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全反式维甲酸调控BMP9诱导3T3-L1前脂肪细胞成骨和成脂分化
刘洋 , 李锐冬 , 聂茂 , 梁凯路     
400010 重庆,重庆医科大学附属第二医院骨科
[摘要] 目的 研究全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)调控骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9, BMP9)诱导前脂肪细胞成骨和成脂分化的作用及相关机制。 方法 首先用RT-PCR检测维甲酸受体在3T3-L1前脂肪细胞中的表达;用BMP9编码序列的重组腺病毒感染3T3-L1细胞,再以1μmol/L的ATRA干预不同时间后,利用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性测定和染色、Western blot检测骨桥素(osteopontin,OPN)、骨钙素(osteocalcin,OC)和脂肪酸结合蛋白(adipocyte fatty acid binding protein,aP2)表达,茜素红染色检测钙盐沉积水平,油红O染色检测脂质积聚研究BMP9和ATRA对前脂肪细胞成骨和成脂分化的作用;利用荧光素酶报告质粒和Western blot检测ATRA对BMP9介导的BMPR-Smad信号通路活性的影响。 结果 前脂肪细胞中,除视黄醇受体γ外其余5种维甲酸受体均有表达;BMP9能增加前脂肪细胞ALP活性(P < 0.01),并促进OPN及OC蛋白表达和钙盐沉积,ATRA能进一步增强该作用(P < 0.01);BMP9能促进前脂肪细胞中脂质积聚,并诱导aP2表达,但该作用被ATRA抑制;ATRA还能够上调细胞中BMP9的mRNA和蛋白表达,BMP9合并ATRA组的Samd1/5/8磷酸化水平明显强于BMP9组,BMPR-Smad报告质粒荧光素酶活性也呈相同变化趋势(P < 0.01)。 结论 在前脂肪细胞中,ATRA能增强BMP9的成骨诱导活性,并抑制其诱导的成脂分化;ATRA的作用可能与进一步激活BMP9介导的BMPR-Smad信号有关。
[关键词] 骨形态发生蛋白9     全反式维甲酸     BMPR-Smad信号     前脂肪细胞     细胞分化    
All-trans retinoic acid regulates BMP9-induced osteogenic and adipogenic differentiation in 3T3-L1 preadipocytes
Liu Yang , Li Ruidong , Nie Mao , Liang Kailu     
Department of Orthopaedics, The Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, 400010, China
Supported by the National Natural Science Foundation for Young Scholars of China (81301573) and the General Program of Natural Science Foundation of Chongqing (CSTC2013jcyjA10090)
Corresponding author: Liang Kailu, Tel: 86-23-63693558, E-mail:liang-kai-lu@163.com
[Abstract] Objective To determine the effect of all-trans retinoic acid (ATRA) on bone morphogenetic protein 9 (BMP9)-induced osteogenic and adipogenic differentiation in preadipocytes and explore the underlying molecular mechanism. Methods Expression of retinoic acid receptors(RARs)in 3T3-L1 preadipocytes was measured by RT-PCR. The 3T3-L1 preadipocytes were infected by recombinant adenovirus BMP9 and treated with 1μmol/L ATRA. Alkaline phosphatase (ALP) activities were tested at different time points (days 5, 7 and 9 after treatment). The protein level of osteopontin (OPN), osteocalcin (OC) and adipocyte fatty acid binding protein(aP2)was detected by Western blotting after treatment of BMP9 and/or ATRA for 12 d.The mineralization and lipid accumulation in preadipocytes were tested with Alizarin red staining and Oil redOstaining after the treatment for 14 d. The activation of BMPR-Smad signaling was studied with BMPR-Smad binding site luciferase reporter assay, and Western blotting was performed to determine the phosphorylation of Smad1/5/8. Results Except retinoicXreceptorγ, the other 5 subtypes of RARs were expressed in the preadipocytes. BMP9 increased the ALP activity (P < 0.01), elevated the expression of OPN and OC as well as the deposition of mineral calcium. Addition of ATRA enhanced BMP9-induced osteogenic differentiation in the preadipocytes compared to the cells treated by BMP9 or ATRA alone (P < 0.01). BMP9 also induced aP2 expression and fat accumulation, but this effect was suppressed by ATRA. ATRA upregulated the expression of BMP9 at mRNA and protein levels, and promoted BMP9-induced phosphorylation of Smad-1/5/8. This synergistic action of ATRA and BMP9 was consistently found in BMPR-Smad luciferase reporter assay. Luciferase activity was significantly increased in ATRA and BMP9 group compared to BMP9 alone (P < 0.05). Conclusion ATRA enhances BMP9-induced osteogenic differentiation and blocks BMP9-induced adipogenic differentiation in 3T3-L1 preadipocytes, which might be partly medicated by BMP9-induced BMPR-Smad signaling.
[Key words] bone morphogenic protein 9     all-trans retinoic acid     BMPR-Smad signaling     preadipocytes     cell differentiation    

