目前，食管癌仍是需要我国重点防控的恶性肿瘤之一^[1]。核干细胞因子(nucleostemin，NS)是2002年Tsai等^[2]发现的一个集中在大多数干细胞和许多肿瘤细胞中的新型蛋白，可能有维持干细胞和癌细胞增殖的作用，并能使细胞保持在不分化的状态^[3]。有研究发现，NS基因在宫颈癌、胃癌、肝癌、肾癌以及乳腺癌等细胞中均有高表达，同时又对肿瘤细胞的恶性增殖、周期进展和凋亡逃逸有着重要的作用^[4]。细胞周期蛋白B1(Cyclin B1)是细胞周期蛋白家族中最早被发现的，其基因定位于5q12，在人类恶性肿瘤中过表达，促使细胞进入G₂/M期，加速细胞周期进程，对细胞有丝分裂和细胞增殖有调控作用^[5]，并有研究发现其异常表达与肿瘤的侵袭、转移及预后相关，提示Cyclin B1在肿瘤发生发展中起作用。PTEN是1997年发现的一种具有磷酸酶活性的抑癌基因^[6]，由人染色体10q23纯合性缺失导致。PTEN基因可以抑制肿瘤细胞的生长及调节肿瘤细胞的侵袭和转移，并且在多种肿瘤中发生突变和转移，其低表达或缺失与肿瘤的发生、发展密切相关^[7]。有研究表明NS可能与Cyclin B1是细胞通过G₂/M检验点的关键因子，PTEN是参与细胞周期调控重要的抑癌基因，可与NS结合，从而抑制其转录激活作用，并且NS可能通过PI3K/AKT/PTEN通路来影响细胞增殖。本实验采用RT-PCR、Western blot检测正常食管上皮细胞(shantou human embryonic esophageal epithelial cell line，SHEE)和永生化食管上皮恶变细胞(shantou human embryonic esophageal carcinoma epithelial cell line，SHEEC)中NS及与细胞增殖有关的Cyclin B1和抑癌基因PTEN mRNA 和蛋白的表达差异，并用RNA干扰技术抑制NS的表达，然后检测细胞增殖活性，初步探索NS对SHEEC细胞癌变的影响。

1 材料与方法 1.1 材料与试剂

SHEE及SHEEC细胞，由河南科技大学第一附属医院高社干教授惠赠。

新生牛血清(美国Gibco公司)，DMEM-F12培养基(美国Abcam公司)，超纯RNA提取试剂盒、cDNA第1链合成试剂盒和Nc-细胞核/质蛋白抽提试剂盒 (北京康为世纪生物科技有限公司)，SYBR Green Master Mix、MTT Cell Counting Kit(南京诺唯赞公司)，鼠抗人多克隆NS抗体、鼠抗人多克隆Cyclin B1抗体和鼠抗人多克隆PTEN抗体(美国Abcam公司)，辣根山羊抗兔Ig-G二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)。主要实验仪器7500 Fast Real-time PCR (System Applied Biosystems，ABI公司)，HFsafe-1200超净工作台和细胞培养箱(上海Heal Force公司)，荧光化学成像仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2 细胞培养

用含10%新生牛血清和支原体抗生素M-Plasmocin (5 mg/L)的DMEM-F12完全培养基，在 5%CO₂、37 ℃、95%湿度的恒温培养箱中培养，1～2 d换液，2～3 d传代。

1.3 RT-PCR检测SHEE及SHEEC细胞中NS、Cyclin B1 及PTEN mRNA的表达

细胞处于对数生长期时收集各组细胞并计数，用康为世纪公司超纯RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，微量核酸测定仪检测RNA浓度和纯度，用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。

按康为世纪公司的cDNA第1链合成试剂盒说明书进行反转录合成cDNA第1链。从GenBank上查找到 NS( NM_206826.1)、Cyclin B1( NM_031966.3)、PTEN (NM_000314)的基因序列，以β-actin为内参，所有引物由上海生工生物有限公司设计并合成。NS引物上游：5′-AAAGCCATTCGGGTTGGAGT-3′；下游：5′-ACCACAGCAGTTTGGCAGCAC-3′，产物片段长度240 bp。Cyclin B1引物上游：5′-GCCAATAAGGAGGGAGCAGT-3′；下游：5′-ACCTACACCCAGCAGAAACC-3′，产物片段长度101 bp。PTEN引物上游：5′-AGACCATAACCCACCACAGC-3′；下游：5′-ACACCAGTTCGT-CCCTTTCC-3′，产物片段长度126 bp。β-actin引物上游：5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′；下游：5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′，产物片段长度200 bp。

