终末期肝病最有效的治疗方法是肝脏移植,但由于肝脏供体不足制约了其发展[1]。近年来随着对替代治疗研究的不断深入,全器官灌注法制备去细胞化肝脏生物支架(decalularized liver bioscaffold,DLB)因具有特殊的生物有效性从而成为新的研究热点[2]。制备DLB即在一定物理条件下,通过脱细胞化处理去除肝细胞成分,并保留具有生物学效应的细胞外基质成分和超微脉管结构。随后以DLB为载体,将种子细胞植入支架内,从结构和功能上模拟正常肝脏的功能,最终起到替代正常肝脏的作用。虽然目前再细胞化肝脏表达一定的肝脏功能,但与正常肝脏功能相比较仍有较大的差距,尚未达到对患肝替代与治疗的作用[3]。笔者认为可从通过完善肝脏本身的复合性出发,探索进一步提升再细胞化肝脏功能的方法。肝脏受自主神经调节,实验研究发现肝脏内交感神经对肝脏损伤及修复具有重要作用[4]。异丙肾上腺素作为重要的神经递质,其对再细胞化肝脏的作用尚不清楚。本实验想通过观察神经递质对肝脏生物支架再细胞化的作用,探讨提升再细胞化肝脏功能的可能性,为完善再细胞化肝脏的制备提供新的科学依据。
1 材料与方法 1.1 实验动物和试剂8~10周C57小鼠40只,雌雄不限,SPF级,体质量18~22 g,购置于第三军医大学实验动物中心。L02细胞株(人永生化正常肝细胞株)购置于上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。曲拉通X-100(TirtonX-100)(Life Technology公司,美国),十二烷基硫酸钠(SDS)(Solarbio公司,中国),DMEM高糖培养基(Gibico公司,加拿大),胎牛血清(FBS)(BI公司,澳大利亚),异丙肾上腺素(ISO)/普萘诺尔(Propranolol)(Sigma公司,美国),人微量白蛋白ELISA试剂盒/人尿素ELISA试剂盒(Solarbio公司,中国),酶联免疫测定仪(Bio-Rad公司,美国),免疫荧光显微镜(Zeiss公司,德国)。
1.2 去细胞化肝脏生物支架的制备C57小鼠使用1%苯巴比妥钠(100 mL/kg)腹腔注射麻醉,取腹部正中十字切口,暴露出肝上、下下腔静脉和门脉系统区域,结扎肝上下腔静脉、肝动脉、胆总管。肝门静脉置静脉留置针(22G)并双重套扎,连接50 mL注射器置于微量泵,以5 mL/min速度灌注0.9%生理盐水,同时剪破下腔静脉,待肝脏由暗红色转为黄色后终止灌流。完整取下肝脏,浸泡于含有100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)中,并将静脉留置针连接于生物反应器,以备后续灌注。1%SDS灌注肝脏1 h,后续使用1%TritonX-100灌洗肝脏1 h以去除肝脏实质细胞成分。此后用无菌PBS灌洗肝脏2 h洗去残留的去垢剂。灌注过程的流速均匀保持在5 mL/min,并严格注意无菌操作。
1.3 HE和Massion染色将新鲜肝脏组织以及去细胞化肝脏生物支架经4%多聚甲醛固定,脱水,石蜡包埋,于石蜡切片机上切片。常规脱蜡后行HE染色,观察支架内细胞是否完全洗脱及支架形态。依据试剂盒说明书进行Massion染色,观察支架内胶原纤维和弹力纤维保留情况。
1.4 光密度测定法检测DNA浓度肝脏及支架组织使用DNA抽提试剂盒(TIANGEN公司,中国)检测。分别称取正常肝组织及去细胞化肝脏生物支架各30 mg组织,蛋白酶K消化 组织3 h,实验条件及步骤参照公司试剂说明书。酶联免疫测定仪以260 nm波长检测抽提样本的DNA光密度值,组织DNA含量(ng/mg)按照5倍光密度值计算。
