脓毒症是临床常见的危重病症。据统计全球每年有2 100万脓毒症患者,其发生率和病死率均很高[1]。肠屏障功能受损是脓毒症重要的病理生理过程,会直接导致肠道通透性升高,细菌入血,加重脓毒症,这也是启动多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS),甚至导致机体死亡的重要因素[2]。因此,保护脓毒症肠屏障功能显得非常重要,是防御MODS和降低脓毒症死亡率的关键之一。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是来源于中胚层的一类多能干细胞,可分化成上皮细胞、脂肪细胞、成骨细胞等多种细胞,也可通过旁分泌多种营养趋化因子参与损伤组织的修复,如白细胞介素10(interleukin-10,IL-10)、转化生长因子β(transforming growth factor,TGF-β)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)等[3, 4, 5]。近年研究发现,MSCs能通过多种因子如抗炎因子IL-10、前列腺素E2等的分泌,调节免疫细胞功能,增加巨噬细胞的杀菌及自身抗炎能力,显著改善脓毒症大鼠存活率[6, 7]。此外,在炎症性肠病、放射性肠损伤、缺血再灌注肠损伤等多种疾病中,MSCs不仅可在受损的肠黏膜定植参与修复,还可通过旁分泌TGF-β、FGF等多种细胞因子促进肠上皮的增生,减少肠上皮的损伤凋亡,增加肠上皮紧密连接蛋白ZO-1、claudin的表达,维持肠屏障功能的动态平衡[8, 9],但MSCs对脓毒症大鼠肠屏障功能的保护作用有待进一步明确。聚肌苷酸胞苷酸poly(I:C)是双链RNA类似物,Toll样受体激动剂。研究发现,poly(I:C)预刺激可增加MSCs的活性及旁分泌功能,显著提升MSC治疗效能,但它增强MSCs对器官的保护作用尚少见报道。为证实MSC及poly(I:C)预刺激的MSCs对脓毒症肠屏障功能的保护作用,本研究采用盲肠结扎穿孔(cecal ligation puncture,CLP)的方法复制脓毒症模型,观察MSCs及poly(I:C)预刺激MSCs对脓毒症大鼠存活率及生存时间、肠通透性、血中D乳酸、细菌内毒素浓度和小肠病理学的影响。
1 材料与方法 1.1 材料SPF级SD大鼠,12~14周龄 ,体质量(200±20)g (第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供),DMEM/F12培养基、胰蛋白酶购自美国HyClone公司,FBS购自美国Science Cell公司,血D乳酸、LPS ELISA试剂盒购自中国南京建成生物工程研究所,MSC标志物CD90、CD105购自英国Abcam公司,FITC(羊抗兔)、TRITC(羊抗鼠)荧光二抗购自中国中衫金桥公司。poly(I:C)、Evans Blue(EB)购自美国Sigma公司。
1.2 实验方案将SD大鼠随机分为5组:正常对照组、脓毒症组、常规治疗组、MSCs治疗组、poly(I:C)预刺激MSCs组[poly(I:C)+MSCs],每组16只。常规治疗组大鼠给予乳酸林格尔液体(35 mL/kg)复苏,同时予以血管活性药 物多巴胺(1.75 mg/kg)及头孢呋辛钠(100 mg/kg),使平均动脉血压(mean arterial blood pressure,MAP)>70 mmHg,中心静脉压维持在8 mmHg;MSCs治疗组在常规治疗的基础上静脉注射MSCs(3×106/只,重悬于0.5 mL PBS,CT组静脉注射0.5 mL PBS作为对照)进行复苏;Poly(I:C)预刺激组将poly(I:C)20 μg/mL预 刺激MSCs 24 h后收集MSCs联合常规治疗。观察72 h 各组SD大鼠存活率及生存时间、肠通透性、血中D乳酸、细菌内毒素浓度、小肠病理变化。
