2. 401147 重庆,重庆医科大学附属口腔医院:正畸科;
3. 401147 重庆,重庆医科大学附属口腔医院:口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室;
4. 401147 重庆,重庆医科大学附属口腔医院:重庆市高校市级口腔生物医学工程重点实验室
2. Department of Orthodontics;
3. Chongqing Key Laboratory of Oral Diseases and Biomedical Sciences;
4. Chongqing Municipal Key Laboratory of Oral Biomedical Engineering of Higher Education, Stomatological Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, 401147, China
随着人们对审美的提高,越来越多有错颌畸形的成年患者开始寻求正畸治疗,但其矫正周期长达1.5~2.5年,让患者及医师倍感烦恼。因而如何缩短成人正畸的矫治时间,加速正畸牙移动已成为近年的研究热点。正畸牙的移动过程实质是其牙周组织的改建过程,其中以牙槽骨改建为主。低强度脉冲超声(low-intensity pulsed ultrasound,LIPUS)是一种非侵入性机械能,可在生物组织内传播并促进细胞因子的表达[1]。近年来,由于LIPUS无创、安全、价廉、使用方便等优点受到广大研究者的关注,大量研究表明LIPUS能有效促进各种骨折的愈合,并已用于临床治疗[2, 3]。由于牙槽骨改建过程与骨折愈合过程相似,Xue等[4]研究表明LIPUS能影响骨形成蛋白-2的表达,从而促进牙槽骨改建,但牙槽骨的改建是一个十分复杂的过程,目前对其潜在机制研究仍有限。有研究表明前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)是调节机械刺激引起的骨改建所必需的因子[5],环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)是分解花生四烯酸合成PGE2的重要限速酶。有体外研究报道显示COX-2的基因为诱导表达型基因,在机械牵拉、静压力、节律性液体流、流体力、LIPUS等机械刺激作用下,成骨细胞内COX-2、PGE2表达可迅速升高,激活多条信号转导通路,调节骨代谢与改建[6]。本研究拟通过构建正畸牙移动动物模型,检测LIPUS对正畸牙移动速度、牙槽骨改建过程中COX-2、PGE2表达的影响,客观评价LIPUS在正畸治疗过程中的效果,探讨LIPUS加快正畸牙移动可能的潜在机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 动物与分组健康清洁级Sprague-Dawley (SD)大鼠,雄性,6~8周龄,体质量(200±20)g,由重庆医科大学实验动物中心提供。本研究采用大鼠上颌左右对照实验,25只实验大鼠分为单纯加力组(对照组,即左上颌)以及LIPUS+加力组(实验组,即右上颌),其各又下设1、3、5、7、14d5个时相点,每个时相点5只大鼠。
1.1.2 主要试剂与设备10%水合氯醛,由重庆医科大学附属儿童医院提供;便携式慢机、尖头金刚砂车针(由重庆医科大学附属口腔医院晶美义齿加工中心 提供),正畸用结扎丝(0.2 mm),镍钛拉簧(0.008 mm× 9 mm,浙江普特医疗器械有限公司),测力计,低强度脉冲超声仪(频率1.5 MHz、强度30 mW/cm2、脉冲宽度200 μs、重复频率1 kHz,重庆医科大学超声影像研究所研制),鼠板(自制),正置荧光显微镜(Olympus BX41,日本),COX-2、PGE2一抗(Abcam生物实验材料有限公司),兔二抗(中杉生物实验材料有限公司),DAB显色试剂盒(碧云天生物实验材料有限公司)。