研究证实,骨质疏松症(osteoporosis,OP)在骨量减少的同时还伴有过多的髓内脂肪组织生成[1-3],表明脂肪组织在OP的发生和发展中起着重要的病理作用。骨髓脂肪细胞和成骨细胞均来源于骨髓间充质干细胞(mechenchymal stem cells, MSCs)。在OP患者中,MSCs成骨分化能力和水平明显降低,但成脂分化潜能却显著增强[4-6],表明MSCs的成骨和成脂分化平衡出现紊乱,MSCs以成骨细胞数量减少为代价产生过多脂肪细胞,最终引起骨量丢失。此外,脂肪细胞还能促进破骨细胞分化成熟并增强其活性[7-9],从而促进骨吸收,进一步导致骨量减少,加重骨质疏松程度。因此,MSCs成骨和成脂分化失衡导致脂肪细胞异常增多是OP发生的重要原因之一。

在成脂分化过程中,MSCs首先分化为前脂肪细胞,随后前脂肪细胞再进一步分化成熟。那么,如果以前脂肪细胞为靶点,寻找一种有效的细胞因子诱导该细胞转分化为成骨细胞,则不仅能减少髓内脂肪,还能增加成骨细胞数量以促进骨形成和修复,有望提供一种治疗OP的新策略。

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)属于转化生长因子超家族成员,现已经鉴别出20多种BMPs,其中多种亚型均具有较强的成骨诱导作用。近期研究发现,BMP9是目前发现的BMPs中成骨诱导活性最强的因子[10-11]。由于前脂肪细胞并不具备与MSCs相似的多向分化潜能,因此BMP9是否能诱导该细胞成骨分化目前并不明确。维甲酸(retinoic acid,RA)是维生素A的代谢中间产物,RA信号已被证实具有促进成骨和抑制成脂的生物学活性。基于此,本研究探讨了BMP9和RA信号在诱导前脂肪细胞成骨和成脂分化中的作用,并对相关分子机制进行了初步探索,为寻求一种治疗OP的新方法提供理论和实验基础。

1 材料与方法 1.1 材料

BMP9重组腺病毒(AdBMP9)、绿色荧光蛋白重组腺病毒(AdGFP)利用AdEasy系统构建[12];荧光素酶报告质粒p12xSBE-Luc由芝加哥大学医学中心何通川教授惠赠;小鼠前脂肪细胞3T3-L1购自美国典型菌种保藏中心(ATCC);全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)购自Sigma公司,采用二甲基亚砜(DMSO)作为溶剂;碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)化学发光检测试剂盒购自BD公司,采用Promega光度计(GloMax20/20)测定;ALP染色试剂盒购自碧云天公司;茜素红S及油红O染料购自Sigma公司;实验所用抗体均购自Santa Cruz公司;DMEM高糖培养基和优质胎牛血清购自Hyclone公司;Lipofectamine购自Invitrogen公司。

