除减少药物摄取、增加药物外流、改变药物作用靶点、增强DNA损伤后修复和抑制凋亡等经典途径外，肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)和上皮间质化(epithelial mesenchymal transitions，EMT)介导肿瘤治疗抵抗[1-2]的观点逐渐兴起。但以上这些单细胞耐药模型并不能完全解释肿瘤获得性耐药机制。最新研究认为肿瘤微环境在耐药中发挥了重要作用。在放疗存活的肺癌细胞中血小板衍生生长因子受体-β(platelet-derived growth factor receptor-beta，PDGFR-β)和干性相关基因大幅度上调[3]，但PDGFR-β信号与耐药的关系尚不明确。
几乎一半的人类肿瘤发生了p53突变。突变型p53(mutant p53，mtp53)广泛参与多种化疗药物耐药 与放疗抵抗，表达mtp53的肿瘤干细胞负责肿瘤耐药与复发[4]。三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC，ER/PR/HER阴性)占乳腺癌发病率10%～20%，高度低分化与异质性，因侵袭性强、转移率高等高恶性生物学行为与治疗反应差、病死率较高等不良预后成为近年来乳腺癌研究的热点。阿霉素(doxorubicin，Dox)为高效广谱抗癌药，广泛用于TAC、AC-P、AC-T、FAC等乳腺癌化疗方案。因此，本研究以三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞(含纯合子p53R280K)为实验对象，探讨PDGFR-β在阿霉素耐药中的作用及与突变型p53的关系，力求为优化乳腺癌化疗方案提供实验依据。
1 材料与方法 1.1 细胞与材料MDA-MB-231细胞由重庆医科大学病理学教研室提供，DMEM培养基、胎牛血清来自于HyClone公司。人源重组PDGF-DD粉末(GenScript)和阿霉素粉末(Solarbio)均用ddH2O配置成溶液，Wortmannin(Selleck)用DMSO配置。Cell Titer(一步溶解试剂)来自Promega公司；流式检测试剂由重庆医科大学生命科学院检测中心提供。脂质体2 000来自Invitrogen公司，p53 siRNA与NC RNA由上海吉玛公司设计合成，PCR引物由上海生工合成，反转录试剂盒(含gDNA Eraser)来自TaKaRa公司。WB一抗：p53鼠单抗(DO-1): sc-126(Santa Cruz)，PDGFR-β兔多抗(ImmunoWay)，TopBP1兔多抗(Bioworld)，cdk1、p21、bax、hsp90AA1等兔多抗来自上海生工公司。
1.2 细胞培养MDA-MB-231细胞用含有10%胎牛血清+1%青霉素链霉素的DMEM培养液在37 ℃、5% CO2条件下培养箱中常规培养。
1.3 MTS实验以4×103/孔将对数期细胞接种于96孔板中，加入PDGF-DD(20 ng/mL)或相应体积ddH2O，培养48 h后再分别加入Dox 0.01、0.1、1、10、50 μmol/L，同时设 置空白组，每组设置3个复孔，继续培养48 h 后按20 μL/孔 避光加入MTS溶液，继续孵育2 h，酶联免疫检测仪在490 nm波长处测定各孔光吸收值[D(490)]。计算各个给药组的细胞存活率。细胞存活率＝[实验组 D(490)值－空白组D(490)值]/[对照组D(490)值－ 空白组D(490)值]×100%。以Dox浓度对数值为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制曲线。
