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二氯乙酸盐通过促进Mcl-1降解诱导宫颈癌细胞凋亡
闫晓欢, 王 婉, 郑英如    
400042 重庆,第三军医大学大坪医院野战外科研究所妇产科
摘要目的 探讨二氯乙酸盐(dichloroacetate, DCA)对宫颈癌细胞增殖、凋亡的影响及其可能机制。方法 采用CCK-8法检测DCA对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响;流式细胞仪检测DCA对HeLa细胞凋亡的影响;Western blot检测DCA对HeLa细胞凋亡相关蛋白PARP(poly ADP-ribose polymerase)和Mcl-1 (myeloid cell leukemia-1)水平的影响。结果与对照组比较,DCA处理可显著抑制HeLa细胞增殖(P<0.01)、促进细胞凋亡(P<0.01)、升高剪切型PARP(cleaved PARP)蛋白的水平、下调凋亡抑制蛋白Mcl-1的表达。DCA对HeLa细胞Mcl-1蛋白的下调作用可被蛋白酶体抑制剂MG132所抑制,但不能被蛋白翻译抑制剂放线菌酮(cycloheximide,CHX)所抑制。 结论 DCA促进宫颈癌细胞凋亡的作用可能与其促进蛋白酶体降解Mcl-1有关。
关键词二氯乙酸盐     宫颈癌     细胞增殖     细胞凋亡     Mcl-1    
Dichloroacetate induces apoptosis in cervical cancer cells by degrading myeloid cell leukemia-1
Yan Xiaohuan, Wang Wan, Zheng Yingru    
Department of Obstetrics and Gynecology, Institute of Surgery Research, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400042, China
Supported by the General Program of National Natural Science Foundation of China (81472436, 81272865).
Corresponding author: Zheng Yingru, E-mail: zyrdaping@aliyun.com
Abstract:ObjectiveTo determine the effect of dichloroacetate (DCA) on the proliferation and apoptosis of cervical cancer cells, and investigate the possible mechanism. Methods CCK-8 assay was used to measure the effect of DCA on the proliferation of cervical cancer HeLa cells, and flow cytometry to detect its effect on cell apoptosis. Expression levels of apoptosis-associated proteins poly ADP-ribose polymerase (PARP) and myeloid cell leukemia-1 (Mcl-1) was measured in HeLa cells after DCA treatment by Western blot analysis. Results DCA treatment significantly suppressed the proliferation (P<0.01), enhanced the apoptosis (P<0.01), increased the level of cleaved PARP, and reduced the level of Mcl-1 protein in HeLa cells. Moreover, the DCA-mediated down-regulation of Mcl-1 protein in HeLa cells could be attenuated by proteasome inhibitor MG132, but not by translation inhibitor cycloheximide (CHX). Conclusion DCA promotes the apoptosis of cervical cancer HeLa cells, which may be resulted from the down-regulation of Mcl-1 protein by DCA-induced proteasomal degradation.
Key words: dichloroacetate     cervical cancer cells     cell proliferation     apoptosis     myeloid cell leukemia-1    

宫颈癌是严重威胁女性生命健康的恶性肿瘤,除手术和放疗外,化疗(主要针对晚期及复发的宫颈癌)也是一种重要的治疗措施。目前,以顺铂为基础的联合化疗方案应用最为广泛,但其副作用较大,效果也尚不理想。因此,亟待探索有效且毒副作用小的治疗措施。近年研究表明:肿瘤也是一种代谢异常疾病,通过调节代谢抗肿瘤已成为肿瘤治疗领域中的新研究热点之一[1, 2]。在诸多通过调节代谢而抗肿瘤的药物中,二氯乙酸盐(dichloroacetate,DCA)显示出良好的抗肿瘤前景,其可抑制多种肿瘤细胞的生长,但对正常细胞无影响[2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10]。本研究以HeLa细胞为模型,观察了DCA对宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响,并初步探讨了可能机制,为探索宫颈癌治疗新策略提供实验依据。

1 材料与方法 1.1 细胞及主要试剂

人宫颈癌HeLa细胞由第三军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室保存。DCA购自美国Santa公司,CCK-8试剂盒购自DojinDo公司,兔抗人PARP抗体和兔抗人Mcl-1抗体均购自Cell Signaling Technology,Tublin抗体、MG132、放线菌酮(cycloheximide,CHX)、青霉素-链霉素均购自碧云天生物科技公司,Annexin V-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒购自美国BD Biosciences公司,辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG均购自中杉金桥公司,DMEM培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司。

1.2 细胞培养及实验分组

采用DMEM培养基+10%胎牛血清+1%双抗在37 ℃、5% CO2孵箱中进行细胞培养。当细胞密度达培养瓶底面积90%左右时进行传代培养。实验分2组:对照组,DCA组(40 mmol/L DCA)。

