伤血管修复是治疗缺血性心脏病的重要靶点。 EPCs由骨髓干细胞分化而来,是血管内皮细胞的前体细胞,在生理或病理因素刺激下,可从骨髓、脾脏等动员到到外周血,归巢迁移至血管损伤部位,增殖分化为内皮细胞,参与损伤血管的修复,是目前再生医学研究的热点与前沿[1]。目前EPCs治疗缺血性心脏病的难点在于EPCs归巢率低,而EPCs从血管内迁移进入缺血组织是归巢的关键环节[2],缺血性心脏病常伴有的危险因素又使EPCs的增殖、迁移能力受损[3],因此,探讨如何促进EPCs增殖迁移能力有重要意义。
VEGF是一种重要的血管生成因子,有实验证实,VEGF可以促进EPCs增殖、迁移,是血管损伤修复过程中的关键因子[4, 5]。除了已被证实的信号通路,如MAPK通路、AKT通路、Notch通路等 ,是否还有其他分子参与调控仍有待探索。
本研究拟观察VEGF是否可以通过上调Cx43的表达,引起缝隙连接功能增强,从而促进内皮祖细胞的增殖迁移,以探究在EPCs归巢迁移中VEGF是否还有其他途径发挥作用。
1 材料与方法 1.1 主要材料和仪器 1.1.1 材料雄性SD大鼠20只,体质量120~150 g,2月龄(第三军医大学新桥医院实验动物中心),DMEM-L液(HyClone公司),胎牛血清(HyClone公司),淋巴细胞分离液(Sigma公司),胰蛋白酶(Sigma公司),兔抗大鼠CD43抗体(Sigma公司),FITC标记荆豆凝集素Ⅰ( FITC-UEA-I)(Sigma公司),FITC-Sca-1 (Sigma公司),siRNA(Santa Cruz公司),抗Cx43单克隆抗体(Abcam公司),6 羧基二乙酸荧光素(6-CFDA,Sigma公司),6-CFDA溶于二甲亚砜(DMSO)中配成1g/L的储备液,-20 ℃储存,负载时用PBS稀释成10 μg/mL。
1.1.2 仪器荧光倒置显微镜(Olympus),激光共聚焦荧光显微镜(Leica),定量PCR仪(MJ),CO2细胞培养箱(Harris),凝胶成像系统(GE)。
1.2 方法 1.2.1 EPCs的培养参照实验室既往方法[6],密度梯度离心法获得脾脏源性单个核细胞,均匀接种于25 cm2细胞培养瓶,于含5% CO2、37 ℃培养箱中培养。培养4 d后,用PBS液洗去未贴壁的细胞,加入新鲜培养基,培养7 d可用于实验。
1.2.2 EPCs初步鉴定参照实验室既往方法[7],培养7 d的EPCs加入24 μg/mL的Dil-Ac-LDL 37 ℃下孵育过夜,2%多聚甲醛固定10 min,PBS浸洗3次,10 μg/mL FITC-UEA-1滴加于上述标本,37 ℃避光孵育1 h。共聚焦显微镜下鉴定Dil-Ac-LDL(红色)和FITC-UEA-1(绿色)染色双阳性细胞为正在分化的EPCs。
1.2.3 Western blot检测不同浓度VEGF调控EPCs Cx43蛋白的表达挑选长势较好的培养至第7天的EPCs,分3组加入VEGF,使培养液内VEGF浓度分别为0、10、50 ng/mL。在VEGF作用24 h后,吸净培养基,参照实验室既往方法[8],依次进行提取蛋白、制胶上样、电泳后转膜、一抗二抗孵育、显影试验步骤。
1.2.4 Western blot检测Cx43 siRNA转染效果实验分3组:未干扰对照组、空载siRNA组(NS组)和siCx43组。其中未干扰对照组在培养液中加含0.9% NaCl的生理盐水6 μL处理细胞4 h;空载siRNA组在等量培养液中加入与目的基因序列无同源性的siRNA 6 μL处理细胞4 h;Cx43 siRNA组在等量培养液中加入可以抑制Cx43表达的siRNA 6 μL处理细胞4 h;然后3组均换无双抗无血清培养基孵育48 h。通过Western blot检测siRNA的转染效果。