RT-PCR反应体系为20 μL，其中AceQTMQpcr SYBR Green Master Mix 10 μL，Primer F(10μmol/L) 0.4 μL，Primer R(10 μmol/L) 0.4 μL，ROX Reference Dye2 0.4 μL ，模板DNA 2 μL，RNase-Free Water 6.8 μL。采用两步法进行反应，反应条件为95 ℃预变性 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，绘溶解曲线。反应结果采用2^-ΔΔCt 法分析各组中目的基因的相对表达量，每组重复6次，取平均值。RT-PCR产物的鉴定采用2%的琼脂糖凝胶电泳，根据产物大小来判断目的条带以及有无非特性条带。

1.4 Western blot检测SHEE及SHEEC细胞中NS、Cyclin B1 及PTEN 蛋白的表达

采用康为世纪公司的Nc-细胞核/质蛋白抽提试剂盒提取各细胞组的核蛋白，并用BCA法测定蛋白样品的浓度。制备10%分离胶和5%浓缩胶,将测定好浓度的蛋白样品与5×SDS上样缓冲液、RNase-Free Water按比例混匀，95 ℃ 5 min进行变性，室温冷却后短暂离心，每孔20 μL的上样量，按照80 V 40 min，120 V 80 min进行SDS-PAGE电泳，然后按纤维垫-滤纸-PVDF膜-滤纸-纤维垫的顺序进行转膜，并赶走“三明治”中的气泡，恒流290 mA 90 min转膜。5%脱脂奶在37 ℃恒温摇床上封闭2 h，然后分别加入NS一抗 (1 ∶7 000)、Cyclin B1一抗(1 ∶1 000)、PTEN一抗(1 ∶500)和内参β-actin一抗(1 ∶5 000),4 ℃过夜后，TBST漂洗3×10 min，再加入羊抗兔Ig-G二抗(1 ∶10 000)在37 ℃摇床上孵育1 h，TBST 洗膜3× 10 min 后用ECL化学发光显色试剂盒在荧光化学成像仪中显影。采用Iamge J软件对Western blot显影结果进行分析，其条带以灰度值来呈现，以解析度为单位，按照灰度值的高低半定量分析样品中蛋白的相对表达量。

1.5 MTT法检测干扰NS后细胞增殖活性

取对数生长期的SHEEC细胞，收集细胞并计数，以(1.5～5)×10⁴/mL的细胞数接种到96孔板,每孔100 μL。实验设置空白对照组、阴性对照组和siRNA干扰组(RNAi组)。siRNA干扰组在铺板24 h后进行细胞转染，用小干扰RNA(siRNA)干扰NS的表达，转染后12、24、36、48 h进行MTT实验，具体方法为吸弃转染的培养液，PBS洗2次后向96孔板各孔中加入50 μL 稀释好的MTT反应液，37 ℃恒温培养箱孵育4 h，吸去上清，然后每孔加入150 μL DMSO，37 ℃恒温摇床上孵育10 min后用酶标仪检测490 nm波长处的光密度值[D(490)]，每组重复3次，取平均值。

1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件，数据用x±s表示，两组均数的比较采用两独立样本t检验，两组间的相关性分析采用双变量相关分析，多组均数间的比较采用单因素方差分析，多组均数间的两两比较采用LSD法，检验水准α=0.05。

2 结果 2.1 SHEE和SHEEC细胞中NS、Cyclin B1及PTEN mRNA表达

SHEE和SHEEC细胞中均有NS、Cyclin B1和PTEN mRNA的表达，主要在240 bp、101 bp、126 bp和内参条带出现目的条带，见图 1。NS、Cyclin B1 mRNA在SHEEC细胞中高表达，PTEN mRNA在SHEEC细胞中低表达。以SHEE细胞中的表达量为1，与SHEEC细胞中NS(2.047±0.507)、Cyclin B1(2.214±0.213)和PTEN mRNA(0.668±0.188)的表达量差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2 SHEE和SHEEC细胞中NS、Cyclin B1及PTEN 蛋白的表达

