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结肠癌组织中补体C5a/C5aR通路活化上调FGL2的表达
陈立颖1, 朱莹1, 封奕1, 杨菲1, 郭波2, 朱波1    
1. 400037 重庆,第三军医大学新桥医院肿瘤研究所;
2. 400038重庆,第三军医大学基础医学部病原微生物教研室
摘要目的 探讨补体C5a/C5aR通路在结肠癌发病中对纤维介素蛋白-2凝血酶原酶(fibrinogen-like protein 2,FGL2)的调节机制,明确补体系统在结肠癌发病中的功能和作用。 方法 收集2013年12月至2015年7月第三军医大学西南医院普外科、新桥医院消化科15例经病理活检确诊的住院临床结肠癌患者癌及癌旁组织。采用免疫组织化学方法检测结肠癌患者癌及癌旁组织中补体活化片段C5b-9、活化C3及C5aR的表达,佐证补体系统在结肠癌中的活化状态;进一步通过体内外实验(Western blot)验证结肠癌患者癌及癌旁组织MAPK信号通路中P38的磷酸化水平及FGL2的沉积,明确结肠癌发病中补体C5a/C5aR通路与二者的调节关系。 结果 免疫组织化学及Western blot实验证实结肠癌患者癌组织C5b-9、活化C3及C5aR的表达明显高于癌旁组织,FGL2的沉积亦显著高于癌旁组织;体外结果提示C5a能促进巨噬细胞系Raw264.7MAPK通路中P38的磷酸化水平(P=0.0013)及FGL2的产生能力(P=0.0071),加入C5aR阻断剂之后,二者表达随之减弱。 结论 C5a/C5aR通路能通过MAPK信号途径中的P38信号完成对FGL2的调节作用进而参与结肠癌的发病进程。
关键词补体     结肠癌     C5a/C5aR通路     FGL2    
C5a/C5aR signaling pathway mediates FGL2 expression in colon cancer
Chen Liying1, Zhu Ying1, Feng Yi1, Yang Fei1, Guo Bo2, Zhu Bo1     
1. Institute of Cancer, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400037;
2. Department of Pathogenic Biology, College of Basic Medical Sciences, Third Military Medical University, Chongqing, 400038, China
Supported by the General Program of Natural Science Foundation of China (81222031).
Corresponding author: Guo Bo, E-mail: guobomail@gmail.com;
Zhu Bo, E-mail: b.davis.zhu@gmail.com
Abstract:Objective To determine the role of C5a/C5aR pathway in colon cancer, and investigate the regulatory mechanism of C5a/C5aR pathway in the expression of fibrinogen-like protein 2 (FGL2). Methods Fifteen colon cancer patients were recruited from general surgery department of Southwest Hospital and gastroenterology department of Xinqiao Hospital from December 2013 to July 2015. Immunohistochemical staining was used to assess the expression of complement activation fragments C5b-9, activated C3 and C5aR and the FGL2 deposition in colon cancer tissues to verify the complement activation. Western blotting was used to detect the phosphorylation level of P38 in MAPK signaling pathway and the FGL2 expression in colon cancer tissues to clarify the interaction of C5a/C5aR pathway and FGL2 expression. Results The activation fragments C5b-9, activated C3 and C5aR showed higher expression in colon cancer tissues than in the paratumor tissues. Furthermore, the expression of FGL2 in colon cancer tissues was higher than that in the paratumor tissues. Moreover, the MAPK signaling pathway was activated in the colon cancer tissues. C5a could promote the phosphorylation level of P38 in MAPK signaling pathway and the FGL2 expression in Raw264.7. However, C5aR antagonist could attenuate the expressions. Conclusion C5a/C5aR signaling pathway plays a significant role in the development of colon cancer via regulation of FGL2 expression.
Key words: complement     colon cancer     C5a/C5aR pathway     fibrinogen-like protein 2    

现目前肿瘤领域相关文献提示一种新型凝血因子FGL2的表达异常与肿瘤的发病密切相关,如在卵巢癌、胃癌等肿瘤患者局部组织中均能检测到大量FGL2的沉积,并且发现这些肿瘤患者大都处于高凝状态,提示FGL2与肿瘤的发生密切相关[1]