1.3 CCK-8法检测细胞增殖

将对数生长期的HeLa细胞消化成单细胞悬液,按5 000/孔接种于96孔板中,于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养过夜后处理细胞,实验组加入40 mmol/L的DCA,对照组加入等体积PBS,每组设3个复孔,24 h后加入CCK-8检测试剂,每孔10 μL,37 ℃避光孵育30 min后使用全波长酶标仪于450 nm处测量每孔的光密度值,计算细胞存活率。

1.4 细胞凋亡检测 1.4.1 流式细胞仪检测细胞凋亡

对数生长期HeLa细胞消化成单细胞悬液后接种于6孔板中,于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养,待细胞贴壁后,用40 mmol/L的DCA进行处理,对照组加入等体积的PBS溶液,20 h后收集2组细胞,离心,用预冷PBS清洗2~3次,重悬,采用Annexin V-FITC、PI进行染色,室温避光染色15 min后,流式细胞仪进行检测,计算机处理分析。

1.4.2 Western blot检测凋亡相关蛋白PARP表达

对数生长期HeLa细胞铺于6孔板中,细胞贴壁后,用40 mmol/L的DCA进行处理,对照组加入等体积的PBS溶液,20 h后收取细胞,提取细胞总蛋白,用BCA法进行蛋白定量后,10%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,兔抗人PARP抗体(1 :1 000稀释)、鼠抗人Tublin抗体(1 :5 000稀释)4 ℃孵育过夜,次日用PBST洗膜3次、每次15 min后,分别用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1 :10 000稀释)、山羊抗鼠IgG二抗(1 :10 000稀释)室温孵育1 h,PBST洗膜后用ECL发光试剂盒进行显影成像。

1.5 Western blot检测Mcl-1蛋白表达

Mcl-1是重要的抗凋亡分子,为探讨DCA促进HeLa细胞凋亡是否与调节Mcl-1的蛋白表达有关,我们采用Western blot方法分析DCA对细胞中Mcl-1蛋白的表达。设置对照组、DCA组,按1.4.2方式处理。为探讨DCA下调Mcl-1蛋白表达的机制,分别加入蛋白翻译抑制剂CHX或蛋白酶体抑制剂MG132,检测DCA对Mcl-1蛋白表达的影响。其中为明确DCA对Mcl-1蛋白表达是否受CHX的影响,设置对照组、DCA组、CHX组、DCA+CHX组,DCA+CHX组先用40 mmol/L DCA进行处理18 h后,加入10 μmol/L CHX处理2 h;为研究DCA对Mcl-1蛋白表达是否受Mg132的影响,设置对照组、DCA组、Mg132组(10 μmol/L)、DCA+Mg132组(40 mmol/L+10 μmol/L),DCA+Mg132组用10 μmol/L Mg132预处理2 h后加入40 mmol/L DCA处理20 h。收集细胞,提取细胞总蛋白,BCA法进行蛋白定量,检测Mcl-1蛋白的表达,12%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,其中兔抗人Mcl-1抗体按1 :1 000稀释后使用,按1.4.2步骤进行Western blot检测。ECL发光试剂盒进行显影成像。

1.6 统计学分析

数据以x±s表示,数据录入及统计分析均采用SPSS 18.0统计软件,2组数据以t-test进行组间比较,多组数据间均数比较采用单因素方差分析。

2 结果 2.1 DCA可抑制HeLa细胞增殖

DCA组[(55.82±3.62)%]的细胞存活率明显低于对照组[(100.00±4.31)%](P<0.01)。

2.2 DCA可促进HeLa细胞凋亡

流式细胞仪检测结果显示:DCA组[(18.74±2.65)%]的细胞凋亡率明显高于对照组[(6.74±2.74)%](P<0.01,图 1A);Western blot检测结果显示:与对照组比较,DCA处理可明显增加剪切型PARP(cleaved PARP)蛋白的表达(图 1B)。上述两个结果均表明DCA可以促进宫颈癌HeLa细胞凋亡。

A:流式细胞仪检测;B:Western blot检测图 1 DCA对HeLa细胞凋亡的影响
2.3 DCA可下调HeLa细胞中Mcl-1蛋白的表达

与对照组比较,DCA处理可显著下调HeLa细胞中Mcl-1蛋白的表达(1.00±0.34 vs 0.36±0.06,P<0.05,图 2)。

图 2 Western blot检测DCA对HeLa细胞中Mcl-1蛋白表达的影响
2.4 DCA对Mcl-1蛋白的下调作用可被蛋白酶体抑制剂所缓解

DCA对Mcl-1蛋白的下调作用不能被CHX所抑制(图 3),但可被MG132所抑制(图 4)。这些结果提示:DCA下调Mcl-1蛋白的水平可能是由于其促进了蛋白酶体活性,进而加速了Mcl-1蛋白降解所致。