1.3 方法 1.3.1 大鼠MSCs的培养及鉴定MSCs的提取及培养按文献[10]方法进行,取4周SD大鼠,体质量(90±20)g,予以戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉后,消毒手术区皮肤,无菌环境下分离股骨和胫骨,切开长骨干两端后,用含血清的DMEM培养基冲出骨髓细胞,用5 mL 空针将其吹打均匀,加入25 cm2培养瓶中用含15%血清的DMEM/F12培养基培养,2~3 d消化换液,收集第3~5代细胞3×106个用于后续实验。MSCs的鉴定:取第3代细胞传于激光共聚焦培养皿,待其成长覆盖率70%~80%时检测MSC标志蛋白。细胞免疫荧光技术对MSC进行双标。常规多聚甲醛固定和Triton破膜,3% BSA封闭1 h,滴加一抗CD90(1 :100)和CD105(1 :100)37 ℃ 2 h,漂洗后孵绿色(羊抗兔IgG)和红色荧光(山羊抗鼠IgG)二抗,DAPI染核后激光共聚焦下观察。
1.3.2 脓毒症模型建立SD大鼠常规消毒腹部,暴露盲肠,将盲肠内的粪便向盲肠末端充实,在距末端0.6 cm处用无菌丝线结扎,采用无菌的锥形针在已结扎盲肠远端中央处贯通穿刺后,将盲肠按原位送回腹腔,逐层缝合肌肉皮肤,放回笼中饲养。观察大鼠平均动脉血压(mean arterial blood pressure,MAP),当MAP下降30%或以上,建模成功,本实验模型成功率70%以上。
1.3.3 肠通透性、D乳酸、内毒素、肠病理的观察大鼠取全血用于测定D乳酸及细菌内毒素浓度(根据试剂盒说明书操作)。肠通透性采用Evans Blue(EB)测定[11],取大鼠小肠6 cm,生理盐水将肠腔冲净并制备肠囊。肠囊注入0.2 mL 1.5% EB溶液并置于Krebs液中37 ℃水浴30 min后冲洗,至冲洗液澄清后37 ℃干燥24 h,加入甲酰胺溶液50 ℃孵育24 h,离心 取上清液用紫外分光光度计检测,波长为655 nm,根据标准曲线计算肠组织中EB含量。同时取一段小肠进行常规病理(HE染色)观察,400倍镜下统计每组3个视野肠绒毛长度,并对红细胞、炎性细胞进行计数。
1.4 统计学方法存活时间和存活率用中位数及四分位数间距分析,其他计量数据用x±s表示,采用SPSS 13.0统计软件,进行重复测量单因素方差分析。
2 结 果 2.1 分离MSCs的鉴定镜下MSCs呈多边形,较小,有多个嵴,放射状集落生长。细胞免疫荧光显示MSCs的表面抗原标记物CD105(绿色)和CD90(红色)阳性(图 1)。
2.2 MSCs及poly(I:C)预处理MSCs对脓毒症大鼠肠通透性的影响与正常对照组比较,脓毒症组大鼠小肠通透性明显增高,表现为肠道对EB的通透率和血中D-lac含量明显增加(P<0.05)。 正常对照组肠EB含量为(1.16±0.08)mg/g,血D-Lac含量为(1.99±0.31)μmol/mL; 脓毒症组肠EB值和D-lac分别为(2.22±0.22)mg/g、(4.67±0.31)μmol/mL。常规治疗可部分改善肠屏障功能,3 d后肠EB含量和血D-Lac降低为(1.63±0.12)mg/g、(3.43±0.35)μmol/mL。与常规治疗组相比,MSCs治疗可显著改善肠屏障功能,表现为肠EB和血D-Lac水平进一步下降(P<0.05),两指标降为(1.43±0.11)mg/g和(3.01±0.24)μmol/mL;poly(I:C)可明显增加MSCs对肠屏障功能的保护作用 (P<0.05),其含量仅为(1.30±0.06)mg/g和(2.73±0.28)μmol/mL。
2.3 MSCs及poly(I:C)预处理MSCs对脓毒症大鼠血细菌内毒素浓度的影响与正常对照组相比,脓毒症组中细菌内毒素浓度显著增高,增加156%,为(200.00±12.86)EU/L;常规治疗后血中内毒素浓度有所降低,有一定效果;MSCs+常规治疗后血中内毒素浓度显著减少,降低 29.10%;poly(I:C)预刺激MSCs可显著增强MSCs的保护作用,内毒素浓度降低41%,为(118.60±6.87)EU/L。
