宫颈癌是严重威胁女性生命健康的恶性肿瘤,除手术和放疗外,化疗(主要针对晚期及复发的宫颈癌)也是一种重要的治疗措施。目前,以顺铂为基础的联合化疗方案应用最为广泛,但其副作用较大,效果也尚不理想。因此,亟待探索有效且毒副作用小的治疗措施。近年研究表明:肿瘤也是一种代谢异常疾病,通过调节代谢抗肿瘤已成为肿瘤治疗领域中的新研究热点之一[1, 2]。在诸多通过调节代谢而抗肿瘤的药物中,二氯乙酸盐(dichloroacetate,DCA)显示出良好的抗肿瘤前景,其可抑制多种肿瘤细胞的生长,但对正常细胞无影响[2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10]。本研究以HeLa细胞为模型,观察了DCA对宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响,并初步探讨了可能机制,为探索宫颈癌治疗新策略提供实验依据。
1 材料与方法 1.1 细胞及主要试剂人宫颈癌HeLa细胞由第三军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室保存。DCA购自美国Santa公司,CCK-8试剂盒购自DojinDo公司,兔抗人PARP抗体和兔抗人Mcl-1抗体均购自Cell Signaling Technology,Tublin抗体、MG132、放线菌酮(cycloheximide,CHX)、青霉素-链霉素均购自碧云天生物科技公司,Annexin V-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒购自美国BD Biosciences公司,辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG均购自中杉金桥公司,DMEM培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司。
1.2 细胞培养及实验分组采用DMEM培养基+10%胎牛血清+1%双抗在37 ℃、5% CO2孵箱中进行细胞培养。当细胞密度达培养瓶底面积90%左右时进行传代培养。实验分2组:对照组,DCA组(40 mmol/L DCA)。
1.3 CCK-8法检测细胞增殖将对数生长期的HeLa细胞消化成单细胞悬液,按5 000/孔接种于96孔板中,于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养过夜后处理细胞,实验组加入40 mmol/L的DCA,对照组加入等体积PBS,每组设3个复孔,24 h后加入CCK-8检测试剂,每孔10 μL,37 ℃避光孵育30 min后使用全波长酶标仪于450 nm处测量每孔的光密度值,计算细胞存活率。
1.4 细胞凋亡检测 1.4.1 流式细胞仪检测细胞凋亡对数生长期HeLa细胞消化成单细胞悬液后接种于6孔板中,于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养,待细胞贴壁后,用40 mmol/L的DCA进行处理,对照组加入等体积的PBS溶液,20 h后收集2组细胞,离心,用预冷PBS清洗2~3次,重悬,采用Annexin V-FITC、PI进行染色,室温避光染色15 min后,流式细胞仪进行检测,计算机处理分析。
1.4.2 Western blot检测凋亡相关蛋白PARP表达对数生长期HeLa细胞铺于6孔板中,细胞贴壁后,用40 mmol/L的DCA进行处理,对照组加入等体积的PBS溶液,20 h后收取细胞,提取细胞总蛋白,用BCA法进行蛋白定量后,10%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,兔抗人PARP抗体(1 :1 000稀释)、鼠抗人Tublin抗体(1 :5 000稀释)4 ℃孵育过夜,次日用PBST洗膜3次、每次15 min后,分别用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1 :10 000稀释)、山羊抗鼠IgG二抗(1 :10 000稀释)室温孵育1 h,PBST洗膜后用ECL发光试剂盒进行显影成像。
1.5 Western blot检测Mcl-1蛋白表达Mcl-1是重要的抗凋亡分子,为探讨DCA促进HeLa细胞凋亡是否与调节Mcl-1的蛋白表达有关,我们采用Western blot方法分析DCA对细胞中Mcl-1蛋白的表达。设置对照组、DCA组,按1.4.2方式处理。为探讨DCA下调Mcl-1蛋白表达的机制,分别加入蛋白翻译抑制剂CHX或蛋白酶体抑制剂MG132,检测DCA对Mcl-1蛋白表达的影响。其中为明确DCA对Mcl-1蛋白表达是否受CHX的影响,设置对照组、DCA组、CHX组、DCA+CHX组,DCA+CHX组先用40 mmol/L DCA进行处理18 h后,加入10 μmol/L CHX处理2 h;为研究DCA对Mcl-1蛋白表达是否受Mg132的影响,设置对照组、DCA组、Mg132组(10 μmol/L)、DCA+Mg132组(40 mmol/L+10 μmol/L),DCA+Mg132组用10 μmol/L Mg132预处理2 h后加入40 mmol/L DCA处理20 h。收集细胞,提取细胞总蛋白,BCA法进行蛋白定量,检测Mcl-1蛋白的表达,12%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,其中兔抗人Mcl-1抗体按1 :1 000稀释后使用,按1.4.2步骤进行Western blot检测。ECL发光试剂盒进行显影成像。