1.2 方法 1.2.1 动物模型的建立大鼠行10%水合氯醛(3~5 mL/kg)腹腔注射全麻,待其进入平稳麻醉状态后,将其固定于鼠板上,用便携式慢机和尖头金刚砂针在大鼠上颌双侧切牙的远中轴角、唇面、舌面以及第一磨牙近中面与轴角平齐龈缘处分别磨出约0.2 mm浅凹。镍钛拉簧均在口外进行长度测量及力量校对后备用,拉伸后长度一致,并在口内再次进行力值测量,保证其准确性。用0.2 mm结扎丝将拉簧固定于第一磨牙及同侧切牙已磨好的沟内,两侧同时加力50 g,以切牙为支抗拉第一磨牙向近中移动。左侧为对照组,右侧为实验组。
1.2.2 超声的刺激实验鼠于加力后第2天开始LIPUS刺激,LIPUS参数为频率1.5 MHz、强度30 mW/cm2、 脉冲宽度200 μs、重复频率1 kHz,恒定不变,LIPUS工作头涂抹耦合剂,将其紧贴右侧第一磨牙腭侧对应粘膜,保持探头稳定,每次20 min,每天1次。左侧以同样的方式行不开功率的假刺激。
1.2.3 标本的制取分别于超声刺激后1、3、5、7、14 d分批处死实验大鼠,每组5只,快速取下双侧上颌第一磨牙至第三磨牙及周围牙槽骨完整标本后立即放入4%多聚甲醛中固定24 h,流水冲净,测量实验牙移动距离后放入10% EDTA溶液中于4 ℃冰箱里常规脱钙,每2天换1次EDTA溶液,直到大头针能无阻力穿过标本,共45~50 d,修整标本余下第一磨牙及周围牙槽骨,常规脱水、包埋。
1.2.4 体式显微镜测量牙齿移动距离将取下的实验标本在4%多聚甲醛溶液中固定24 h后,流水冲净,修整标本。将标本平放于显微镜观测台上,使其颌平面与地面平行,选取15倍的放大率,使用数字摄像机采集图像。观察采集的图像,分别标出第一磨牙远中边缘嵴中点和第二磨牙近中边缘嵴中点,使用显微镜图像测量软件测量两点之间的距离。测量由2名操作者各测量3次,取平均值。
1.2.5 免疫组织化学染色及观察沿磨牙长轴行近远中向连续切片,每张厚度5 μm,行常规免疫组织化学染色。取染色后的切片用正置荧光显微镜进行观察和采集图像,并以细胞质内分布有棕黄色者确定染色阳性,然后从每张切片的染色阳性区域各随机选取3个400倍视野用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件对切片进行定位定性分析,检测各组标本的平均光密度值(MOD),并将各实验组的结果分别与PBS代替一抗的空白对照进行对比观察。
1.3 统计学分析实验数据以x±s表示,使用SPSS 22.0统计软件对实验数据进行独立样本t检验。
2 结果 2.1 正畸牙的移动距离随着实验时间的增加,实验鼠牙齿向近中移动量逐渐增加。同一时间点,实验组牙齿移动量均大于对照组,第1、3天2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。第5、7、14天实验组与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.01,图 1)。
2.2 LIPUS刺激对COX-2、PGE2表达的影响免疫组织化学染色结果显示,平均光密度值越大,表明其染色越深。如图 2、3所示,LIPUS刺激后第1、3、5、7天,COX-2、PGE2表达逐渐增强,到第7天达到高峰,第14天COX-2、PGE2表达明显降低。COX-2第1天压力侧、张力侧和第14天压力侧,实验组与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05);第3、5天压力侧、张力侧和第7、14天张力侧,实验组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);第7天压力侧,实验组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01,表 1)。PGE2第1、14天压力侧、张力侧和第3天张力侧,实验组与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05);第3、5天压力侧和第7天压力侧、张力侧,实验组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);第5天张力侧,实验组与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.01) (表 2)。同一组里同一时间点,压力侧COX-2、PGE2 的表达几乎均高于张力侧,但差异无统计学意义(P>0.05)。