1.5 再细胞化肝脏的制备使用无菌PBS再次对去细胞化肝脏支架灌洗去除残留的去垢剂。支架静置于含有10%FBS的DMEM中,5% CO2,37 ℃孵箱环境中培养48 h检测是否存在细菌或真菌污染。无菌检测完毕后,将L02细胞胰酶消化、计数,使用微量泵将4 mL细胞悬液(含107个细胞)分4次,通过中心静脉通道缓慢注入无菌支架中。注入完毕以后,将再细胞化肝脏置于5% CO2,37 ℃孵箱环境中培养7 d。每天定时更换细胞培养液。
1.6 细胞RNA提取、反转录及实时定量荧光PCR用TRIzol一步法提取细胞的总RNA,以1.5 μg RNA为模板行反转录,实验条件及步骤参照TaKaRa公司的试剂和说明书。以1.5 μg cDNA作为模板行PCR检测AR-α1A、α1B、α1D和β1、β2、β3及GAPDH的表达。10 μL反应体系如下配制:0.5 μL cDNA+ 0.4 μL前引物+0.4 μL后引物+5 μL SYBR+3.7 μL 无酶水。反应条件为:95 ℃ 130 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40个循环后,95 ℃延伸10 s,65 ℃ 5 s,4 ℃保存。引物序列及产物长度见表 1。PCR反应体系中以无酶水代替cDNA模板作为阴性对照,扩增GAPDH作为阳性对照及内参照。用Bio-Rad CFX Manager软件对受体亚型表达进行定量分析。
引物名称 | 引物序列(5′至3′) | 预计产物长度 |
AR-α1A | 上游:GAAGGGCAACACAAGGACAT 下游:CCTAGACTTCCTCCCCGTTC | 301 bp |
AR-α1B | 上游:TGGGGAGAGTTGAAAAATGC 下游:AATGAAGTAGTTGGTGGGCG | 204 bp |
AR-α1D | 上游:GGTCGTAGCCCTGGTGGTG 下游:CGGAGGAGAAGACAGCGTAGC | 116 bp |
AR-β1 | 上游:CGCCTCTTCGTCTTCTTCAACTG 下游:ACATCGTCGTCGTCGTCGTC | 236 bp |
AR-β2 | 上游:TGCCAATGAGACCTGCTGTGAC 下游:TGTGTTGCCGTTGCTGGAGTAG | 526 bp |
AR-β3 | 上游:GTGTGACCGCCAGCATCG 下游:AGAAGAGGAAGGTAGAAGGAGACG | 295 bp |
GAPDH | 上游:AGGGGCCATCCACAGTCTTC 下游:AGAAGGCTGGGGCTCATTTG | 258 bp |
细胞平铺于细胞爬片(Nest公司,中国),待细胞生长至适度密度(60%)后固定、封闭。兔源性去甲肾上腺素能beta2受体多克隆抗体(Santa Cruz公司,美国)按照1 :250稀释浓度稀释,单纯抗体稀释液作为对照组,覆盖细胞爬片后4 ℃冰箱孵育过夜。次日PBS洗涤后,荧光二抗1 :1 000稀释后避光常温孵育2 h,DAPI染色剂(5 μg/mL)避光常温孵育30 min。40%甘油封片以后通过荧光显微镜观察。
1.8 Cell Titer Blue细胞增殖活性检测取对数生长期的L02细胞消化、离心后制成单细胞悬液。在流式细胞仪中按照300个细胞/孔,接种到96孔细胞培养板中。设置异丙肾上腺素浓度为25 nmol/L,普萘诺尔浓度为10 nmol/L。每个药物浓度设3个附孔,用含10%FBS的DMEM培养基作为空白对照。分别于1、3、5、7 d在避光条件下,向每次所要检测的孔中,加入100 μL检测试剂(10%FBS的DMEM中含有10% Cell Titer Blue)。细胞培养箱(37 ℃,5% CO2)中避光培养2 h,以酶标仪以560 nm波长激发荧光,590 nm波长检测光密度值。每组3个附孔取均值标准差作为统计量进行分析。