1.2 实验分组

分为ATRA处理组、AdBMP9处理组及ATRA合并AdBMP9处理组,以DMSO或AdGFP处理为对照组,ATRA处理终浓度为1μmol/L。将细胞铺于24或6孔板时,初始密度为30%,重组腺病毒感染效率为20%。

1.3 细胞培养和ALP活性测定及染色

3T3-L1前脂肪细胞采用DMEM高糖培养基培养(含10%胎牛血清、青霉素100 kU/L和链霉素100 mg/L),培养条件为5% CO2及37℃。用1μmol/L的ATRA和1%DMSO预处理细胞,随后用AdGFP或AdBMP9感染细胞。处理5、7、9 d后,对ALP活性进行测定。同时,利用BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒于处理第7天进行ALP染色(按试剂盒说明书进行操作)。

1.4 钙盐沉积实验

将细胞接种于24孔板中,待细胞贴壁后按1.2处理细胞,并加入成骨诱导培养基,连续培养14 d后用茜素红S进行染色:弃去培养基,PBS洗1次,加入200μL/孔0.05%戊二醛固定10 min,以去离子水洗1次,加入250μL/孔0.4%茜素红S溶液,观察有红色物质堆积时弃去染液,用去离子水终止染色,在显微镜下成像。

1.5 油红O染色

用异丙醇配制0.5%的油红O染液为储存液,使用时将其以3∶2的比例与蒸馏水混合为工作液。将3T3-L1细胞用不同因素处理14 d后,用PBS冲洗,10%甲醛固定10 min,然后用去离子水洗1次,加入250μL/孔油红O工作液染色30 min,用去离子水终止染色,在显微镜下成像。

1.6 Western blot

3T3-L1细胞接种于6孔板中,待细胞贴壁后按1.2处理细胞,在相应时间点提取细胞裂解液,然后经SDS PAGE、转膜、BSA封闭、4℃敷一抗过夜、37℃敷二抗1 h等过程后,显影成像保存。

1.7 荧光素酶报告基因的检测

将细胞接种于T25培养瓶中,贴壁后用Lipofectamine转染BMPR-Smad结合位点荧光素酶报告质粒p12xSBE-Luc 3μg,4 h后换液。12 h后将细胞消化重新种于24孔板,贴壁后加入不同处理因素。24 h后,裂解细胞并按照试剂盒说明进行荧光素酶活性测定。

1.8 RT-PCR

将指数生长的3T3-L1细胞接种于T25培养瓶中,贴壁后加入不同处理因素处理细胞。在相应时间点采用异硫氰酸胍-酚-氯仿法提取总RNA,通过RT-PCR制备cDNA,利用PCR检测目的基因表达情况。所用引物见表 1

表 1 引物序列
基因 上游(5′-3′) 下游(5′-3′)
RARα TCTCCCTGGACATTGACCTC GTGTCTTGCTCAGGCGTGTA
RARβ AATGCCACCTCTCATTCAGG GAATGTCTGCAACAGCTGGA
RARγ AGGCAGCAGACTGACCATTT TTCTGGTAGGTGTGCAGCAG
RXRα ACCCAGTTAGGGTGGGAATC AACTGGGGGACATGACAGAG
RXRβ GGCAACACTTAGCAGGGTTC GCCAAATGAGAAGGAAGCAG
RXRγ TGTGGTCAACAGTGTCAGCA AGAAGCCTTTGCAACCTTCA
BMP9 TTCCTTCAGAGCAAACAGCA GTTGTGCTCAAATCCCCATT
GAPDH ACCCAGAAGACTGTGGATGG AGGGGAGATTCAGTGTGGTG

1.9 统计学分析

所有计量资料以x+s表示,用Excel统计软件进行数据整理和统计。所有实验均重复3次, 两组间比较采用t检验, 采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析。以P < 0.05视为有统计学差异。

2 结果 2.1 维甲酸受体在3T3-L1前脂肪细胞中的内源性表达情况

应用RT-PCR检测了3T3-L1细胞中内源性RARs和RXRs表达情况。结果如图 1所示:在3T3-L1细胞中,RARα、RARβ、RARγ和RXRβ有稳定的内源性表达;继续培养至3 d,RARβ表达下降,RXRα表达增加;细胞中未检测到RXRγ的表达。