时间 | 压力侧 | 张力侧 | ||
实验组 | 对照组 | 实验组 | 对照组 | |
1 d | 0.025 7±0.002 6 | 0.021 1±0.003 8 | 0.022 8±0.001 8 | 0.020 9±0.002 0 |
3 d | 0.044 5±0.003 5a | 0.039 6±0.001 8 | 0.042 0±0.002 4a | 0.038 1±0.001 2 |
5 d | 0.075 1±0.003 8a | 0.068 1±0.003 2 | 0.070 8±0.002 8a | 0.065 7±0.002 9 |
7 d | 0.093 3±0.003 5b | 0.086 5±0.002 8 | 0.085 4±0.003 4a | 0.081 0±0.002 1 |
14 d | 0.042 2±0.002 6 | 0.039 0±0.002 7 | 0.041 1±0.003 0a | 0.036 0±0.002 7 |
a:P<0.05,b:P<0.01,与对照组比较 |
时间 | 压力侧 | 张力侧 | ||
实验组 | 对照组 | 实验组 | 对照组 | |
1 d | 0.034 9±0.004 0 | 0.032 1±0.004 7 | 0.032 2±0.004 1 | 0.028 2±0.002 9 |
3 d | 0.074 7±0.004 3a | 0.067 6±0.002 9 | 0.070 0±0.002 9 | 0.065 4±0.004 1 |
5 d | 0.093 8±0.002 6a | 0.088 8±0.002 6 | 0.090 7±0.002 8b | 0.085 3±0.001 8 |
7 d | 0.132 8±0.009 6a | 0.112 8±0.009 8 | 0.125 7±0.004 5a | 0.117 5±0.004 1 |
14 d | 0.061 5±0.002 4 | 0.058 9±0.003 2 | 0.058 8±0.003 1 | 0.057 6±0.003 7 |
a:P<0.05,b:P<0.01,与对照组比较 |
错颌畸形被世界卫生组织确定为三大口腔疾病之一,严重危害患者的心理以及功能健康[7]。随着社会经济的发展,有错颌畸形的成年患者越来越关注审美,想通过正畸治疗得到协调的面部美观。成年患者用传统的矫治方法,牙齿移动速度一般为1 mm/月,治疗时间2年左右,周期过长大大增加患者牙根吸收、患牙周病以及龋病的风险[8]。所以如何安全、有效地加速正畸牙的移动、缩短疗程,一直是国内外研究的热点。正畸牙的移动过程实质是其牙周组织的改建过程,其中以牙槽骨改建为主。当正畸力作用于牙齿时,牙周组织中的成骨细胞与破骨细胞在多种细胞因子和信号通路的调节下进行牙槽骨改建[9],其中压力侧出现牙槽骨吸收,张力侧出现牙槽骨再生,从而实现牙齿移位。因此,为加速牙齿移动,缩短正畸治疗周期,寻找一种安全、有效的方法来加速牙槽骨改建显得尤为重要。目前已有大量学者研究报道了加速牙槽骨改建的方法如基因疗法、骨皮质切开[10]、低强度激光[11]以及LIPUS[4]等。以上方法中,LIPUS由于其无创、安全、价廉、使用方便且在正畸治疗过程中促进正畸牙牙根吸收的修复[12]等优点受到口腔医学界广大学者关注,但对其加快正畸牙移动的潜在机制研究甚少。
超声波与声波一样,是物质介质中的一种弹性机械波,可在生物组织内传导,引起局部微环境应力改变,导致机体产生细胞水平的生物学反应[1]。LIPUS的生物学效应包括热效应和非热效应,研究表明LIPUS强度在1~50 mW/cm2范围内产热微弱,不会引起组织损伤或变性,但其作为一种机械刺激可影响细胞因子的表达,从而促进组织伤口愈合和骨改建[13]。