1.4 流式检测细胞周期和凋亡按照5×105/孔接种6孔板，加入PDGF-DD(20 ng/mL)，培养24 h后加入Dox(0.2 μmol/L)，并设立溶剂对照组，孵育24 h后胰酶消化，充分吹散后1 000×g离心5 min，PBS洗涤2次，弃上清，一边振荡一边加入1 mL于－20 ℃预冷的75%乙醇，4 ℃固定 24 h，PBS再次洗涤2次后离去上清，加入碘化吡啶(PI)和RNaseA至终浓度50 μg/mL，37 ℃ 避光30 min后用流式细胞仪测定细胞周期。在加入Dox(0.2 μmol/L)48 h后胰酶消化、轻微吹打、低速离心收集细胞，PBS洗涤3次后离去上清，依照Annexin-V-FITC 试剂盒说明书用流式细胞仪检测细胞凋亡比例。
1.5 RNA干扰MDA-MB-231细胞以40%比例接种6孔板，贴壁后，将阴性对照RNA(NC)和p53 siRNA按照脂质体2 000 说明书进行转染，4 h后换液，继续培养48 h，提取总蛋白或总RNA进行Western blot或qRT-PCR检测p53表达水平。
| RNA名称 | RNA序列 |
| p53 siRNA 1 | 正义链：5′-CUACUUCCUGAAAACAACG-3′ |
| 反义链：5′-CGUUGUUUUCAGGAAGUAG-3′ | |
| p53 siRNA 2 | 正义链：5′-UGGUUCACUGAAGACCCAG-3′ |
| 反义链：5′-CUGGGUCUUCAGUGAACCA-3′ | |
| p53 siRNA 3 | 正义链：5′-CUACUUCCUGAAAACAACG-3′ |
| 反义链：5′-GUAGAUUACCACUGCAGUC-3′ | |
| 阴性对照RNA | 正义链：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′ |
| 反义链：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3′ |
1.6 RNA提取和荧光qPCR
终止培养后，PBS洗涤细胞3次弃上清，采用TRIzol(Invitrogen)法提取细胞总RNA，去DNA后反转录为cDNA。荧光qPCR检测各指标mRNA表达水平； qPCR实验均采用Bio-Rad荧光定量PCR仪(USA)进行信号采集，数据以2-△△Ct法计算对mRNA相对表达量。
| 引物名称 | 引物序列 | 扩增长度 |
| p53 | 上游:5′-GGCGCACAGAGGAAGAGAAT-3′ | 156 bp |
| 下游:5′-CACGGATCTGAAGGGTGAAA-3′ | ||
| p21 | 上游:5′-TTAGCAGCGGAACAAGGAGT-3′ | 116 bp |
| 下游:5′-CGTTAGTGCCAGGAAAGACA-3′ | ||
| cdk1 | 上游:5′-TAGCGCGGATCTACCATACC-3′ | 128 bp |
| 下游:5′-CATGGCTACCACTTGACCTG-3′ | ||
| PDGFR-β | 上游:5′-TGGCCCTCAAAGGCGAGC-3′ | 142 bp |
| 下游:5′-GAACCCGAGCAGGTCAGAAC-3′ | ||
| TOPBP1 | 上游:5′-TCGTACTCTTTCAGATGTCAGCA-3′ | 180 bp |
| 下游:5′-CCGCAAAGATATATCCGACAACC-3′ | ||
| bax | 上游:5′-CCGATTCATCTACCCTGCTG-3′ | 111 bp |
| 下游:5′-TGAGCAATTCCAGAGGCAGT-3′ | ||
| hsp90 | 上游:5′-GCCCAGAGTGCTGAATACCC-3′ | 100 bp |
| 下游:5′-TAACAGGTGCCCTGCTTCTC-3′ | ||
| snail | 上游:5′-TTTACCTTCCAGCAGCCCTA-3′ | 108 bp |
| 下游:5′-GACAGAGTCCCAGATGAGCA-3′ | ||
| FOXC2 | 上游:5′-AGTTCATCATGGACCGCTTC-3′ | 231 bp |
| 下游:5′-TCTCCTTGGACACGTCCTTC-3′ | ||
