人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse enzyme,hTERT)是端粒酶的一个亚单位，作为端粒酶的限速成分在端粒酶的活化中发挥主要作用。hTERT的表达可以代表端粒酶的活化^{[1, 2]}。既往研究表明，端粒酶的活化以及hTERT表达参与了肿瘤侵袭转移过程^{[3, 4, 5, 6]}。经典的Hedgehog信号通路主要由配体Hedgehog、跨膜蛋白受体patched (Ptch)和smoothened (Smo)，以及转录因子Gli家族构成，其中Gli家族是Hedgehog信号通路中的核心成员^[7]。Gli的激活将导致其下游一系列分子的转录，
包括上皮间叶转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关因子，如SIP1,ZFHX1B,ZEB2等^{[8, 9, 10]}。研究表明，胃癌组织中hTERT与Gli1的表达呈显著正相关^[10]，提示hTERT与Gli1之前可能存在调控与被调控的关系。

本研究拟观察hTERT对Gli1表达调控的影响，并进一步探讨hTERT促进胃癌细胞侵袭转移的分子机制，为基于hTERT的胃癌治疗提供理论依据。

DMEM培养基(美国Hyclone公司)，胎牛血清(美国Gibco公司)；Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司)；一抗兔Gli1抗体(美国ORIGENE公司，编号TA803969)；双荧光素酶报告基因检测系统(美国Promega公司)；人胃腺癌细胞株SGC-7901由本实验室保存。

人胃腺癌细胞SGC-7901用含10%胎牛血清的DMEM/H培养基培养，条件为37 ℃，5% CO₂。

以10⁶细胞/1 mL TRizol Reagent的比例加入TRizol Reagent，按照操作说明提取细胞RNA，溶于40 μL DEPC 水。

按照Premix ExTaq试剂盒说明加入逆转录反应试剂，逆转录反应条件：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。合成的cDNA作为模板进行qPCR扩增，根据Premix ExTaq^TM试剂盒说明加入Premix、ROX Dye Ⅱ、Primer R、Primer F、cDNA及H₂O。qPCR 条件：95 ℃，2 min；40次循环于95 ℃，15 s；60 ℃，30 s，采集荧光。25 μL反应体系，GAPDH作为内参。引物序列为：Gli1-Primer F (5′-GCGTGAGCCTGAATCTGTGTAT-3′)、Gli1-Primer R (5′-TGGATGTGCTCGCTGTTGATG-3′)；GAPDH-Primer F (5′-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3′)、GAPDH-Primer R (5′- TCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGCT-3′)。

采用RIPA法提取SGC-7901细胞总蛋白、BCA法测定蛋白浓度 (根据说明书)。取20 μg蛋白经10% SDS-PAGE 胶分离后，湿转(条件：恒流200 A，90 min)至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，分别用抗Gli1的一抗(1 ∶500稀释)，抗hTERT的一抗(1 ∶1 000稀释)，抗GAPDH的一抗(1 ∶5 000稀释)孵育过夜，再与辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG孵育1 h，与辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠 IgG 孵育 1 h，用TBST液洗膜后曝光显色。

将SGC-7901细胞接种于96孔板，24 h后细胞贴壁汇合率达50%时共转染荧光素酶质粒Gli1-Promoter Luciferase reporter及对照质粒pRL-TK、hTERT过表达质粒pIRES2-hTERT及对照质粒pIRES2-NC。转染24 h以后，采用双荧光素酶报告基因检测系统处理细胞，用GloMax20/20 Luminometer检测荧光强度。

将SGC-7901细胞接种于6孔板，24 h 后细胞贴壁汇合率达50%进行转染，转染试剂采用Lipofectamine 2000，转染步骤按试剂说明书推荐步骤进行。si-NC的终浓度为100 nmol/L ,si-Gli1的终浓度为100 nmol/L；pIRES2-NC 的终浓度度为60 nmol/L; pIRES2-hTERT的终浓度为80 nmol/L。

委托重庆吉玛基因公司构建Gli1干扰质粒si-Gli1； 本实验室已成功构建hTERT过表达质粒(pIRES2-hTERT)及对照质粒(pIRES2-NC)^[11]。经http://genome.ucsc.edu/ 获得人Gli1 的启动子序列，委托上海生工公司将Gli1的启动子序列克隆至pGL3-basic位点，构建重组萤火虫荧光素酶报告质粒pGL3-basic-Gli1，经双酶切电泳及测序鉴定质粒构建成功。

胃癌细胞的侵袭、迁移计数以及Gli1启动子荧光素酶活性的检测均采用配对t检验,采用SPSS 19.0软件进行统计分析。

分别转染piRES2-NC及piRES2-hTERT于SGC-7901细胞48 h之后，采用qRT-PCR和Western blot检测hTERT的蛋白水平以及Gli1 mRNA、蛋白的表达水平。过表达hTERT可明显增加Gli1 mRNA的表达，pIRES2-NC为(1.11±0.10)，pIRES2-hTERT为(4.60±0.81) (P=0.003 8)和蛋白的表达(图 1)。

1：pIRES2-NC空载质粒转染;2：pIRES2-hTERT过表达质粒转染 图 1 过表达hTERT对SGC-7901胃癌细胞Gli1 mRNA和蛋白表达的影响