1:RARα(196 bp); 2:RARβ(180 bp); 3:RARγ(185 bp); 4:RXRα(185 bp); 5:RXRβ(183 bp); 6:RXRγ(185 bp) 图 1 RT-PCR检测3T3-L1前脂肪细胞中内源性维甲酸受体mRNA表达情况

2.2 ATRA增强BMP9诱导的3T3-L1前脂肪细胞ALP活性

ALP活性测定结果显示ATRA和BMP9都能诱导3T3-L1细胞早期成骨指标ALP活性上升,在二者联合刺激时ALP活性增加更为明显(P < 0.05,图 2A)。ALP染色也得到了一致的结果:ATRA+BMP9组染色结果明显强于ATRA或BMP9单独刺激组(图 2B)。

A:诱导5、7和9 d后ALP活性检测结果;a:P < 0.01,与对照组比较;b:P < 0.01,与ATRA组比较;c:P < 0.01,与BMP9组比较;B:组织学染色观察各处理组7 d时ALP表达水平(×100) 图 2 ATRA促进BMP9诱导前脂肪细胞ALP活性增加

2.3 ATRA促进BMP9诱导的3T3-L1前脂肪细胞晚期成骨分化标志物OPN和OC表达及钙盐沉积

图 3A所示:处理12 d后,ATRA未能明显刺激晚期成骨指标骨桥素(osteopontin,OPN)和骨钙素(osteocalcin,OC)的表达,而BMP9可在一定程度上增加OPN和OC表达;ATRA和BMP9联合刺激后,OPN和OC的表达进一步增强。茜素红S染色结果显示(图 3B),ATRA显著增加了BMP9诱导细胞产生钙结节的作用。

A:处理12 d后前脂肪细胞成骨晚期标志物OPN和OC的蛋白表达1:对照组;2:GFP组;3:ATRA组;4:BMP9组;5:ATRA+BMP9组;B:茜素红S染色观察钙盐沉积情况(×100) 图 3 ATRA促进BMP9诱导的前脂肪细胞晚期成骨分化

2.4 ATRA抑制BMP9诱导的3T3-L1前脂肪细胞脂质集聚和成脂标志物aP2表达

油红O染色结果显示:BMP9能明显促进前脂肪细胞中脂质积聚;而ATRA和BMP9共同处理后,细胞中脂质与BMP9单独处理组相比明显减少(图 4A)。此外,BMP9明显促进了成脂标志物aP2的表达,但该作用被ATRA明显抑制(图 4B)。

A:油红O染色观察前脂肪细胞中脂质积聚情况(×100);B:前脂肪细胞成脂分化标志物aP2的蛋白表达1:对照组;2:GFP组;3:ATRA组;4:BMP9组;5:ATRA+BMP9组 图 4 ATRA促进BMP9诱导的前脂肪细胞晚期成骨分化

2.5 ATRA增强BMP9在3T3-L1细胞中介导的BMPR-Smad信号活性并诱导BMP9表达

与对照组(3 208.2±714.6)相比,BMP9能明显增加BMPR-Smad报告质粒荧光素酶活性(339 543.4±21 994.8)(P < 0.05),ATRA也能增加BMPR-Smad报告质粒荧光素酶活性(54 535.4±10 235.9)(P < 0.05);BMP9与ATRA合用后,BMPR-Smad报告质粒荧光素酶活性(480 886.0±39 497.6)较BMP9组明显增加(P < 0.05);Smad-1/5/8磷酸化检测结果也呈现相同变化趋势;最后,RT-PCR和Western blot结果还显示ATRA能够上调前脂肪细胞中BMP9的基因和蛋白表达(图 5)。

