2. 430070 武汉，广州军区武汉总医院肿瘤科
2. Department of Oncology, Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Command, Wuhan, Hubei Province, 430070, China
宫颈癌是常见妇科恶性肿瘤之一，其病死率排在全球妇科相关恶性肿瘤的第4位[1]。超过85%的宫颈癌病例都发生在发展中国家[2]。对于宫颈癌的治疗，放疗发挥着极其重要的作用。当然放疗也会引起一系列毒副反应，常见的包括放射性直肠炎、膀胱炎以及上消化道不适等症状[3, 4]。
然而，在临床工作中我们发现有些病理类型、分期和年龄等都相同的患者，辅助相同的放疗方案，其放疗敏感性却有着明显的差异，考虑这种个体差异与遗传变异有着密切的关系[5]。X线修复交错互补基因1(X-ray repair cross complementing group 1，XRCC1)是人类发现的第一个会对细胞电离辐射敏感性产生影响的哺乳动物类基因，其在单链修复中起重要作用，主要作用于DNA碱基切除修复(base excision repair,BER)途径[6]。大量文献已经证实DNA修复单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)与正常组织的放射性损伤有关，而XRCC1又是DNA修复基因家族中常见的一种[7]。本研究旨在探讨XRCC1-Arg399Gln SNP与宫颈癌急性放射性膀胱炎和直肠炎的关系，从而为提高放射治疗的安全性提供临床依据。
1 对象与方法 1.1 研究对象选择2011年7月至2015年6月在第三军医大学大坪医院肿瘤科接受放化疗初治，并经组织病理学证实为宫颈癌的患者181例，所有患者均在治疗前抽取2 mL外周血进行基因检测。其中排除27例未行化疗及2例在治疗前未检测外周血XRCC1 Arg399Gln基因型的患者；符合要求的152例患者均纳入本研究，所有患者均已签署治疗相关知情同意书，并获得了本院伦理委员会审批。患者年龄28～78(平均48)岁；临床分期采用国际妇产科联盟(FIGO)标准，其中ⅠA～ⅡA期91例，ⅡB～ⅢB期61例；鳞癌138例，腺癌12例，其他2例；其中行阴道近距离治疗65例，未行共87例。
1.2 基因多态性检测于治疗前抽取EDTA抗凝静脉血2 mL，QIAamp DNA Mini Kit提取有核细胞基因组DNA。XRCC1 Arg399Gln前向和反向引物为：5′-GATCACACCTAACTGGCATCTTC-3′、5′-CTGGGACCACCTGTGTTC-3′。前10个循环采用降落PCR，热循环条件：初始变性 94.0 ℃，5 min、变性95.0 ℃,30 s、退火65.0 ℃,30 s，每个循环降低0.5 ℃、延长72.0 ℃,30 s。再以95.0 ℃,30 s、61.5 ℃,30 s、72.0 ℃,30 s进行35个循环，最后72 ℃延伸10 min。扩增产物直接由相同引物和应用生物系统公司BigDye Terminator v3.1测序试剂盒及ABI 3730XL测序仪测序判读XRCC1 399密码子第2位核苷酸类型。
1.3 放射治疗盆腔外照射采用三维适形放疗(three dimensional conformal radintion therapy,3D-CRT)或调强放疗(intensity modulated radiation therapy,IMRT)。对未行阴道近距离治疗的患者计划靶区放射剂量为46～50.4 Gy/23～28f；未行手术治疗的阴道近距离治疗A点剂量为70～106 Gy(中位值92 Gy)；膀胱、直肠V50＜50%。外照射采用8MV-X线照射，每天1次，每周5 d；阴道近距离治疗则采用Ir192，每周1次，共3～6次，治疗当日不行盆腔外照射。
1.4 随访所有患者采用电话回访或复诊方式进行随访。随访至放射治疗后3个月，统计膀胱和直肠急性放射性损伤的发生率，采用RTOG急性放射损伤作为分级标准，0级为阴性，其余依次递增。
1.5 统计学处理分类变量临床病理因素与急性膀胱炎和直肠炎不同等级的相关性采用χ2检验。年龄、放射总剂量等连续变量在副反应不同等级间比较采用Kruskal-Wallis秩和检验。单变量和逐步向前Logistic回归进一步分析2～3级急性毒副反应风险因素。所有检验均为双边检验。