1.9 组织EdU增殖荧光技术将EdU工作液(10 μmol/L)加入支架培养液中,37 ℃,5% CO2孵育2 h,使用10%FBS的DMEM作为空白对照组使用。O.C.T包埋剂(樱花公司,日本)-80 ℃ 包埋后行冰冻切片,切片厚度为20 μmol/L。常温下固定、打孔、封闭。按照试剂盒说明书配置EdU反应液,浸泡切片,避光静置30 min。DAPI染色剂(5 μg/mL)避光常温孵育30 min。每个步骤间隙均使用PBS(3%胎牛血清)洗涤2次。最后使用40%甘油封片行荧光显微镜观察。随机挑选切片5个视野,一个再细胞化肝脏随机挑选5张切片进行拍摄(n=3)。
1.10 ELISA人微量白蛋白ELISA试剂盒、人尿素ELISA试剂盒检测。再细胞化肝脏培养液5 000 r/min离心10 min后,保留样品上清液。设置标准样品组,空白对照组,绘制出样品标准曲线,实验步骤参照试剂盒说明书。酶联免疫测定仪以260 nm波长测定各孔光密度值,计算标准曲线内对应的人白蛋白和尿素的含量(μmol/L)。
1.11 统计学方法采用SPSS 18.0统计软件进行数据处理分析,计量资料通过x±s表示,两组之间比较采用独立样本t检验。多组间比较采用单因素方差分析。
2 结 果 2.1 去细胞化肝脏生物支架制备过程大体形态学观察暴露小鼠肝脏及门静脉,经门静脉插管后灌注生理盐水清除肝脏内残留血液。腹腔内取出完整肝脏(图 1A)后,经门静脉灌注去垢剂,约4 h后,肝脏大体形态得到保留,肝脏支架变为白色、透明的复合物,可以肉眼观察到肝脏内部微血管网络(图 1B)。
2.2 去细胞化肝脏生物支架的鉴定HE染色可观察到DLB内没有蓝色深染的细胞核成分,保留了基本的骨架结构,Massion染色观察到肝脏经去细胞化处理之后,肝脏内胶原纤维和弹性纤维得到了保留(图 2)。去细胞化肝脏中DNA残留量(114.027±5.526)约为正常肝脏(9 450.087±234.387)的1%,对比组之间的差异具有统计学意义(P<0.05),达到了较好的去细胞化效果。
2.3 L02细胞株表达肾上腺素能受体及亚型RT-PCR检测L02细胞表面受体发现肾上腺素能α受体亚型(AR-α)和β受体亚型(AR-β)均有一定程度的表达,AR-β2的表达相对较高,AR-α1A几乎不 表达。为了验证AR-β2蛋白表达情况,行免疫荧光染色发现,AR-β2在细胞膜及细胞质中均有一定程度的表达(图 3)。
2.4 异丙肾上腺素促进肝细胞增殖Cell Titer-Blue法检测显示,与对照组比较,异丙肾上腺素(25 μmol/L)能明显促进L02细胞在平面上的增殖(P<0.05),当加入普萘诺尔(10 μmol/L)后,细胞增殖速率明显降低(P<0.05)。为进一步验证异丙肾上腺素的作用,采用EdU方法检测支架内种子细胞的增殖情况(图 4)。蓝色代表细胞核,红色代表反应时间内正在复制的细胞。对红色点与蓝色点的比值,即细胞增殖速率进行统计。结果显示,去细胞化第7天,实验组细胞增殖速率(0.644±0.070)明显高于对照组(0.550±0.0567),两组之间的差异具有统计学意义(P<0.05)。
2.5 异丙肾上腺素促进再细胞化肝脏白蛋白和尿素的分泌再细胞化肝脏培养7 d后,培养上清行ELISA检测发现,实验组人微量白蛋白(658.018±25.855)和尿素(356.443±36.094)的表达显著高于对照组(424.607±39.760)和(278.966±39.761),差异具有统计学意义(P<0.05)。
3 讨 论肝脏疾病是一种极其常见的疾病,全世界总死亡人口中因为肝脏疾病死亡的占2.5%[5]。原位肝移植是终末期肝病治疗最有效的方法,但制约肝脏移植的最大的问题在于肝脏供体的不足。肝脏替代治疗的出现为终末期肝病患者带来了希望。其中,全器官灌注法制备的DLB有特殊生物有效性,具有良好的研究前景[6]。