1.2.5 实验分组将EPCs用常规培养基培养至第5天,按以下分组加入试剂:①对照组:santa转染培养基;②VEGF组:VEGF 50 ng/mL加入santa转染培养基孵育24 h;③VEGF+Cx43 siRNA组:6 μL siRNA加入Santa转染培养基孵育4 h后换无双抗无血清培养基孵育48 h,再加50 ng/mL VEGF孵育24 h。
1.2.6 FRAP检测EPCs间缝隙连接功能将原代EPCs接种于共聚焦培养皿,按时换液,5 d后选出长势良好的细胞,按照1.2.5实验分组处理后,PBS液清洗2次,加入10 μg/mL的6-CFDA,37 ℃,5% CO2培养箱中孵育10~15 min,PBS清洗2次,每次5 min。加入少量不含血清的培养基,上机检测。激光共聚焦显微镜使用能量为100%(488 nm处的光强度),漂白脉冲时间为100 ms。计算机精确定位以后,发射激光对指定细胞内的荧光进行淬灭。漂白前用较弱的激光以3 s /张的速度获取图像3帧,漂白时获取图像5帧,漂白后以15 s /张的速度获取扫描图像共12帧。得到相邻细胞及孤立细胞内荧光变化情况的数据。荧光恢复率计算公式为(3 min 时的荧光强度-淬灭时荧光强度)/(淬灭前荧光强度-淬灭时荧光强度)。每组随机选取 6个样本进行FRAP实验,以6个样本的平均值作为该组实验结果。
1.2.7 CCK-8检测EPCs细胞增殖活性EPCs培养至5 d时,无血清培养基消化EPCs,按组加入96孔板中,每孔约1×105个EPCs,按1.2.5实验分组所述处理细胞。每孔换200 μL无血清培养基,加入20 μL CCK-8液37 ℃避光孵育4 h。全自动酶标仪测定490 nm 波长吸光度,分析各组EPCs的增殖活性。
1.2.8 Transwell迁移小室迁移实验检测EPCs迁移能力EPCs培养至第5天,按照1.2.5实验分组所述处理细胞,胰酶消化EPCs后用无血清培养基重悬,取1×105 EPCs加入Transwell小室上层,小室下层加入含10% FBS的培养基。Transwell小室的上下2层均加入VEGF,使终浓度为50 ng/mL。小室置于37 ℃,5% CO2培养箱中培养16 h,取出小室,棉签擦掉上层细胞,多聚甲醛固定小室底部膜上的细胞,结晶紫染色10 min。随机计数每个小室3个视野迁移到小室下层的细胞数,每组选4个小室。
1.3 统计学分析数据处理采用SPSS 19.0软件进行统计学分析,结果以 x±s表示。组间比较采用单因素方差分析。
2 结果 2.1 EPCs的培养和初步鉴定 2.1.1 EPCs的形态学特征倒置显微镜下观察,第1天,可见单个核细胞呈圆形,胞体透亮,遮光性好,散在分布于培养液中(图 1A)。第4天可以细胞增多增大并伸展成椭圆形、短梭形细胞,有少量细胞突起(图 1B)。培养至第7天,长梭形细胞明显增多,并呈簇状生长,有一定方向性(图 1C)。
2.1.2 荧光双染鉴定培养7 d的EPCs,用DiI-Ac-LDL及FITC-UEA-I进行染色,激光共聚焦显微镜观察:红色荧光为DiI-Ac-LDL染色阳性细胞,绿色荧光为FITC-UEA-I染色阳性细胞,染色双阳性细胞(黄色)为正在分化的EPCs(图 2)。双阳性细胞在细胞总数中所占比例为(92±2.23)% (n=5),符合EPCs的特征。
2.2 不同浓度VEGF调控EPCs Cx43蛋白的表达为探究VEGF是否对Cx43的表达有影响,使用不同浓度的VEGF(0、10、50 ng/mL)处理EPCs,Western blot检测Cx43蛋白的表达。实验证实:10、50 ng/mL Cx43表达显著高于0 ng/mL(P<0.05),50 ng/mL Cx43表达显著高于10 ng/mL(P<0.05,图 3)。
2.3 EPCs Cx43 siRNA转染效率验证根据产品说明书,siRNA使用量选择6 μL。按照上述操作步骤处理细胞,提取总蛋白检测Cx43的表达。结果显示:siCx43组Cx43的表达显著低于NS组和对照组(P<0.05,图 4)。