1:对照组;2:DCA组;3:CHX组;4:DCA+CHX组 A:Western blot检测;B:半定量分析 a:P<0.05,与对照组比较;b: P<0.05,与CHX组比较图 3 Western blot检测CHX对DCA下调HeLa细胞中 Mcl-1蛋白表达的影响
1:对照组;2::DCA组;3:MG132组;4:DCA+MG132组 A:Western blot检测;B:半定量分析 a:P<0.05,与对照组比较;b: P<0.05,与DCA组比较图 4 Western blot检测MG132对DCA下调HeLa细胞中 Mcl-1蛋白表达的影响
3 讨论

据全世界范围内统计,每年约有529 000例宫颈癌新发病例,其中85%的新发病例出现在发展中国家[11]。我国约占全世界的1/4,严重危害着女性的生命健康安全。尽管宫颈癌的诊断和治疗方法都已得到了极大地提高,但其治疗效果仍不满意。DCA作为一种通过调节代谢而发挥抗肿瘤效应的小分子化合物,其在抗肿瘤方面的作用正在不断地被发掘。在本研究中发现DCA可抑制宫颈癌HeLa细胞增殖、促进其凋亡,这种抗癌作用可能与DCA促进宫颈癌细胞蛋白酶体降解Mcl-1蛋白,进而使Mcl-1蛋白水平下降有关。本研究的发现丰富了宫颈癌的治疗方法,同时也可抵消某些其他抗肿瘤药物在抗肿瘤时,因诱导Mcl-1上调而削弱其自身的抗瘤效应[12],使得DCA可以增敏此类药物的抗癌效应,为肿瘤的临床治疗提供新的策略。

近年研究显示:DCA可以抑制多种肿瘤细胞的生长,包括前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢上皮癌、胶质母细胞瘤、口腔鳞癌等多种肿瘤细胞[2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10];此外还发现DCA可以逆转肿瘤细胞对索拉非尼、5-氟尿嘧啶、顺铂等化疗药物产生的抗药性[13, 14, 15],从而增敏化疗药物的疗效。关于DCA抗肿瘤机制有多个,其中主要的包括:①DCA作为线粒体丙酮酸脱氢酶激酶(pyruvate dehydrogenase kinase,PDK)的抑制剂,导致丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase,PDH)激活,从而促使更多的丙酮酸进入线粒体,抑制糖酵解,减少乳酸堆积,使微环境不利于肿瘤生存;②DCA通过提高肿瘤细胞H2O2水平及pH值而使线粒体膜电位降低,从而增加凋亡蛋白的表达,促进细胞凋亡;③DCA通过调节葡萄糖代谢方式逆转肿瘤细胞对化疗药物产生的耐药性,从而增敏化疗药物的疗效。本研究中,我们发现DCA可通过下调Mcl-1蛋白的水平而促进宫颈癌细胞凋亡,从而丰富了DCA的抗肿瘤机制。

Mcl-1(myeloid cell leukemia-1)是Bcl-2家族的成员之一,其具有重要的抗凋亡功能。近年研究发现,Mcl-1与肿瘤的发生、发展密切相关,而且在包括宫颈癌在内的多种恶性肿瘤中广泛高表达,其已成为肿瘤治疗的一个重要靶标。因此,设法下调肿瘤细胞中Mcl-1的表达水平,无疑有助于提高肿瘤的治疗效果。目前已有关于通过靶向降低Mcl-1的表达水平而增加肿瘤化疗敏感性的报道[16]

关于Mcl-1的表达调控机制复杂多样,特别是有关其降解调控的研究近年来倍受关注。本研究发现DCA处理后可显著下调Mcl-1蛋白的水平,而且这种下调作用可被蛋白酶体抑制剂MG132所抑制,但不能被翻译抑制剂CHX所抑制,提示DCA对Mcl-1蛋白的下调作用可能是通过促进蛋白酶体活性而加速Mcl-1蛋白降解来实现的。在结肠癌细胞的研究中发现DCA通过促进蛋白酶体的降解降低Mcl-1的蛋白表达水平,暗示其可能与蛋白酶体的稳定性有关[7]

本研究丰富了DCA的抗肿瘤机制,为以DCA为基础的抗宫颈癌新策略的研究提供了新的科学依据。但DCA对宫颈癌HeLa细胞中Mcl-1的表达调控的详细机制还有待进一步研究。

参考文献
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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201509135
中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准,
由第三军医大学主管、主办

文章信息

闫晓欢,王 婉,郑英如
Yan Xiaohuan, Wang Wan, Zheng Yingru
二氯乙酸盐通过促进Mcl-1降解诱导宫颈癌细胞凋亡
Dichloroacetate induces apoptosis in cervical cancer cells by degrading myeloid cell leukemia-1
第三军医大学学报, 2016, 38(7): 693-696
J Third Mil Med Univ, 2016, 38(7): 693-696.
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201509135

文章历史

收稿:2015-09-24
修回:2015-12-08

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