1.6 统计学分析数据以x±s表示,数据录入及统计分析均采用SPSS 18.0统计软件,2组数据以t-test进行组间比较,多组数据间均数比较采用单因素方差分析。
2 结果 2.1 DCA可抑制HeLa细胞增殖DCA组[(55.82±3.62)%]的细胞存活率明显低于对照组[(100.00±4.31)%](P<0.01)。
2.2 DCA可促进HeLa细胞凋亡流式细胞仪检测结果显示:DCA组[(18.74±2.65)%]的细胞凋亡率明显高于对照组[(6.74±2.74)%](P<0.01,图 1A);Western blot检测结果显示:与对照组比较,DCA处理可明显增加剪切型PARP(cleaved PARP)蛋白的表达(图 1B)。上述两个结果均表明DCA可以促进宫颈癌HeLa细胞凋亡。
2.3 DCA可下调HeLa细胞中Mcl-1蛋白的表达与对照组比较,DCA处理可显著下调HeLa细胞中Mcl-1蛋白的表达(1.00±0.34 vs 0.36±0.06,P<0.05,图 2)。
2.4 DCA对Mcl-1蛋白的下调作用可被蛋白酶体抑制剂所缓解DCA对Mcl-1蛋白的下调作用不能被CHX所抑制(图 3),但可被MG132所抑制(图 4)。这些结果提示:DCA下调Mcl-1蛋白的水平可能是由于其促进了蛋白酶体活性,进而加速了Mcl-1蛋白降解所致。
3 讨论据全世界范围内统计,每年约有529 000例宫颈癌新发病例,其中85%的新发病例出现在发展中国家[11]。我国约占全世界的1/4,严重危害着女性的生命健康安全。尽管宫颈癌的诊断和治疗方法都已得到了极大地提高,但其治疗效果仍不满意。DCA作为一种通过调节代谢而发挥抗肿瘤效应的小分子化合物,其在抗肿瘤方面的作用正在不断地被发掘。在本研究中发现DCA可抑制宫颈癌HeLa细胞增殖、促进其凋亡,这种抗癌作用可能与DCA促进宫颈癌细胞蛋白酶体降解Mcl-1蛋白,进而使Mcl-1蛋白水平下降有关。本研究的发现丰富了宫颈癌的治疗方法,同时也可抵消某些其他抗肿瘤药物在抗肿瘤时,因诱导Mcl-1上调而削弱其自身的抗瘤效应[12],使得DCA可以增敏此类药物的抗癌效应,为肿瘤的临床治疗提供新的策略。
近年研究显示:DCA可以抑制多种肿瘤细胞的生长,包括前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢上皮癌、胶质母细胞瘤、口腔鳞癌等多种肿瘤细胞[2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10];此外还发现DCA可以逆转肿瘤细胞对索拉非尼、5-氟尿嘧啶、顺铂等化疗药物产生的抗药性[13, 14, 15],从而增敏化疗药物的疗效。关于DCA抗肿瘤机制有多个,其中主要的包括:①DCA作为线粒体丙酮酸脱氢酶激酶(pyruvate dehydrogenase kinase,PDK)的抑制剂,导致丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase,PDH)激活,从而促使更多的丙酮酸进入线粒体,抑制糖酵解,减少乳酸堆积,使微环境不利于肿瘤生存;②DCA通过提高肿瘤细胞H2O2水平及pH值而使线粒体膜电位降低,从而增加凋亡蛋白的表达,促进细胞凋亡;③DCA通过调节葡萄糖代谢方式逆转肿瘤细胞对化疗药物产生的耐药性,从而增敏化疗药物的疗效。本研究中,我们发现DCA可通过下调Mcl-1蛋白的水平而促进宫颈癌细胞凋亡,从而丰富了DCA的抗肿瘤机制。
Mcl-1(myeloid cell leukemia-1)是Bcl-2家族的成员之一,其具有重要的抗凋亡功能。近年研究发现,Mcl-1与肿瘤的发生、发展密切相关,而且在包括宫颈癌在内的多种恶性肿瘤中广泛高表达,其已成为肿瘤治疗的一个重要靶标。因此,设法下调肿瘤细胞中Mcl-1的表达水平,无疑有助于提高肿瘤的治疗效果。目前已有关于通过靶向降低Mcl-1的表达水平而增加肿瘤化疗敏感性的报道[16]。
关于Mcl-1的表达调控机制复杂多样,特别是有关其降解调控的研究近年来倍受关注。本研究发现DCA处理后可显著下调Mcl-1蛋白的水平,而且这种下调作用可被蛋白酶体抑制剂MG132所抑制,但不能被翻译抑制剂CHX所抑制,提示DCA对Mcl-1蛋白的下调作用可能是通过促进蛋白酶体活性而加速Mcl-1蛋白降解来实现的。在结肠癌细胞的研究中发现DCA通过促进蛋白酶体的降解降低Mcl-1的蛋白表达水平,暗示其可能与蛋白酶体的稳定性有关[7]。
本研究丰富了DCA的抗肿瘤机制,为以DCA为基础的抗宫颈癌新策略的研究提供了新的科学依据。但DCA对宫颈癌HeLa细胞中Mcl-1的表达调控的详细机制还有待进一步研究。
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