血管内膜增厚是动脉粥样硬化的一个重要特征,同时也是导致血管成形术、血管支架和移植术后血管狭窄的主要病理改变[1]。位于血管壁中膜的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)迁移到内膜并大量增殖是引起内膜增厚的主要原因。正常状态下的VSMCs呈收缩型,不具有迁移增殖能力,在各种因素如脂质、炎症因子、压力等刺激状态下,发生表型转换并获取迁移、增殖能力,进而迁移到内膜并大量增殖而引起内膜增厚[2]。
Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是介导宿主自身免疫过程中的一种高度保守的膜蛋白[3],TLR4是TLRs家族的一员,广泛表达于巨噬细胞、心肌细胞、气道上皮细胞、骨骼肌和血管平滑肌细胞等[4, 5]。在自身免疫反应中,TLR4通过激活NF-κB而引起一系列炎症因子(IL-1、IL-6、TNF-α等)的释放,进而激活炎症反应[6, 7]。近年来的研究证明,在VSMCs迁移增殖过程中,TLR4介导的炎症反应占据着重要地位,使用TLR4配体LPS激活TLR4可诱导VSMCs迁移、增殖,而使用TLR4抑制剂E5564抑制TLR4则可以明显抑制VSMCs 的迁移、增殖[8]。
姜是在世界范围内广泛使用的一种调料,而且还作为传统药物用于治疗很多疾病,如风湿、炎症、消化不良、发热等[9, 10]。进一步的研究发现,干姜提取物可以抑制动脉粥样硬化的发展[11]。因此,姜还具有抗动脉粥样硬化的重要作用。6-姜烯酚(6-shogaol,6S)是干姜中活性很高的一种提取物。在胰腺癌中,6-姜烯酚通过抑制TLR4/NF-κB途径抑制癌细胞的增殖、迁移[12]。我们推测,在动脉粥样硬化过程中,6-姜烯酚可抑制VSMCs的增殖,其机制可能与抑制TLR4介导的炎症反应有关。本研究检测经6-姜烯酚处理过的VSMCs增殖及TLR4表达情况,探讨6-姜烯酚在VSMCs增殖中的作用及分子机制,旨在为临床治疗和预防动脉粥样硬化提供新的策略。
1 材料与方法 1.1 主要试剂DMEM细胞培养液、胎牛血清(FBS) 购自美国HyClone公司。青链霉素溶液、山羊抗鼠二抗、BCA蛋白定量试剂盒购自江苏碧云天公司,TLR4抗体、NF-κB抗体、β-actin抗体购自Santa Gruz公司,6-姜烯酚购自上海阿拉丁试剂公司,脂多糖(LPS,TLR4配体)、Eritoran(E5564,TLR4抑制剂)、PDGF-BB购自Sigma公司。
1.2 实验动物3~4周龄雄性TLR4基因敲除小鼠(TLR4-/-,C57BL/6J背景)20只购自美国Jackson实验室,雄性野生型C57BL/6J小鼠(wild type,WT)20只购自第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。
1.3 细胞培养分别剪取WT和TLR4-/-小鼠胸主动脉,剥离外膜和内膜,将中膜剪为2 mm左右碎片,贴于培养瓶瓶 壁,用含10%FBS的DMEM培养基,培养于含5% CO2的37 ℃温箱内,待VSMCs爬出后,进行传代培养。用 第2~6代生长良好的VSMCs进行实验。培养的VSMCs按照小鼠来源不同分为WT-VSMCs和TLR4-/--VSMCs。
1.4 分组药物干预在培养的WT和TLR4-/--VSMCs中分别加入PDGF(20 ng/mL)诱导细胞增殖。分别应用TLR4激 动剂LPS(100 ng/mL)和TLR4抑制剂E5564(10 ng/mL) 作用于培养的VSMCs,观察TLR4增强和抑制状态对细胞增殖的影响。应用梯度浓度的6-姜烯酚(5、10、15、20 μmol/L)作用于VSMCs,观察6-姜烯酚对PDGF 诱导的VSMCs增殖的影响,并检测其对TLR4和NF-кB 表达的影响。