2 结果 2.1 患者的基本资料152例宫颈癌患者中，携带XRCC1 Arg/Arg、Arg/Gln、Gln/Gln基因型的分别有78例(51.3%)、56例(36.8%)、18例(11.8%)。0～3级急性膀胱炎分别有57、48、43、4例；0～3级急性直肠炎分别有20、32、 88、12例，没有4级膀胱炎、直肠炎的发生。具体见表 1。
| 临床特征 | 例数 | 百分比(%) |
| 急性膀胱炎 | ||
| 0~1级 | 105 | 69.1 |
| 2~3级 | 47 | 30.9 |
| 急性直肠炎 | ||
| 0~1级 | 52 | 34.2 |
| 2~3级 | 100 | 65.8 |
| 组织学类型 | ||
| 鳞癌 | 138 | 90.8 |
| 腺癌 | 12 | 7.9 |
| 其他 | 2 | 1.3 |
| FIGO分期 | ||
| Ⅰ~ⅡA2 | 91 | 59.9 |
| ⅡB~ⅢB | 61 | 40.1 |
| 手术 | ||
| 否 | 64 | 42.1 |
| 是 | 88 | 57.9 |
| 放疗方式 | ||
| 3D-CRT | 134 | 88.2 |
| IMRT | 18 | 11.8 |
| 阴道近距离治疗 | ||
| 否 | 87 | 57.2 |
| 是 | 65 | 42.8 |
| XRCC1 | ||
| Arg/Arg | 78 | 51.3 |
| Arg/Gln | 56 | 36.8 |
| Gln/Gln | 18 | 11.8 |
在组织学类型、分期、手术、放疗方式、阴道近距离治疗等临床因素以及XRCC1基因分型中，分期越晚、未行手术治疗、加用阴道近距离治疗的以及接受总放疗剂量更大的患者出现2～3级急性膀胱炎和直肠炎更多，差异具有统计学意义(P＜0.05，表 2)。
| 临床特征 | 急性膀胱炎 | 急性直肠炎 | ||||
| 0~1级 | 2~3级 | P | 0~1级 | 2~3级 | P | |
| 年龄 | ||||||
| 中位值(范围) | 47(28~67) | 47(34~78) | >0.05 | 48(28~71) | 47(34~78) | >0.05 |
| 组织学类型 | ||||||
| 鳞癌 | 94(61.8%) | 44(28.9%) | >0.05 | 44(28.9%) | 94(61.8%) | >0.05 |
| 其他 | 11(7.2%) | 3(2.0%) | 8(5.3%) | 6(3.9%) | ||
| FIGO分期 | ||||||
| ⅠA~ⅡA | 70(46.1%) | 21(13.8%) | <0.05 | 38(25%) | 53(34.9%) | <0.05 |
| ⅡB~ⅢB | 35(23.0%) | 26(17.1%) | 14(9.2%) | 47(30.9%) | ||
| 手术 | ||||||
| 否 | 33(21.1%) | 31(20.4%) | <0.01 | 14(9.2%) | 50(32.9%) | <0.01 |
| 是 | 72(47.4%) | 16(10.5%) | 38(25%) | 50(32.9%) | ||
| 放疗方式 | ||||||
| 3D-CRT | 88(57.9%) | 46(30.3%) | <0.05 | 44(28.9%) | 90(59.2%) | >0.05 |
| IMRT | 17(11.2%) | 1(0.7%) | 8(5.3%) | 10(6.6%) | ||
| 阴道近距离治疗 | ||||||
| 否 | 71(46.7%) | 16(10.5%) | <0.01 | 38(25%) | 49(32.2%) | <0.01 |
| 是 | 34(22.4%) | 31(20.4%) | 14(9.2%) | 51(33.6%) | ||
| XRCC1(399Arg/Gln) | ||||||
| Arg/Arg | 66(43.4%) | 12(7.9%) | <0.01 | 40(26.3%) | 38(25%) | <0.01 |
| Arg/Gln | 33(21.7%) | 23(15.1%) | 10(6.6%) | 46(30.3%) | ||
| Gln/Gln | 6(3.9%) | 12(7.9%) | 2(1.3%) | 16(10.5%) | ||
| 总放疗剂量(x±s，Gy) | 61.99±1.80 | 76.25±2.86 | <0.01 | 60.28±2.42 | 69.59±2.04 | <0.01 |