图选项

图 1结果表明hTERT可以增加Gli1 mRNA的表达，提示hTERT可能在转录水平调控Gli 1的表达。我们进一步采用双荧光素酶实验，检测hTERT对 Gli1启动子的影响。我们构建了含Gli1启动子的荧光素酶报告载体，将hTERT过表达载体或对照载体，与Gli1启动子荧光素酶载体分别共转染SGC-7901细胞，48 h后检测荧光素酶报告基因的活性，pIRES2-NC为(0.096±0.033)，pIRES2-hTERT为(0.188±0.026)，hTERT可明显增强Gli1启动子的活性(P=0.003 874)，提示hTERT可通过促进Gli1的转录进而增强其表达。

采用Gli1的干扰RNA si-Gli1干扰Gli1的表达，如图 2所示，SGC-7901胃癌细胞中si-Gli1显著降低了Gli1的表达。

1：si-Gli1；2：si-NC 图 2 Western blot检测Si-Gli1干扰Gli1的表达

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在hTERT过表达的SGC-7901胃癌细胞中同时转染si-Gli1质粒，采用划痕实验观察干扰Gli1对胃癌细胞迁移能力的影响。如图 3所示，与si-NC组相比，si-Gli1组的胃癌细胞的迁移能力明显减弱，提示干扰Gli1可显著抑制hTERT对胃癌细胞的迁移，hTERT有可能通过促进Gli1的表达并进而促进胃癌细胞的迁移。

A:hTERT+si-NC 0 h；B: hTERT+si-Gli1 0 h；C:hTERT+si-NC 48 h；D: hTERT+si-Gli1 48 h 图 3 干扰Gli1的表达可显著抑制hTERT促胃癌细胞的迁移

图选项

采用Transwell实验验证抑制Gli1的表达后，过表达hTERT的SGC-7901细胞侵袭能力的变化。结果显示，共转染pIRES2-hTERT、si-Gli1 24 h之后，相对于si-NC组，si-Gli1组中从膜上侧迁移至膜下侧的SGC-7901细胞数量明显减少，表明干扰Gli1的表达显著降低了SGC-7901细胞的迁移能力(图 4)。证明hTERT可通过Gli1进而促进胃癌细胞侵袭。

A: hTERT+si-NC，共转染pIRES2-hTERT、si-NC于SGC-7901细胞；B: hTERT+si-Gli1，共转染pIRES2-hTERT、si- Gli1于SGC-7901细胞 图 4 Transwell检测干扰Gli1的表达抑制hTERT对胃癌细胞侵袭能力的影响(结晶紫 ×40)

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在胃癌细胞株SGC-7901中过表达hTERT之后，Gli1的mRNA及蛋白表达水平显著上调，且Gli1启动子荧光素酶报告基因活性显著增加，而干扰Gli1的表达抑制了胃癌细胞的侵袭和迁移。提示hTERT能够调控Gli1的表达。

hTERT在胃癌转移的淋巴结组织中显著升高，与胃癌淋巴结转移情况，TNM分期，浆膜层浸润等临床病理特征密切相关^{[12, 13]}。hTERT导致胃癌细胞发生上皮-间质EMT改变，其在胃癌组织中的表达水平与Snail1、Vimentin等呈正相关^[14];干扰hTERT的表达能够抑制胃癌细胞的EMT样改变和侵袭转移。有意思的是，hTERT能够以非依赖于端粒酶活性和不改变端粒长度的条件下，促进血管内皮生长因子表达(VEGF)和肿瘤的进程^[15]。hTERT同样与肿瘤的侵袭转移密切相关。因此，阐明hTERT导致胃癌侵袭转移的具体分子机制，有益于通过靶向hTERT的表达从而抑制肿瘤细胞侵袭转移。hTERT 本质上是一种酶，文献^[16]报道hTERT 能够与NF-κB 的p65 亚基结合并促进p65 的入核，进而影响大部分NF-κB 的下游基因的表达；此外，研究亦表明hTERT能够通过与β-catenin蛋白-蛋白相互作用后促进Wnt通路下游靶基因的表达^[17]。也就是说hTERT可以作为co-activator，通过影响某些转录因子的表达最终影响靶基因的表达。据此，有理由推测hTERT引起的Gli1表达变化可能原因是，hTERT作用于某些转录因子，通过与转录因子结合后，共同作用于Gli1的启动子区域，影响其功能或者其表达水平。

Gli1是Hedgehog信号通路中的主要成员之一，其表达的高低显著影响了该信号通路的活性。有研究表明，Gli1的转录主要受一段长达1.4 kb的序列调控，该序列包含 5侧翼序列、一个非编码外显子以及425 bp 处的内含子。Gli1的核心启动子区位于-357~+130，富含GC序列和CpG岛，而缺乏TATA框、CCAAT框。c-MYC和Twist能与该序列上的E-box结合，促进Gli1的转录^[18]。Beauchamp等^[19]报道，在Gli1启动子区域含有多个EWS-FLI1 蛋白结合序列GGAA，EWS-FLI1能与这些位点结合进而上调Gli1的转录水平。这些研究提示hTERT可能与Gli1的转录因子相互作用，共同启动Gli1基因的转录。本研究明确了Gli1在胃癌细胞侵袭转移中的作用，证实了hTERT通过转录后调控Gli1的表达。