补体活化过程中产生的活化片段C5a具有强大的生物学活性[2, 3, 4]。在对临床许多疾病及动物模型如脓毒症、急性脑脊髓膜炎等进行研究时证实患者外周血中有大量补体活化片段C5a的产生,病变局部亦能检测到大量补体C5分子活化片段C5b-9、活化C3及C5aR的沉积,提示补体C5a/C5aR通路能参与疾病的发生及进展;同时在急性肝损伤发病中亦佐证补体C5a/C5aR通路能通过对FGL2的调节作用参与疾病的进程[5, 6, 7, 8, 9, 10]。可见补体在炎症的发生中意义重大,然而补体在肿瘤中的具体作用及调控分子机制并不清楚[11, 12, 13]。在临床肿瘤患者中往往可以观察到其机体处于高凝状态,凝血酶、凝血活酶及凝血酶原时间表达异常,而FGL2作为一种新型凝血分子发挥强大促凝效应,或在肿瘤患者高凝状态里存在负面影响,提示肿瘤不良预后[14, 15]。我们以临床结肠癌患者作为研究对象,从体内外角度研究补体C5a/C5aR通路在结肠癌发病中对FGL2的调节作用,为日后临床运用C5aR阻断剂治疗结肠癌提供实验数据。

1 材料与方法 1.1 病例选择

选取经病理检测确诊的、2013年12月至2015年7月第三军医大学西南医院普外科结肠癌患者石蜡包埋组织15例,其中男性7例,女性8例,平均年龄52.46岁;同时在第三军医大学新桥医院消化科收取结肠癌患者癌及癌旁组织2例,其中50岁男性1例,53岁女性1例,所选病例均排除其他器质性疾病。

1.2 细胞株及主要试剂

巨噬细胞株Raw264.7保存于第三军医大学全军免疫学研究所,RPMI1640购自HyClone公司,小牛血清购自天津灏洋生物制品生物有限公司,蛋白裂解液购自罗氏公司;C5aR阻断剂购自上海吉尔生化有限公司;C5aR、C5b-9一抗购置于美国Abcam公司;P38及p-P38一抗购自Cell signaling Technology公司;FGL2一抗购自Abnova公司。

1.3 细胞培养及蛋白提取

用富含10%小牛血清,100 U/mL链霉素,100 U/mL 青霉素的培养基培养小鼠巨噬细胞株Raw264.7后,传代2次,调整细胞浓度为1×105接种于6孔板中,37 ℃(5%CO2)孵箱孵育至细胞长至约80%,分别用C5a、C5aR阻断剂对细胞进行刺激(其中C5aR阻断剂组于刺激之前40 min加入,检测FGL2表达时,刺激时间为24 h,检测P38磷酸化水平时,刺激时间为 5 min)后,6孔板弃去培养基,PBS涮洗2遍,加入蛋白裂解液(每孔60 μL),冰上裂解并刮取细胞,振荡裂解5次后置于冰上裂解1 h,4 ℃,20 000×g离心10 min,取上清液,检测浓度。根据30 μg的蛋白量计算蛋白上样体积并按比例加入5×Loading Buffer混匀煮沸 15 min使蛋白充分变性后进行Western blot实验。

1.4 Western blot检测Raw264.7细胞FGL2、磷酸化P38及总P38蛋白的表达

将处理完成之后的蛋白样品进行10%~12%SDS-PAGE电泳,然后电转移至PVDF膜上,5%BSA室温封闭2 h,按照1 ∶1 000的比例稀释FGL2一抗、1 ∶1 200比例稀释p-P38及P38一抗,4 ℃孵育过夜;次日,TBST振荡洗涤8 min×5次,按1 ∶3 000稀释相应二抗室温孵育1 h,再次TBST振荡洗涤8 h×5次,ECL发光显色液曝光处理,β-actin作为内参照。

1.5 Western blot检测临床结肠癌患者癌及癌旁组织C5aR、FGL2蛋白表达

分别称取从第三军医大学新桥医院收集得到的2例结肠癌患者癌及癌旁组织样本约50 mg后,将其分别置于研钵中并标记,每个研钵加入1 mL蛋白裂解液冰上 充分研磨组织,收取组织蛋白后4 ℃,20 000×g 离心10 min,取上清液,检测浓度,而后进行Western blot实验,方法同材料与方法部分1.4.