DLB是具有原始肝脏大体形态,且保留肝脏内具有生物学效应的细胞外基质成分和超微脉管结构的复合物[7]。最常用的离子型去垢剂是十二烷基硫酸钠(SDS),它可以有效去除致密组织中细胞核成分,Trion X-100为最常用的非离子型去垢剂,它可以有效地离断DNA与蛋白质之间的联系。国内外相关研究表明灌注所用时间从6~144 h不等。经前期实验摸索,本研究中所用支架是通过依次使用SDS和TritonX-100灌注的方法,约4 h时间将支架灌注完成的。并且通过组织学染色和DNA残留量检测,支架制备满足制备基本要求[2]。因此,我们所用的去细胞化肝脏生物支架在制备时间上具有一定的优势。
制备生物支架的目的是将种子细胞注入其中,获得再细胞化肝脏,模拟机体内肝脏生物培养环境,检测再细胞化肝脏功能,评估其替代效果[8]。如何有效地向DLB内植入种子细胞,提升再细胞化肝脏效能亦成为目前研究的热点。以往实验研究中可以肯定的是肝细胞三维培养较平面培养具有更大的优势[9, 10]。
2010年Uygun等[9]首次报道以来,不同的研究团队对种子细胞的选择,再细胞化过程等方面进行了诸多尝试和改进[11, 12, 13]。本研究中使用的是永生化的正常肝细胞,避免了原代细胞传代数较少,神经递质对其处理时间不足的情况。非实质性细胞如:肝血窦上皮细胞,胆管上皮细胞以一定比例与肝实质细胞共同培养,也可对肝脏结构形成、肝实质细胞有效性发挥重要作用[8]。除此之外,添加细胞因子成分等方法也可以再次提高再细胞化肝脏的功能[14]。Soto-Gutierrez等[15]通过比较不同的灌注方法发现间歇性灌注可以有效避免种子细胞过度聚集形成微血管死腔,造成细胞死亡。目前的研究成果表明,再细胞化肝脏与正常肝脏相比仍有较大的差距,故本实验组想从完善肝脏自身自主神经调节入手,探索进一步提高再细胞化肝脏功效的可能性。
肝脏受交感神经和副交感神经的双重支配,其中交感神经支配作用约占80%[16]。已有大量的研究表明,交感神经在肝脏的损伤修复与再生中发挥了重要的作用[17]。在大鼠肝脏切除模型中发现交感神经能够被异常激活,阻断交感神经可以显著降低肝脏再生的速率[18]。阻断肝前体细胞去甲肾上腺素能受体后,细胞间聚集能力下降[19];激活肝脏前体细胞去甲肾上腺素受体后可以通过激活Wnt信号通路促进细胞增殖[20]。本研究通过检测发现种子细胞表面表达去甲肾上腺素能受体及亚型,为自主神经递质对细胞发挥作用奠定了实验基础。在细胞平面培养和再细胞化肝脏培养的过程中均发现去甲肾上腺素能β受体激动剂(异丙肾上腺素)可以促进L02细胞株的增殖,并且可以在之前基础上提升再细胞化肝脏分泌白蛋白和尿素的功能。再细胞化肝脏功能的提高一方面可能是单个细胞功能的提升,也可能是促进细胞增殖的结果。这也要求在以后的研究工作中进一步探索自主神经递质对单个细胞的作用及其机制。在完善再细胞化肝脏的研究中,通过自主神经递质调节再细胞化肝脏功能及促进肝细胞增殖目前尚属首次报道。
去细胞化肝脏生物支架逼真地模拟了肝细胞在肝脏内生长的环境状态。再细胞化肝脏因保留了良好的肝脏生物学特性,在将来肝脏替代治疗中具有良好的应用前景。本实验通过成功制备肝脏生物支架,并观察神经递质在肝脏生物支架再细胞化过程中的作用发现,异丙肾上腺素可促进再细胞化进程,为人工肝脏的制备提供了新的补充材料。相信随着对生物组织工程研究的不断深入,利用去细胞化肝脏生物支架制备的再细胞化肝脏能够运用于临床实际中,解决肝脏替代治疗的难题。
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