单因素Logistic回归分析表明分期、手术、阴道近距离治疗、盆腔剂量、总剂量以及XRCC1 Arg399Gln多态性均与急性放射性膀胱炎、直肠炎有显著相关性(表 3)。
| 变量 | 急性膀胱炎 | 急性直肠炎 | ||
| OR(95%CI) | P | OR(95%CI) | P | |
| 年龄a | 1.019(0.983~1.056) | >0.05 | 0.993(0.959~1.029) | >0.05 |
| 组织学类型(鳞癌 vs 其他) | 0.583(0.155~2.194) | >0.05 | 0.351(0.115~1.073) | >0.05 |
| 分期(ⅡB~ⅢB vs ⅠA~ⅡA) | 2.476(1.225~5.005) | <0.05 | 2.407(1.163~4.984) | <0.05 |
| 手术(是 vs 否) | 0.237(0.114~0.491) | <0.01 | 0.368(0.178~0.763) | <0.05 |
| 放疗方式(IMRT vs 3D-CRT) | 0.113(0.015~0.872) | <0.05 | 0.611(0.225~1.656) | >0.05 |
| 阴道近距离治疗(是 vs 否) | 4.046(1.952~8.285) | <0.01 | 2.825(1.365~5.847) | <0.05 |
| 盆腔剂量a | 1.361(1.109~1.669) | <0.05 | 1.296(1.023~1.642) | <0.05 |
| 阴道近距离治疗剂量a | 4.046(1.952~8.385) | <0.01 | 2.825(1.365~5.847) | <0.05 |
| 总放疗剂量a | 1.035(1.017~1.054) | <0.01 | 1.028(1.009~1.047) | <0.05 |
| XRCC1 Arg399Gln | ||||
| Arg/Arg | 1.00 | 1.00 | ||
| Arg/Gln | 3.833(1.699~8.647) | <0.01 | 4.842(2.143~10.943) | <0.01 |
| Gln/Gln | 11.000(3.459~34.985) | <0.01 | 8.421(1.813~39.107) | <0.01 |
| a: 作为连续变量进入方程 | ||||
以所有单因素分析因素作为候选变量，逐步向前Logistic回归分析表明只有手术和XRCC1 Arg399Gln多态性是2～3级膀胱炎独立预测因素；放疗总剂量和XRCC1 Arg399Gln多态性是2～3级直肠炎的独立预测因素。其中，有手术经历的患者相对于没有手术患者的膀胱炎发生概率显著降低(OR=0.250，95%CI﹕0.113～0.550)。XRCC1 Arg399Gln密码子杂合变异基因型携带者(Arg/Gln)和纯合变异携带者(Gln/Gln)的2～3级膀胱炎发生风险显著高于野生型患者，分别为野生型的4.114倍和9.096倍(表 4)。
| 膀胱炎因素 | B | S.E. | Wald | df | P | OR | 95%CI | |
| 手术(是 vs 否) | -1.388 | 0.403 | 11.859 | 1 | <0.05 | 0.250 | 0.113~0.550 | |
| XRCC1 | ||||||||
| Arg/Gln vs Arg/Arg | 1.414 | 0.437 | 10.467 | 1 | <0.05 | 4.114 | 1.746~9.693 | |
| Gln/Gln vs Arg/Arg | 2.208 | 0.618 | 12.747 | 1 | <0.01 | 9.096 | 2.707~30.566 | |
| 直肠炎因素 | B | S.E. | Wald | df | P | OR | 95%CI | |
| 总放疗剂量a | 0.027 | 0.010 | 6.840 | 1 | <0.05 | 1.027 | 1.007~1.047 | |
| XRCC1 | ||||||||
| Arg/Gln vs Arg/Arg | 1.612 | 0.427 | 14.234 | 1 | <0.01 | 5.011 | 2.169~11.575 | |