1.5 Western blot检测蛋白表达将VSMCs铺于6孔板,加药培养48 h后,收集细胞,用蛋白裂解液提取蛋白,用BCA试剂盒测量蛋白质浓度。按照所测蛋白浓度,将蛋白样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳后,电转至PVDF膜,4%脱脂奶粉37 ℃封闭4 h,加入对应的TLR4(1 ∶800稀释)、β-actin(1 ∶2 000稀释)或NF-κB(1 ∶500稀释)一抗,4℃孵育 过夜。TBST洗膜后加入相应二抗,孵育2 h,TBST洗膜后,在暗室用胶片曝光,Image Lab软件进行图像分析。
1.6 MTT法测定细胞增殖率将WT小鼠VSMCs(3×104/mL)用含有10%FBS的DMEM培养基,培养于96孔板,细胞贴壁后,加药培养3 d,然后向每孔加入5 mg/mL 的MTT溶液20 μL,室温培养3 h,倒掉孔内溶液,加入200 μL DMSO 溶液,静置1 h,用酶标仪读取570 nm处光密度值[D(570)]。
1.7 统计学分析数据以x±s表示,使用SPSS 16.0统计软件进行分析,两组间均数比较采用t检验,多组间样本均数比较采用单因素方差分析,两两比较采用q检验,检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 6-姜烯酚抑制VSMCs增殖在WT-VSMCs中加入PDGF可显著诱导细胞增殖,MTT法检测显示细胞的光密度明显升高,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);低浓度的6-姜烯酚(5 μmol/L)即可明显抑制PDGF诱导的WT-VSMCs增殖;随着浓度的增加,6-姜烯酚对WT-VSMCs增殖的抑制作用增强,在20 μmol/L浓度时仍可显著抑制PDGF诱导的WT-VSMCs增殖(P<0.05,图 1)。
2.2 TLR4介导的炎症反应在VSMCs增殖中的作用应用TLR4激动剂LPS和抑制剂E5564作用于培养的WT-VSMCs。结果发现,LPS和E5564可分别上调和下调 WT-VSMCs中TLR4的表达(图 2)。对于WT-VSMCs,LPS(100 ng/mL)和PDGF(20 μg/L)均可显著增加细胞的增殖能力,MTT法检测发现培养细胞的光密度升高,与WT-VSMCs-对照组相比均有统计学差异(P<0.05)。而TLR4抑制剂E5564则可显著抑制LPS和PDGF诱导的WT-VSMCs细胞的增殖(P< 0.05)。对于TLR4-/--VSMCs,PDGF和LPS刺激均未能明显诱导细胞的增殖能力升高,与TLR4-/--VSMCs-对照组相比差异无统计学意义(P>0.05,图 3)。提示 TLR4活化可促进VSMCs的增殖,而TLR4缺陷则使得PDGF和LPS诱导的细胞增殖均受到抑制。
2.3 6-姜烯酚抑制TLR4表达PDGF刺激培养的WT-VSMCs可显著上调细胞中TLR4的表达;而6-姜烯酚则呈浓度依赖性地抑制PDGF诱导的TLR4表达,5 μmol/L浓度的6-姜烯酚即可显著下调TLR4表达,20 μmol/L时仍有显著的抑制作用(P<0.05,图 4)。此外,20 μmol/L的姜烯酚还可显著抑制LPS诱导的WT-VSMCs中TLR4的表达水平(P<0.05)。即使对于正常培养条件下的WT-VSMCs(对照组),20 μmol/L的姜烯酚都可明显下调细胞中的TLR4水平(P<0.05,图 5)。
2.4 6-姜烯酚抑制TLR4下游蛋白NF-κB的表达结果显示,PDGF刺激可显著上调培养的WT-VSMCs中NF-κB的表达;而6-姜烯酚呈浓度依赖性地 抑制PDGF诱导的NF-κB表达(图 6)。此外,20 μmol/L 的6-姜烯酚可显著抑制LPS 诱导的NF-κB的表达(P<0.05);即使对于正常培养条件下的WT-VSMCs(6S组),姜烯酚也显著降低NF-κB的表达(P<0.05,图 7)。