SHEE和SHEEC细胞中均有NS、Cyclin B1和PTEN蛋白的表达，见图 2。NS、Cyclin B1蛋白在SHEEC细胞中高表达，PTEN蛋白在SHEEC细胞中低表达。各组中NS、Cyclin B1和PTEN的蛋白表达水平，见表 1。

2.3 SHEE和SHEEC细胞中NS、Cyclin B1及PTEN表达的相关性

2.3.1 SHEE和SHEEC细胞中NS、Cyclin B1及PTEN mRNA表达的相关性

SHEE和SHEEC细胞中NS与Cyclin B1 mRNA的表达呈正相关(r=0.832)，NS与PTEN mRNA的表达呈负相关(r=-0.924)，两组之间比较的差异具有统计学意义(P<0.01)。

2.3.2 SHEE和SHEEC细胞中NS、Cyclin B1及PTEN蛋白表达的相关性

SHEE和SHEEC细胞中NS与Cyclin B1 蛋白的表达呈正相关(r=0.991)，NS与PTEN 蛋白的表达呈负相关(r=-0.769)，两组之间比较的差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.4 抑制SHEEC细胞NS表达对细胞增殖的影响

酶标仪测定空白对照组、阴性对照组和siRNA干扰组(RNAi组)细胞增殖活性结果见表 2，同一时间两两比较结果显示，转染12 h时RNAi组与空白对照组、阴性对照组比较细胞增殖活性差异无统计学意义(P>0.05)，转染24、36、48 h，3组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

食管癌是威胁人类生命健康最常见的恶性肿瘤之一，它的浸润转移是引起食管癌恶化的主要原因。癌基因和抑癌基因相互作用，共同参与肿瘤的发生、发展^[8]。核干细胞因子NS在多种人类癌细胞中高表达，在干细胞的早期多潜能状态时表达丰度很高，而在干细胞分化开始时NS基因的表达几乎完全消失，在分化的成体组织中该基因完全不表达。近年来研究发现，NS与细胞恶性增殖、细胞周期进展以及肿瘤的发生、发展紧密相关^[9]。

本研究采用正常食管上皮细胞SHEE及其恶变细胞SHEEC作为实验对象。SHEE及SHEEC细胞系是由沈忠英^[10]建立并培养传代，永生化食管细胞系可以研究正常食管细胞诱导恶变转化成永生化细胞以及向恶性细胞转化的条件及其发生发展的过程，为食管癌的癌变过程及其治疗提供一种新的模型^[11]，是近年来肿瘤研究的新热点和新领域。研究结果发现癌细胞SHEEC中NS基因和蛋白的表达量显著高于正常细胞SHEE，张功员等^[12]研究同样发现食管鳞状细胞癌组织中NS蛋白的表达率显著高于癌旁不典型增生组织和正常食管黏膜组织。本研究还发现细胞周期蛋白Cyclin B1 mRNA和蛋白均在SHEEC中高表达，而抑癌基因PTEN mRNA和蛋白却在SHEEC细胞中低表达，这与Qin等^[13]研究结果相一致。同时还做了NS、Cyclin B1及PTEN mRNA和蛋白相关性分析，在SHEE和SHEEC细胞中，NS mRNA和蛋白与Cyclin B1 mRNA和蛋白的表达呈正相关，与PTEN mRNA和蛋白的表达呈负相关，提示NS可能与Cyclin B1共同作用，通过调控细胞周期而作用于细胞增殖，PTEN可与NS结合从而抑制其转录激活作用，具体机制问题还需进一步的研究。细胞增殖实验表明干扰NS表达后，SHEEC细胞增殖能力低于空白对照组和阴性对照组，提示NS低表达能抑制SHEEC细胞的增殖活性。但是,永生化食管上皮恶变细胞是由促癌物十二烷基葵豆蔻(TPA)诱导建立的,它只是具有肿瘤特征而不是真正的肿瘤细胞，此结论只能作为参考，还需进一步的研究论证。

综上，NS可能对食管上皮恶变细胞的癌变有促进作用，可望成为食管癌研究和治疗的一个新的靶点，对食管癌的基因治疗等临床应用具有重要作用。但是NS的生物学功能和在肿瘤恶性增殖中的作用机制目前还不清楚，仍需进一步的探索。