β1组 图 6 Western blot检测AAV-VEGF和AAV-TGF-β1对BMSCs细胞P38 MAPK信号通路的调节 |
2.7 SB203580干扰AAV-VEGF和AAV-TGF-β1对BMSCs细胞凋亡的影响
流式细胞术检测显示，与VEGF+TGF-β1+SB组相比，VEGF+TGF-β1组细胞凋亡明显降低(P < 0.05)，而SB203580组细胞凋亡显著增加(P < 0.05)(图 7)。
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| A:对照组；B：VEGF+TGF-β1组；C：SB203580组；D：VEGF+ TGF-β1+SB组 图 7 流式细胞术检测SB203580干扰AAV-VEGF和AAV-TGF-β1转染对BMSCs细胞的影响 |
2.8 SB203580干扰AAV-VEGF和AAV-TGF-β1对BMSCs细胞增殖的影响
CCK8检测BMSCs细胞的增殖情况发现，与VEGF+TGF-β1+SB组相比，VEGF+TGF-β1组细胞增殖增加(P < 0.05)，而SB203580组细胞增殖降低(P < 0.05)(图 8)。
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| a: P < 0.05，与VEGF+ TGF-β1+SB组比较 图 8 SB203580干扰AAV-VEGF和AAV-TGF-β1转染对BMSCs细胞增殖的影响 |
2.9 SB203580干扰AAV-VEGF和AAV-TGF-β1对软骨形成标志物及通路蛋白表达的影响
Western blot检测软骨形成标志物SOX-9、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达，以及PP38、PMAPKAPK2和PHSP27的表达显示，与VEGF+TGF-β1+SB组相比，VEGF+TGF-β1组蛋白表达明显提高(P < 0.05)，而SB203580组蛋白表达显著降低(P < 0.05, 图 9)。
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| 1：对照组；2：VEGF+ TGF-β1组；3：SB203580组；4：VEGF+ TGF-β1+SB组 图 9 Western blot检测SB203580干扰AAV-VEGF和AAV-TGF-β1对软骨形成标志物及通路蛋白表达的影响 |
3 讨论
椎间盘退变是一种伴随着下腰痛的慢性且复杂的病理过程[4]。据报道，椎间盘退变从髓核开始并以髓核细胞减少为典型特征[10]，因此恢复椎间盘细胞的数量和功能成为治疗椎间盘退变疾病的关键[11]。BMSCs具有多向分化的潜能，能增殖分化为类髓核细胞，并具有合成ECM的功能，可促进椎间盘的修复和再生[12]，因此促进BMSCs向髓核细胞分化已成为治疗脊柱退变疾病的研究热点。
TGF-β1是椎间盘维持和退化过程中的关键因子，该蛋白由一系列多肽组成，被认为是与胶原代谢关系最密切的蛋白之一[13]。TGF-β1不仅调节胶原蛋白和蛋白聚糖的合成，也影响椎间盘细胞的新陈代谢[14]。VEGF被报道能引起椎间盘组织中新血管的生成，在椎间盘突出的重吸收中发挥作用[15]。本实验结果表明，AAV-VEGF和AAV-TGF-β1能促进BMSCs增殖且促进其分化为类髓核细胞，并且，在AAV-VEGF和AAV-TGF-β1的共转染组中效果更显著，说明VEGF与TGF-β1可能参与椎间盘退变的修复和再生。
Ⅱ型胶原和蛋白聚糖是ECM的主要组成部分，也是椎间盘退变的典型标志物[16]。Ⅱ型胶原主要位于纤维环和髓核细胞内层，维持含水量和承受压力[17]。蛋白聚糖能保持椎间盘的渗透性、高度和抗压缩能力[18]。研究表明，SOX-9在椎间盘再生中起着关键作用。在软骨形成中，SOX-9是Ⅱ型胶原的增强子。腺病毒介导的SOX-9转染椎间盘细胞后，细胞增殖增加，Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的合成也随之上调[19]。且添加生长因子，如LMP1 [20]、IGF-1[21]、GDF-5 [22]等能刺激SOX-9、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的过表达从而修复椎间盘。本研究中，转染腺病毒包装的VEGF和TGF-β1能上调SOX-9、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达，与前述研究结果相同，且VEGF和TGF-β1的协同作用能显著提高3种标志蛋白的表达，提示该协同作用可能在退变的椎间盘修复和再生中发挥重要作用。
据报道，P38MAPK信号通路通过改变椎间盘中合成代谢基因和抗分解代谢基因的表达，影响蛋白多糖的降解，在调节椎间盘中基质的合成与降解起着关键作用[23-24]。P38MAPK信号通路的激活依赖于TGF-β诱导的蛋白聚糖的表达[25]。本实验发现VEGF和TGF-β1的协同作用能显著上调P38MAPK信号通路中P38、MAPKAPK2和HSP27的表达，提示VEGF和TGF-β1的协同作用可能通过调节P38MAPK信号通路从而对退变的椎间盘进行修复和再生。进一步用P38MAPK的特异阻滞剂SB203580处理BMSCs，能反转VEGF和TGF-β1的协同作用对BMSCs增殖、分化及相关蛋白表达的调节，反向证实了VEGF和TGF-β1是通过增加P38MAPK通路蛋白的表达影响BMSCs的增殖和分化。
综上所述，本研究证实VEGF和TGF-β1可通过调节P38MAPK信号通路诱导BMSCs的增殖并向髓核细胞分化，且VEGF和TGF-β1的协同作用可以更显著增强BMSCs增殖和分化的能力，促进胶原蛋白和蛋白聚糖等ECM的表达，从而促进退行性脊柱的修复和再生。本研究仅在细胞水平探讨了VEGF和TGF-β1的协同作用促进BMSCs向髓核细胞分化的作用，仍需在体内试验中进一步验证VEGF和TGF-β1的协同效果。下一步研究计划建立椎间盘退变的动物模型，先预实验探索最适的包装载体和转染方法，以减少对动物的毒性伤害和副作用，再检测各项指标，分析共转染VEGF和TGF-β1对椎间盘退变动物模型的修复效果。
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