1.6 免疫组织化学检测临床结肠癌患者癌及癌旁组织C5b-9、C3、C5aR、FGL2的表达

将材料方法1.1中收取自第三军医大学西南 医院的15例结肠癌蜡块进行切片,而后按照二甲苯×2次,每次15 min,按无水乙醇,90%、80%、70%、60%、50%乙醇的顺序常规脱蜡处理后,加入柠檬酸钠缓冲液(0.01 mol/L,pH=6.0)微波修复20min进行抗原修复,再用3%H2O2室温孵育10 min封闭组织中内源性过氧化物酶活性,而后5%BSA室温封闭1 h后按照1 ∶200 稀释度稀释C5b-9、活化C3、C5aR、FGL2一抗,4 ℃ 冰箱孵育过夜。次日PBS洗涤5 min×3次,按照相应抗体按照1 ∶200的稀释度配置HRP标记二抗,室温孵育1 h,PBS洗涤(方法同前)后DAB镜下观察染色程度并用苏木精复染,中性树脂封片,观察并采集图像。

2 结 果 2.1 补体C5活化片段C5b-9及上游活性片段活化C3在结肠癌组织中表达升高

15例临床结肠癌患者癌组织中,补体C5分子下游活性片段C5b-9及上游活化C3的表达明显高于相应癌旁组织,可以发现癌组织周围C5b-9及活化C3的沉积较癌旁组织明显呈现棕褐色,染色深,面积大(图 12)。

A:患者Ⅰ癌组织;B: 患者Ⅱ癌组织;C: 患者Ⅰ癌旁组织;D: 患者Ⅱ癌旁组织 图 1 免疫组化检测C5b-9在结肠癌及癌旁组织中的表达 (SABC×200)
A:患者Ⅰ癌组织;B: 患者Ⅱ癌组织;C: 患者Ⅰ癌旁组织;D: 患者Ⅱ癌旁组织 图 2 免疫组化检测活化C3在结肠癌及癌旁组织中的表达 (SABC×200)
2.2 补体C5分子受体C5aR在结肠癌组织中表达升高

刚才的实验表明在结肠癌患者癌组织中补体C5分子的广泛活化,同时检测补体C5分子的受体的C5aR的表达,免疫组织化学结果提示C5aR固有表达于结肠癌患者癌及癌旁组织中(图 3),进一步Western blot结果证实在结肠癌患者癌组织中C5aR的表达明显高于癌旁组织(图 4),阐明补体C5a/C5aR通路或在结肠癌发病中发挥重要作用。

A:患者Ⅰ癌组织;B: 患者Ⅱ癌组织;C: 患者Ⅰ癌旁组织;D: 患者Ⅱ癌旁组织 图 3 免疫组化检测C5aR在结肠癌及癌旁组织中的表达 (SABC×200)
1:患者Ⅰ癌旁组织;2: 患者Ⅰ癌组织;3: 患者Ⅱ癌旁组织;4: 患者II癌组织 图 4 Western blot检测C5aR在结肠癌及癌旁组织中的表达
2.3 新型凝血因子FGL2的表达在结肠癌组织中显著上调

15例结肠癌患者癌组织中FGL2的沉积明显高于癌旁组织(图 5),从组织切片上可以观察发现结肠癌癌组织中FGL2的表达呈片状分布,Western blot实验亦证实在结肠癌患者癌组织中FGL2表达显著较癌旁组织上调(图 6)。

A:患者Ⅰ癌组织;B: 患者Ⅱ癌组织;C: 患者Ⅰ癌旁组织;D: 患者Ⅱ癌旁组织 图 5 免疫组化FGL2在结肠癌及癌旁组织中的表达 (SABC×200)
1:患者Ⅰ癌旁组织;2:患者Ⅰ癌组织;3:患者Ⅱ癌旁组织;4: 患者Ⅱ癌组织 图 6 Western blot检测结肠癌及癌旁组织中FGL2的表达
2.4 C5aR阻断剂能减低C5a刺激巨噬细胞株Raw264.7分泌FGL2的能力

由于在结肠癌研究中发现巨噬细胞是较为重要的 靶向调节细胞同时巨噬细胞也是FGL2的主要来源和产生细胞,所以选择巨噬细胞Raw264.7作为研究对象,辅以C5a及C5aR阻断剂作为研究手段,结果显示C5a 确能促进巨噬细胞株Raw264.7分泌FGL2的能力,而 一旦加入C5aR阻断剂后,FGL2的产生随之减弱(图 7)。