A: Smad1/5/8磷酸化水平检测结果1:对照组;2:ATRA组;3:BMP9组;4:ATRA+BMP9组;B、C:BMP9的mRNA表达和蛋白表达1:对照组;2~4:ATRA组 图 5 ATRA增强BMP9在前脂肪细胞中介导的BMPR-Smad信号通路活性

3 讨论

众多研究结果表明,骨髓内脂肪组织异常增生与OP的发生发展密切相关[1-3]。脂肪细胞和成骨细胞均来源于MSCs,MSCs成骨和成脂分化受到特定细胞因子和相关激素的调控,例如在成骨转录因子Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2, Runx2)、Osterix和远端缺失同源盒5(distal-less homeobox5,DLX5)的调控下MSCs进行成骨分化,而过氧化物酶体增殖物激活型受体γ(peroxisome proliferator activated receptorγ, PPARγ)和CCAAT/增强子结合蛋白(CCAAT/enhance binding proteins, C/EBPs)等转录因子则促使MSCs脂向分化[13]。二者在生理情况下呈现为一种稳定和平衡的状态。而在病理情况下,MSCs成骨和成脂分化可能出现失衡,最终以成骨细胞减少为代价生成过多脂肪细胞。在成脂分化过程中,MSCs首先定向分化为前脂肪细胞,那么如能以前脂肪细胞为靶点,诱导其成骨分化,则不仅能减少脂肪细胞数量,同时还能促进成骨,有望为OP提供一种新的治疗策略。

目前,已有研究证实了前脂肪细胞的成骨分化潜能。Justesen等[14]报道,皮下前脂肪细胞在体内外均能转分化为成骨细胞;另有研究显示,人骨髓脂肪细胞能够向成骨方向分化,但分化前需要先诱导脂肪细胞成为纤维细胞样的前脂肪细胞[15]。然而,目前调控前脂肪细胞成骨分化的相关细胞因子及分子机制并未完全明确。有研究显示,3T3-F442A前脂肪细胞能够表达BMP受体,并且BMP2在该细胞成骨分化过程中起着重要的作用[16-17]。此外,在3T3-L1前脂肪细胞中过表达BMP2信号的下游靶基因Runx2,能够有效地诱导其向成骨细胞转分化[18]。Liu等[19]研究发现,富含血小板血浆(platelets-rich plasma,PRP)能够诱导3T3-L1前脂肪细胞成骨分化,而该作用部分是通过PRP上调细胞中BMP2的表达实现的。这些研究结果表明,前脂肪细胞在BMP2信号的刺激下能够转分化为成骨细胞。因BMP9是BMPs家族中诱导成骨能力最强的细胞因子,故我们推测其同样可能诱导前脂肪细胞向成骨细胞转分化。本研究中,BMP9被证实确能显著提高前脂肪细胞中早期成骨指标ALP的活性,并诱导其表达晚期成骨标志物OPN和OC和促进钙盐沉积。然而,BMP9同时也被发现亦能促进前脂肪细胞中脂质沉积并表达成脂特异性标志物。以上结果提示,BMP9对前脂肪细胞成骨和成脂分化具有双向诱导作用,而为了进一步对该作用进行调控,则还需其他信号分子参与。

RA是维生素A的衍生物,在胚胎发育和维持重要器官功能中发挥着关键作用,其中ATRA是体内RA的主要存在形式。RA的生物效应由RA受体介导,该受体是细胞核受体超家族成员[20],主要分为RAR和RXR,其中每种受体又分为α、β、γ3种亚型。RA信号存在时,RAR和RXR形成异二聚体与调节性的DNA元件结合从而导致下游一系列级联反应,通过招募共同激活因子启动靶基因转录[21]。现已有许多研究表明RA信号对BMP诱导的干细胞或前脂肪细胞的成骨和成脂分化有重要影响[17, 22-30],因此我们进一步探讨了ATRA对BMP9诱导的前脂肪细胞成骨和成脂分化的影响。首先,我们检测了RAR和RXR在3T3-L1细胞中的表达,结果显示除RXRγ之外,其余五种受体均有明显表达。由于ATRA是通过与RARs结合进行信号转导,故RXRγ表达缺失并不会影响ATRA激活RA信号,该结果为后续实验提供了可行性基础。下一步研究结果显示,在前脂肪细胞中,ATRA不仅能增强BMP9的成骨诱导活性,同时还抑制了BMP9诱导的成脂分化,该结果与之前许多研究相一致。尽管总体上RA表现为促进BMP诱导的骨形成和抑制BMP诱导的脂肪形成,但RA对BMP生物学活性的影响仍存有争议。近期研究显示,ATRA能够和BMP信号共同促进鼠骨髓基质细胞和胚胎腭突间充质细胞的成脂分化并抑制其成骨分化[27-28]。该结果提示,RA对BMP信号的调控作用可能与细胞种类相关。