3 讨论内膜增厚是动脉粥样硬化早期的重要病理过程,同时也参与多种原因引起的管腔狭窄性的血管疾病,如动脉成形后再狭窄、移植性血管病等。VSMCs从血管壁中膜迁移到内膜并增殖是导致内膜增厚的最主要的一个细胞机制[13]。因此,通过抑制VSMCs增殖进而抑制内膜增厚,对预防动脉粥样硬化和其他血管狭窄性疾病具有重要意义。
TLR4是人体自身免疫过程中重要的膜受体,在炎症反应过程中,TLR4激活MyD88,引起NF-κB发生核转位,导致促炎症细胞因子如IL-6、IL-1、TNF-α的释放,加重炎症进程和局部炎症反应[14]。在动脉粥样硬化病变中的VSMCs,其TLR4表达明显升高[15];抑制TLR4的表达或TLR4基因敲除可以抑制VSMCs迁移、增殖以及泡沫化过程,并抑制动脉粥样硬化的病理进程[8, 16, 17]。提示TLR4介导的VSMCs炎症反应参与了动脉粥样硬化的过程。
TLR4介导的炎症反应不仅参与了动脉粥样硬化这一炎性病理过程,而且在促进VSMCs增殖中起到重要作用。我们的研究发现,TLR4特异性配体LPS可上调TLR4的蛋白表达,并促进VSMCs的增殖,而TLR4抑制剂E5564在下调TLR4表达的同时,还显著抑制LPS引起的细胞增殖。我们应用PDGF诱导VSMCs增殖的同时,发现细胞中的TLR4水平也明显升高。而在TLR4-/-小鼠中,LPS和PDGF均未能明显诱导VSMCs的增殖。以上结果提示VSMCs增殖过程中伴随着TLR4的上调和活化,而TLR4活化则可促进VSMCs的增殖,TLR4在VSMCs的增殖过程中起到重要的作用。
姜作为一种调味品在世界范围内广泛应用,而在中国,姜还作为一种中药方剂来治疗很多疾病如:发热、瘀血、肠炎等[18]。近年来由于姜的一些新的生物活性,使它引起了越来越多的关注[19, 20]。姜辣素是生姜中含量最丰富的生物活性成分,但是姜辣素很不稳定,在生姜的储存过程中,会脱水产生大量的姜烯酚,在干姜中,6-姜烯酚与姜辣素的比例约为1 ∶1[20]。6-姜烯酚具有抗炎、抗动脉粥样硬化等作用,有研究发现,在人脐静脉内皮细胞中,6-姜烯酚可以通过抑制氧化低密度脂蛋白引起的LOX-1释放而保护内皮细胞不受损伤[21]。本研究表明,6-姜烯酚可呈剂量依赖性地抑制PDGF诱导的VSMCs增殖,低至5 μmol/L浓 度的6-姜烯酚即可明显抑制PDGF诱导的VSMCs增殖,其 抑制作用随着浓度的增加而不断增强,在20 μmol/L 浓度时仍可显著抑制VSMCs的增殖。
同时,本研究还发现,6-姜烯酚可呈剂量依赖性地下调PDGF诱导的TLR4表达,对LPS诱导的TLR4表 达也有显著的抑制作用,提示6-姜烯酚具有对抗VMSC 炎症反应的重要作用。核转录因子NF-κB是TLR4下游介导炎症反应的关键因子,我们的研究发现,PDGF诱导增殖以及单纯应用LPS活化TLR4,均可显著上调VSMCs中NF-κB的表达。而6-姜烯酚呈剂量依赖性地抑制PDGF诱导的NF-κB表达,并降低LPS诱导的NF-κB的表达,提示6-姜烯酚对VSMCs增殖过程中的TLR4/NF-κB炎性信号的活化具有抑制作用。
总之,本研究发现6-姜烯酚可显著抑制VSMCs的增殖,可能是其抗动脉粥样硬化的一个重要机制。6-姜烯酚可能通过下调VSMCs中TLR4/NF-κB炎性信号通路,进而抑制TLR4介导的炎症反应,最终抑制VSMCs的增殖能力。6-姜烯酚这一新的分子机制有望为临床治疗和预防动脉粥样硬化提供新的干预策略。
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