COX-2是分解花生四烯酸合成PGE2的重要限速酶,主要包括两种同工酶形式即保守型COX(COX-1)和诱导型COX(COX-2),其中COX-2在大多数组织中不表达或低表达,但在组织炎症条件下表达明显增加。以往认为COX-2与肿瘤、炎症等有密切关系,但近年研究发现其在骨骼重建、骨质吸收以及成骨细胞力学信号转导中发挥着重要作用[14]。在体内前列腺素可诱导骨的形成,并且是调节机械刺激引起的骨改建所必需的因子,特别是PGE2是成骨细胞产生的信使分子,在骨折部位被大量合成[5]。研究表明COX-2基因为诱导表达型基因,在机械刺激作用下,成骨细胞内COX-2、PGE2的表达可迅速升高,调节骨代谢与改建[6]。Tang等[15]报道了超声(30 mW/cm2)作用于小鼠成骨细胞株MC3T3-E1对COX-2、PGE2表达的影响,超声作用于细胞20 min后COX-2、PGE2表达增加,表明短暂的超声刺激促进了COX-2和PGE2的表达。
基于国内外大量学者的研究成果提示LIPUS对骨折愈合以及LIPUS对COX-2、PGE2在成骨、骨质吸收等方面表达有影响[13, 14, 15]。本研究推测LIPUS能通过影响COX-2和PGE2的表达促进牙槽骨改建,进而加速正畸牙移动。本研究用LIPUS刺激大鼠正畸加力模型,通过测量实验牙的移动距离、观察免疫组织化学染色结果比较牙槽骨改建的快慢。整个实验过程中,实验鼠自由摄食水,精神状态佳。每天用LIPUS 刺激实验组正畸牙并检查或重置加力装置,避免了因加力装置移位或脱落引起的实验误差。
本研究采用体式显微镜测量实验牙移动距离,较游标卡尺测量法误差减小[16]。实验数据显示:随着实验时间的增加,2组牙齿移动距离均逐渐增加。LIPUS刺激的实验组牙移动距离均大于对照组,但第1、3天2组差异无统计学意义,第5、7、14天差异具有统计学意义,实验结果与Xue等[4]研究结果一致,本研究结果提示LIPUS能有效促进正畸牙的移动。
COX-2和PGE2免疫组织化学染色结果显示,随着实验时间的增加,COX-2和PGE2的表达先是逐渐增加,第7天达到高峰,随后下降。实验组COX-2和PGE2的表达均高于对照组,与对照组相比,实验组COX-2第3、5、7天压力侧、张力侧和第14天张力侧,PGE2第3天压力侧和第5、7天压力侧、张力侧,差异均有统计学意义。结果提示,在本研究中LIPUS促进了正畸牙移动过程中牙槽骨改建中的COX-2与PGE2的表达。有研究结果提示COX-2和PGE2在骨的新陈代谢中具有双向调节功能,低剂量的PGE2以刺激成骨细胞增殖、促进骨生成为主;高剂量的PGE2则能够提高成骨细胞内的cAMP水平,使其向破骨细胞转化,从而刺激骨吸收[17]。本研究实验组或对照组内,压力侧COX-2和PGE2的表达高于张力侧,但是差异没有统计学意义。压力侧和张力侧的COX-2、PGE2的表达和其功能的关系与其他学者研究结果相似,可能是因为牙槽骨改建是一个十分复杂的过程,压力侧、张力侧各有其他细胞因子协调COX-2、PGE2发挥不同的功能;其差异没有统计学意义,可能是由于本研究样本量较少,有必要增加样本量进一步验证。
在正畸治疗过程中,牙齿移动与牙槽骨改建相伴而行,因而在动物实验和临床观察中,往往通过正畸牙移动的速度来反映牙槽骨改建的快慢,本研究中实验组牙齿移动速度快于对照组,提示LIPUS可促进牙槽骨改建。牙周组织在受到正畸力刺激下的改建是一个非常复杂的过程,通过多种因子和信号通路的相互调节实现的。COX-2、PGE2为重要的骨改建调节因子,本研究结果显示LIPUS增加了正畸牙移动过程中COX-2、PGE2的表达。
综上所述,LIPUS在用于正畸治疗过程中时,可能通过影响牙周膜中COX-2、PGE2的表达加快正畸牙移动,本研究为阐明LIPUS加速正畸牙移动的潜在机制提供了一定的实验依据。LIPUS刺激是一种无创、安全、价廉且使用方便的治疗方式,具有较大的临床推广价值,同时本研究为LIPUS今后应用于临床正畸治疗提供了一定的理论依据。但牙槽骨改建是个十分复杂的过程,为了全面阐明LIPUS促进牙槽骨改建的潜在机制,尚还需大量实验进一步研究。
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