| Gln/Gln vs Arg/Arg | 1.969 | 0.796 | 6.122 | 1 | <0.05 | 7.165 | 1.506~34.092 | |
| a: 作为连续变量进入方程 | ||||||||
同法分析2～3级直肠炎发生风险因素，表明只有放疗总剂量和XRCC1 Arg399Gln多态性是2～3级直肠炎的独立因素。放疗总剂量每增加10 Gy，2～3级直肠炎发生风险增加30.4%(OR=1.304，95%CI：1.069～1.590)。XRCC1 399密码子Arg/Gln和Gln/Gln基因型携带者的直肠炎发生风险分别是野生型的5.011倍和7.165倍(表 4)。
3 讨论DNA损伤修复的能力决定了个体放疗敏感性和正常组织修复能力的差异[8]。XRCC1是最关键的 DNA修复基因之一，主要参与氧化应激和电离辐射所致的DNA损伤后的单链断裂修复和碱基切除修复，从而维持DNA的稳定性。该基因位于染色体19q 13.2～13.3区，其基因组大小约33 kb，cDNA全长2.2 kb，含有17个外显子。XRCC1通过编码633个氨基酸的蛋白质作为脚手架，与多聚ADP核糖聚合酶、DNA多聚酶β和DNA连接酶Ⅲ形成复合物，共同参与因电离辐射等引起的DNA损伤的修复[9]。
本研究表明，在接受放化疗治疗的宫颈癌患者中，XRCC1 399密码子Arg/Gln和Gln/Gln基因型携带者出现2～3级急性膀胱炎和直肠炎风险均比Arg/Arg基因型显著增高，并在对年龄、分期、组织学类型以及放疗方式等其他临床病理因素校正后，XRCC1 Arg399Gln多态性依然是2～3级急性膀胱炎和直肠 炎的独立风险因素。关于人XRCC1基因SNP位点，研究得最多的是分别位于XRCC1编码区的第6、9和10外显子的C26304T(Arg194Trp)、G27466A(Arg280His) 和G28152A(Arg399Gln)[9]，而Arg399Gln位点位于XRCC1蛋白和多聚ADP核糖聚合酶结合的功能区内，所以其氨基酸变化对XRCC1的DNA修复功能影响可能会更大[10, 11]。Cometta等[12]则利用2 Gy的X射线照射50名健康人外周血细胞后，彗星分析发现XRCC1 399密码子纯合变异(Gln/Gln)的彗尾长度显著长于野生型和杂合型，说明纯合变异基因型细胞修复能力更弱。在XRCC1 Arg399Gln多态性与宫颈癌易感性的相关性研究中，杂合变异(Arg/Gln)和纯合变异(Gln/Gln) 携带者宫颈癌发生风险较野生型(Arg/Arg)者显著增高[13, 14, 15]。本研究临床观察与这些基础研究以及流行病学研究结果一致。
XRCC1 SNPs与多种肿瘤的放射性副反应相关。Andreassen等[16]筛选了与放射性损伤相关的7个SNPs，研究发现XRCC1 399密码子的Gln基因型与放疗后引起的皮下组织纤维化的严重程度呈正相关。而在乳腺癌中，Keam等[17]发现在入组人群中约1/4的人出现了严重的放射性损伤，经过进一步研究显示XRCC1 Arg399Gln等位基因参与了放射性损伤的发生。近年鼻咽癌中也有相关报道，结果发现杂合变异(Arg/Gln)的患者比野生型(Arg/Arg)的发生3级急性放射性皮炎及口腔炎风险更高[18]。然而，DNA修复基因多态性与宫颈癌急性放疗损伤相关性却鲜有报道。De-Ruyck 等[5]报道了62例宫颈癌及子宫内膜癌患者，其中有22例出现了晚期放射性炎症反应，携带至少1个XRCC1 Arg399Gln密码子Gln风险等位基因的患者更容易发生晚期正常组织的放射性损伤。本研究通过较大样本量也表明XRCC1 Arg399Gln多态性与正常组织放射性损伤程度具有相关性，并且XRCC1 Arg399Gln多态性同时是急性放射性膀胱炎和急性放射性直肠炎的独立预测因素。因此XRCC1 Arg399Gln多态性有可能作为潜在的预测指标，为患者提供更为精确的放疗剂量，从而为获得更好的放疗保护措施来减轻患者放射性副反应、提高生活质量提供临床决策的依据。
本研究发现了XRCC1 Arg399Gln多态性与宫颈癌放射后急性膀胱炎和直肠炎有关，有助于提高宫颈癌患者临床治疗的针对性和可预见性。本研究局限性在于小样本量的回顾性研究，而且仅分析了一个多态性位点。需要大样本、多修复基因SNPs位点的临床试验提供更精确的预测指标，从而更好地指导宫颈癌患者个体化治疗。
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