2.4 FRAP检测EPCs缝隙连接功能FRAP实验证实:VEGF组EPCs间缝隙连接功能显著强于对照组(P<0.01),VEGF+siCx43组EPCs间缝隙连接功能显著强于VEGF组(P<0.01),3组相邻细胞间的缝隙连接功能均显著强于独立细胞(P<0.05,图 5)。
2.5 CCK-8检测 EPCs的增殖活性CCK-8检测对照组、VEGF组、VEGF+siCx43组 490 nm的光密度值,分别为(0.38±0.08)、(1.33±0.74)、(0.92±0.11),提示VEGF组对比对照组及VEGF+siCx43组对比VEGF组差异均有统计学意义(P<0.05,n=6),说明VEGF可促进EPCs增殖,抑制Cx43蛋白的表达以后,VEGF的促增殖作用减弱。
2.6 EPCs的迁移功能检测采用Transwell小室迁移实验检测EPCs的迁移功能,如图 6所示,对照组、VEGF组、VEGF+siCx43组迁移到Transwell小室下层的细胞数分别为(84.14±4.58)、(128.22±3.59)、(104.00±3.92),提示VEGF组对比对照组及VEGF+siCx43组对比VEGF组差异均有统计学意义(P<0.05,n=12),说明VEGF可促进EPCs迁移,抑制Cx43蛋白的表达以后,VEGF的促迁移作用减弱。
3 讨论冠状动脉粥样硬化引起的缺血性心脏病是严重威胁人类健康的疾病。EPCs是一类干细胞,存在于骨髓、脾脏等部位,可动员到外周血,迁移到缺血部位,促进血管内膜再内皮化,从而减轻或缓解心肌缺血[1]。目前EPCs治疗缺血性心脏病的难点在于EPCs归巢率低。因此,在EPCs应用于缺血性心脏病的治疗时,提高EPCs的归巢效率可以大大增加治疗效果。
EPCs从血管内迁移进入缺血组织是归巢的关键环节[2],因此可通过促进EPCs的迁移来提高EPCs的归巢。 VEGF是一种重要的血管生成因子,有实验证实,VEGF可以促进EPCs增殖、迁移,是血管损伤修复过程中的关键因子[4, 5]。那么VEGF可以通过什么途径促进EPCs的增殖和迁移呢?
已知缝隙连接细胞间通讯(gap junctional intercelluar communication,GJIC )在维持细胞间信息传递、调节细胞增殖、迁移及分化等过程中起重要作用。缝隙连接通道可非选择性的通过电信号或相对分子质量低于1 000的小分子物质,如环磷腺苷(cAMP)、第二信使钙离子(Ca2+)、三磷酸肌醇(IP3)[9]。缝隙连接通道由缝隙连接蛋白(connexin,Cx)构成,目前共发现的20种Cx中,在人类血管壁中表达的主要有Cx37、Cx40、Cx43和Cx45[10]。其中Cx43与血管损伤性疾病息息相关,是目前研究的热点[11]。进一步研究发现Cx43可介导干细胞间形成紧密的缝隙连接,膜片钳及荧光蓝染色技术证实干细胞间存在荧光物质及Ca2+电流直接交换[12]。且在EPCs[13]中,下调Cx43的表达会损伤细胞的增殖、迁移及血管生成能力。提示Cx43在EPCs增殖、迁移过程中发挥着重要的作用。本研究发现VEGF呈浓度依赖上调EPCs中Cx43蛋白的表达,而Cx43表达的增加促进EPCs间缝隙连接增强,功能性物质交换增加,进而促使EPCs增殖、迁移功能。进一步实验结果显示,当使用siRNA干扰Cx43蛋白的表达,VEGF促进EPCs的增殖、迁移作用显著减弱,提示VEGF可通过Cx43介导的缝隙连接途径增强EPCs的政增殖、迁移能力。
综上所述,VEGF可通过Cx43增强细胞间缝隙连接,并且VEGF通过Cx43介导的缝隙连接促进EPCs增殖、迁移。本实验从细胞实验证实了上述设想,进一步研究要在动物体内观察VEGF过表达后对EPCs增殖、迁移的影响,以及Cx43在其中的作用。研究结果将为防治缺血性心脏病提供新的思路。
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