| twist | 上游:5′-GTCCGCAGTCTTACGAGGAG-3′ | 159 bp |
| 下游:5′-CCAGCTTGAGGGTCTGAATC-3′ | ||
| oct4 | 上游:5′-CCCCTGGTGCCGTGAA-3′ | 97 bp |
| 下游:5′-GCAAATTGCTCGAGTTCTTTCTG-3′ | ||
| nanog | 上游:5′-ATTCAGGACAGCCCTGATTCTTC-3′ | 76 bp |
| 下游:5′-TTTTTGCGACACTCTTCTCTGC-3′ | ||
| β-actin | 上游:5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′ | 285 bp |
| 下游:5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′ |
1.7 蛋白质印迹法(Western blot)
将细胞接种于培养皿中，给药或转染48 h后终止培养，PBS洗涤3次，弃上清，加入适量裂解液(RIPA ∶PMSF=100 ∶1)，冰上摇30 min，刮匙快速刮取细胞裂解液，将其转入EP管中，4 ℃ 12 000×g离心20 min，取上清冰上备用；利用BCA试剂盒(碧云天)测定总蛋白浓度；向蛋白样品中加入5×蛋白上样缓冲液置沸水中变性5~10 min；根据待测蛋白相对分子质量配置相应浓度SDS-PAGE胶，电泳分离蛋白，湿转法转至PVDF膜，5%脱脂牛奶或5%牛血清蛋白封闭2～3 h，孵一抗p53鼠单抗(1 ∶500稀释)，cdk1、PDGFR-β、p21、bax、hsp90和TopBP1等兔多抗(1 ∶700稀释)，β-actin 鼠单抗(1 ∶1 000稀释)，4 ℃摇床过夜；1×TBST洗膜10 min×3次，加入二抗(山羊抗兔和抗鼠抗体均按1 ∶1 000稀释)室温孵育1.5 h，TBST洗膜10 min×3次，用ECLTM化学发光法系统采集图像，Image J软件测量条带灰度值。
1.8 统计学分析应用SPSS 20.0进行统计分析，计量资料数据以 x±s 表示，两组间均数比较采用独立样本t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，检验水准α=0.05，双侧检验。
2 结果 2.1 PDGF-DD/PDGFR-β诱导MDA-MB-231细胞发生阿霉素耐药PDGF-DD(PDGFR-β特异性配体)20 ng/mL或相应体积ddH2O处理MDA-MB-231细胞48 h后加入不同浓度阿霉素(Dox)继续作用48 h，MTS结果显示，Dox+PDGF-DD组与Dox+ddH2O组相比细胞存活率均显著升高(P<0.05，图 1A)；Dox(0.2 μmol/L)、PDGF-DD(20 ng/mL)处理后，细胞G2期比例分别为：对照组(8.96±1.80)%、Dox+ddH2O组(47.99±0.08)%、Dox+PDGF-DD组(43.04±0.09)%，Dox+PDGF-DD组与Dox+ddH2O组相比G2期比例下降差异具有统计学意义(P<0.01)；Dox(0.2 μmol/L)处理48 h后，Dox+PDGF-DD组凋亡比例(10.44±0.49)%与Dox+ddH2O(17.02±0.86)%相比差异具有统计学意义(P<0.01，图 1B、C)。表明PDGF-DD/PDGFR-β能明显降低MDA-MB-231细胞对Dox的敏感性、介导耐药发生。
|
| A：MDA-MB-231细胞存活率定量分析 a: P<0.05，与Dox+ddH2O组比较；B、C：流式细胞仪检测细胞凋亡；B：Dox+ddH2O组，C：Dox+PDGF-DD组 图 1 PDGF-DD对MDA-MB-231细胞阿霉素(Dox)耐药的影响 |
2.2 PDGFR-β信号稳定并促进突变型p53(mtp53)功能