2.4 MSCs及poly(I:C)预处理MSCs对脓毒症大鼠小肠病理结构的影响正常对照组小肠绒毛及腺体结构清晰,柱状上皮排列整齐,边缘为微绒毛组成的纹状缘,绒毛长度为(560±28)μm,炎性细胞、红细胞分别为(24±5)、(4±2)个;脓毒症后小肠腺体萎缩,绒毛减少变短并 断裂,为(435±35)μm,杯状细胞、炎性细胞增多[(56± 6)个],红细胞渗出明显[(27±6)个]。常规治疗小肠绒毛及腺体增多,柱状上皮细胞开始增生修复,炎症仍明显;MSCs治疗后受损肠组织得到进一步修复,肠绒毛增多且长度增加为(510±22)μm,炎症减轻明显;poly(I:C)预刺激能更好地发挥MSCs对肠道的保护作用,炎症明显减轻,肠绒毛长度为(535±18)μm,红细胞渗出减少仅为(12±4)个(图 2)。
2.5 MSCs及poly(I:C)预刺激MSCs对脓毒症大鼠存活率、存活时间的影响脓毒症组大鼠存活率、存活时间很低,24 h存活率仅为18.75%(3/16),72 h存活率、存活时间分别为6.25%(1/16)和9.2 h;常规治疗后可部分改善脓毒症大鼠存活时间、存活率;MSCs+常规治疗后,显著提升脓毒症大鼠存活率、存活时间,其中MSCs组24 h存活率为50%(8/16),72 h存活率增至37.50%(6/16),平均生存时间增加了16 h;poly(I:C)预刺激可明显增加MSCs的保护作用,其平均存活时间增至50 h,72 h存活率上升至50.00%(8/16)。
3 讨 论脓毒症发生率和病死率一直居高不下,肠道通透性增高在脓毒症病程进展中发挥了重要作用。目前常用的保护脓毒症肠屏障功能的措施有肠内营养、益生菌和肠黏膜保护剂等[12, 13],虽有一定效用,但仍没完全解决此问题。近年,MSCs在多种疾病的肠屏障功能保护中发挥了重要作用。Zhang等[14]发现MSCs在治疗炎症性肠病时,可减轻血中D-lac浓度,上调紧密连接蛋白ZO-1表达。Chen等[15]在MSCs治疗放射性肠损伤时,发现经肿瘤坏死因子α及白介素1-β预刺激的MSCs能增强旁分泌功能从而达到更好的治疗效果。同时研究[3, 16, 17, 18]证实,MSCs能显著改善脓毒症大鼠存活率,对脓毒症心、肝、肾、肺器官均有保护作用,其治疗脓毒症的主要机制为:①MSCs的免疫调节作用,通过调节机体免疫细胞,如巨噬细胞、淋巴细胞、树突状细胞等,增强机体消炎杀菌能力;②MSCs的旁分泌作用,分泌多种生长因子如FGF、TGF等参与受损组织的修复;③MSCs的多向分化潜能,通过直接分化为受损组织细胞参与修复。目前尚少见MSCs保护脓毒症肠屏障功能的相关报道。本研究采用CLP建立脓毒症模型显示,与常规治疗相比,MSCs联合常规治疗3 d后能较好地改善脓毒症大鼠的肠屏障功能,减轻血中D乳酸、内毒素浓度,并对肠组织有修复作用。Chen等在MSCs治疗放射性肠损伤时也发现3 d后开始有效果,同时Li等通过共聚焦激光内镜发现经绿色 荧光蛋白标记的MSCs在第2天和第4天在结肠黏膜固有层定植[19]:这些结果均验证了本研究的结论。但对于MSCs发挥保护作用的具体机制,尚需进一步研究。
由于干细胞大都属于异体移植,有一定免疫原性,这使得进入机体的干细胞容易遭受免疫攻击而凋亡,导致MSCs治疗效能较为低下。干细胞进入机体后的存活及其功能的保护成为关注的热点之一。如何保护干细胞进入机体后发挥更大的促组织修复效能,国内外学者做了大量研究。近年研究发现,poly(I:C)作为Toll样3受体的激动剂,可增强MSCs的治疗效果。Zhao等[20]发现poly(I:C)可通过降低MSCs的免疫原性,增强MSCs对脓毒症小鼠的治疗效果,提升脓毒症小鼠存活率及存活时间;Tomchuck等[21]发现经poly(I:C)能增强MSCs的迁移及免疫调节能力,提升MSCs活性。Mastri等[22]研究发现,poly(I:C)可增强MSCs旁分泌多种营养因子的能力,如TGF-β、基质衍生因子-1α、FGF等,从而提升MSCs对受损组织的修复效能,但它能否增强MSCs对脓毒症大鼠肠屏障功能的保护作用少见相关报道。本研究发现,poly(I:C)增加了MSCs对脓毒症大鼠肠屏障功能的保护作用,显著降低了脓毒症大鼠血中D-Lac及内毒素浓度,其机制可能主要与增加MSCs的存活数量及增强MSCs旁分泌营养因子能力相关。本研究尚未对poly(I:C)预刺激的后MSC进行相应细胞因子的体外检测,亦尚未对MSC进行荧光示踪定位,这将是我们下一步研究的重点。
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