1: Med组(对照组);2: C5a刺激组;3: C5aR阻断剂组 图 7 Western blot检测C5a刺激巨噬细胞株Raw264.7产生FGL2的能力
2.5 C5a/C5aR通路通过MAPK信号途径调节FGL2表达

为了进一步明确FGL2的调节机制,我们检测在巨噬细胞株Raw264.7中MAPK信号通路的活化水平,结果显示C5a能明显促进巨噬细胞P38的磷酸化水平,而加入C5aR阻断剂之后,磷酸化水平随之减弱,进一步验证FGL2的调节过程受到C5a/C5aR通路予以完成并且通过MAPK信号中的P38途径使然(图 8)。

1: Med组(对照组);2: C5a刺激组;3: C5aR阻断剂组 图 8 Western blot检测C5a刺激巨噬细胞株Raw264.7 P38的磷酸化水平
3 讨 论

结肠癌不良的预后很大程度上是因为肿瘤的转移,然而肿瘤转移的发生机制并不清楚,有文献报道补体C5分子在肺癌、卵巢癌的转移里起着促癌细胞迁移作用[16, 17]。研究表明,补体的活化能促进慢性炎症发生,介导血管生成,激活肿瘤相关信号通路。同时,从文献中也不难得知补体C5分子活化片段如C5b,C3a等确与肿瘤的转移具有明显相关性且与肿瘤的临床分期具有潜在关联[18, 19, 20, 21]

FGL2作为一种糖化蛋白,隶属纤维蛋白原家族,其在细胞的黏附、凝固,迁移功能的维持方面发挥着重要作用,目前认为FGL2能促进血管内微血栓形成,诱发缺血再灌注损伤,促使机体处于高凝状态,影响细胞功能,最终参与疾病进程,但就FGL2在肿瘤发生进展和转移方面的研究甚少,仅发现FGL2能促进癌细胞生长及肿瘤微血管生成并且对其在恶性肿瘤如乳腺癌、肺癌、胃癌、食管癌、宫颈癌中的表达进行检测时发现异常上调。FGL2有可能作为一种新的生物标志物,提示肿瘤的不良预后[14, 15]

本文的研究中,我们首次发现补体C5a/C5aR通路可以调节MAPK信号中的P38信号途径促进FGL2的表达,影响结肠癌发病进程。对临床结肠癌患者进行观察时,我们大都发现患者体内的凝血系统表现异常,这与我们的研究结果相互印证,但患者体内高凝状态的产生是否依赖于补体C5a/C5aR通路予以调节不得而知,在我们的文章中只给出了直接调节的依据,但具体机制有待探明。接下来的研究,我们拟采取多种结肠癌细胞系以及更多的结肠癌患者作为研究对象,着重探讨补体系统参与肿瘤的具体机制。从图 1图 2中我们可以看出,补体C5分子的活化产物C5b-9及上游活化片段C3b的表达在结肠癌组织中明显升高,所以作为补体活化级联途径中的重要参与者,C3a是否能通过与其受体C3aR结合参与致瘤作用或C5b招募形成的膜攻击复合物MAC能否影响疾病进程也是我们下一步研究方向,尽管通过我们的体外实验(图 7图 8)获得了补体C5a/C5aR通路调节FGL2的直接证据,并初步阐明此调节作用依赖MAPK信号途径中的P38来完成,但有且也只是在巨噬细胞系中予以证实,若要明确其具体机制,还需采用更多的细胞系或临床获得组织原代细胞予以佐证。

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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201510155
中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准,
由第三军医大学主管、主办

文章信息

陈立颖,朱莹,封奕,杨菲,郭波,朱波
Chen Liying, Zhu Ying, Feng Yi, Yang Fei, Guo Bo, Zhu Bo
结肠癌组织中补体C5a/C5aR通路活化上调FGL2的表达
C5a/C5aR signaling pathway mediates FGL2 expression in colon cancer
第三军医大学学报, 2016,38(6): 575-579
J Third Mil Med Univ, 2016,38(6): 575-579.
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201510155

文章历史

收稿:2015-10-21
修回:2015-11-24

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