最后,我们对ATRA调控BMP9诱导前脂肪细胞分化的可能分子机制进行了初步探讨。与其它BMPs转导信号的方式相似,BMP9亦与由Ⅰ型和Ⅱ型BMPR形成的丝氨酸苏氨酸激酶受体结合,以促进磷酸化的方式激活胞内Smad信号通路中的受体激活Smads分子(receptor-activated smads,R-Smads)Smad1/5/8[31]。被激活的R-Smads(p-Smad1/5/8)与共介导Smad(common-mediated Smad,C-Smad)分子Smad4结合形成复合体,随后进入细胞核内与不同的DNA链接蛋白结合激活下游靶基因的转录,从而诱导细胞分化。因此,笔者检测了ATRA对BMP9在前脂肪细胞中介导的Smad信号的影响。结果发现,BMP9能有效激活前脂肪细胞中BMPR-Smad信号,ATRA则能进一步增强BMP9介导的该信号的活性,而ATRA发挥该作用则可能通过上调细胞中BMP9表达实现。由于BMP9表现为对前脂肪细胞成骨和成脂分化的双向促进作用,所以ATRA增强BMP9成骨诱导的作用可能与促进BMPR-Smad信号转导有关。而ATRA抑制BMP9诱导成脂的作用则可能与RA信号本身能抑制成脂相关转录因子活性的生物学功能相关[32]。实际上,目前已经有许多研究结果表明RA对BMPs介导的Smad信号起着正向调控作用[29, 33-35],但关于RA对Smad信号的调控作用目前仍存争议。例如,有研究报道RA能够明显抑制BMP4激活的Smad信号,从而阻止BMP4诱导C3H10T1/2细胞成脂分化[26]。Sheng等[36]则通过研究提出,RA能够增强p-Smad1和其泛素E3连接酶之间的相互作用,从而导致p-Smad1的泛素化和蛋白酶体降解,最终抑制BMPR-Smad信号通路。目前,产生这些不一致结果的原因和具体机制尚未完全阐明,但可以明确的是RA对Smad信号的具体影响与细胞种类、细胞分化程度和细胞所处的体内外环境有密切关系。

通过细胞实验,本研究发现ATRA能调控BMP9介导的前脂肪细胞成骨和成脂分化,并初步探讨了相关分子机制,本课题组将进一步通过动物实验对该生物学现象进行验证并探寻其具体调控机制,从而为深入了解BMP9的生理学功能提供新的实验和理论依据,并有望为OP等骨质减少类疾病开创一种新的治疗策略。

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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201511008
中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准,
由第三军医大学主管、主办

文章信息

刘洋, 李锐冬, 聂茂, 梁凯路.
Liu Yang, Li Ruidong, Nie Mao, Liang Kailu.
全反式维甲酸调控BMP9诱导3T3-L1前脂肪细胞成骨和成脂分化
All-trans retinoic acid regulates BMP9-induced osteogenic and adipogenic differentiation in 3T3-L1 preadipocytes
第三军医大学学报, 2016, 38(15): 1722-1728
Journal of Third Military Medical University, 2016, 38(15): 1722-1728
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201511008

文章历史

收稿: 2015-11-02
修回: 2015-12-13

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