PDGF-DD处理MDA-MB-231细胞后行Western blot和qPCR检测(图 2A、B)，结果显示，PDGF-DD组与对照组相比NF-Y靶基因PDGFR-β、cdk1 mRNA和蛋白水平显著上升，p63/p73靶基因p21、bax表达明显下降(P<0.05)。表明PDGF-DD/PDGFR-β可明显促进mtp53的致癌作用，形成PDGFR-β-mtp53-PDGFR-β正反馈环路；PDGF-DD处理后mtp53蛋白水平显著升高(P<0.05，图 2A)，而其mRNA变化差异无统计学意义(P>0.05，图 2B)，提示PDGF-DD可能从转录后水平促进mtp53功能。有报道热休克蛋白90(hsp90)能减少突变型p53蛋白降解[5]。拓扑异构酶(DNA)Ⅱ结合蛋白1(TopBP1)可促进突变型p53功能[6]。本实验数据显示，PDGF-DD能显著上调二者的蛋白水平和mRNA水平(P<0.05，图 2A~D)。予DMSO溶解的Wortmannin(PI3K抑制剂)2 μmol/L处理后，PDGF-DD+Wortmannin组与其对照组(PDGF- DD+DMSO组)相比hsp90和TopBP1 mRNA和蛋白水平都出现明显降低(P<0.05，图 2C、D)。表明PDGFR-β活化后通过PI3K信号转录水平上调hsp90和TopBP1表达可能是其促进突变型p53功能的机制之一。
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| A：Western blot检测蛋白水平 1：对照组；2~4：分别为PDGF-DD 10、20、50 ng/mL组；B：qPCR检测mRNA相对表达量 a: P<0.05，与ddH2O组比较；C：Western blot检测TopBP1、hsp90表达 1:对照组；2：DMSO组；3：Wortmannin组；4：PDGF-DD组；5：PDGF-DD+DMSO组；6：PDGF-DD+Wortmannin组；D：qPCR检测TopBP1、hsp90 mRNA相对表达量 a：P<0.05，与ddH2O组比较，b:P<0.05，与PDGF-DD+DMSO组比较 图 2 PDGFR-β信号对突变型p53(mtp53)功能的影响 |
2.3 PDGFR-β信号通过突变型p53(mtp53)促进EMT和干性相关基因表达
为验证突变型p53、PDGF-DD与耐药相关基因(如EMT相关基因、干性相关基因)的关系，我们设计并合成了3条p53 siRNA，用脂质体2 000转染后行Western blot检测，结果显示：siRNA1干扰效率最佳，其蛋白干扰率为60%左右(图 3A)，mRNA干扰率为(77.67±15.37)%。
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| A：Western blot筛选p53 siRNA 1：阴性对照RNA；2：p53 siRNA1；3：p53 siRNA2；4：p53 siRNA3；B：qPCR检测耐药相关基因mRNA水平 a:P<0.05，与NC组比较，b:P<0.05，与NC+PDGF-DD组比较 图 3 突变型p53在PDGF-DD上调耐药相关基因中的作用 |
NC+PDGF-DD组相对于NC组EMT相关基因 (FOXC2、twist、snail)、干性相关基因(nanog、oct4)mRNA 水平明显升高(P<0.05，图 3B)，p53 siRNA组相对于NC组、p53 siRNA+PDGF-DD组相对于NC+PDGF-DD组各基因mRNA水平显著下降(P<0.05，图 3B)。表明PDGFR-β信号主要通过突变型p53转录水平上调EMT和干性相关基因表达。
3 讨论PDGFR-β为酪氨酸酶受体，广泛调控细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭与转移、血管生成等过程，在正常人乳腺组织几乎不能检测，但在乳腺癌细胞和基质细胞中常过度表达，与原发性乳腺癌侵袭性表型及显著缩短的无复发生存率相关[7]，可以被PDGF-BB或-DD特异性激活(-DD与-BB相比作用尚不明确)，与PDGFR-α功能不尽相同。有报道称，非特异性酪氨酸酶抑制剂伊马替尼控制PDGFR-β而不是PDGFR-α病例进展失败[8]，结合PDGFR-β在放疗存活的肺癌细胞中上 调[3]，因此有必要深入探索其在耐药中的作用与机制。
阿霉素通过直接嵌入DNA碱基之间引发拓扑异构酶Ⅱ介导DNA三级结构破坏、诱导细胞继发性凋亡来发挥其抗癌作用。本实验MTS结果表明：PDGFR-β活化后能明显提高MDA-MB-231在阿霉素条件下细胞存活率及阿霉素IC50值，诱导耐药发生。细胞周期与凋亡检测结果证实PDGF-DD显著降低阿霉素所致的细胞凋亡，一定程度改善细胞G2/M阻滞。qPCR数据显示PDGF-DD显著提高耐药相关基因如干性相关基因、EMT相关基因、ABC转运体家族成员表达。由此可以看出，PDGFR-β介导耐药的机制涉及增强DNA损伤后修复、增强药物外流、抑制凋亡、上调耐药相关基因表达等多个方面。
相对于野生型p53，超过70%的p53突变体属于错义突变，大多发在p53 DNA结合区内，破坏其特异性DNA结合活性。突变体p53获得新功能后促进癌细胞增殖、转移、基因组不稳定性和放化疗耐药。以下是p53突变体获能的几种潜在机制：①与NF-Y转录因子相互结合、上调许多细胞周期相关基因如cyclin A、cyclin B、cdk1C、cdc25C；②与p63/p73形成复合物并阻断其DNA结合活性，下调许多凋亡基因如p21、bax。无论哪种机制其关键是p53突变体在细胞中高度累积，但p53突变体并不能独自保持自身稳定[9]，需要在恶性转化过程中获得一些其他改变的积累才能拥有长半衰期。
PDGFR-β也是NF-Y靶基因之一[10]。本实验qPCR和WB数据表明PDGF-DD能显著调节p53突变体下游基因cdk1、PDGFR-β、p21、bax表达，明显提高p53突变体蛋白水平，但其mRNA变化差异无统计学意义，提示PDGFR-β信号可能是通过转录后调节方式来促进p53突变体的功能。hsp90能失活MDM2和CHIP的E3泛素酶活性从而稳定p53突变体[5]。TopBP1作为一个支架蛋白分布于细胞核参与DNA损伤反应和DNA复制起始的功能为大家所熟悉，但其异位到细胞质、在肿瘤组织中高表达并与高肿瘤分级、短预后相关[11]的机制却知之较少。有报道TopBP1能够与p53热点突变体结合并促进其对NF-Y和p63/p73靶基因的调控[6]。本实验中PDGF-DD显著上调hsp90和TopBP1 mRNA和蛋白水平，PI3K/Akt抑制剂处理后表达明显下降，表明通过PI3K信号途径上调hsp90和TopBP1表达是PDGFR-β信号促进p53突变体致癌的机制之一。Akt失活糖原合成酶激酶3-β(GSK3-β)、激活热休克转录因子1(HSF1)可能是PI3K信号上调hsp90表达的机制之一[12]，而PI3K调节TopBP1的详细机制有待进一步探索。
低紧密连接蛋白乳腺肿瘤占TNBC 25%~39%，与高表达的EMT相关基因密切相关[13]。EMT相关基因如FOXC2能诱导干性相关基因上调、增加干细胞数目[13]。本实验运用siRNA技术证明p53突变在PDGF-DD上调EMT和干性相关基因表达中发挥了重要作用。文献[14-16]证明EMT相关基因FOXC2、snail、twist受转录因子NF-κB调控。p53突变能增强NF-κB活化强度及持续时间[17]。在肿瘤组织中p53突变体表达水平与NF-κB活性正相关[18]。因此我们推测NF-κB可能是p53突变体上调EMT及干性相关基因表达的方式之一。
综上所述，PDGF-DD/PDGFR-β能诱导MDA-MB-231细胞发生阿霉素耐药，通过PI3K途径转录水平上调hsp90和TopBP1表达、稳定并促进p53突变体介导细胞耐药是其重要机制之一。因此，PDGFR-β有可能成为耐阿霉素三阴性乳腺癌的治疗靶点之一，尤其是含p53突变的肿瘤。本研究为优化乳腺癌化疗方案提供了一定的实验依据。
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