小细胞肺癌(small-cell lung cancer,SCLC)的发病率在所有肺癌类型中约占15%[1]，是一种恶性程度极高的神经内分泌型肺肿瘤。尽管已进行广泛的基础和临床研究，近30年来SCLC的治疗并未取得突破性进展[2]。虽然SCLC对放疗和化疗敏感性较高，但因SCLC细胞具有很强的增殖和转移活性[2]，难以早期诊断和治疗，多数患者就诊之初即丧失手术适应证，5年生存率不足5%[3]。传统放疗、化疗并不能得到理想的疗效，而且毒副作用较强，因而在小细胞肺癌的综合治疗中开发新型药物很有意义。
吴茱萸碱(evodiamine,EVO)是传统中药吴茱萸果实提取物中的主要成分，可有效抑制多种恶性肿瘤细胞生长，而对正常细胞无明显毒性[4]，这提示EVO在多种恶性肿瘤的治疗中具有潜在的应用价值，已成为近年来的研究热点。本课题组前期研究发现，以EVO处理SCLC H1688和H446细胞，可引起细胞周期G2/M期阻滞，并经线粒体和内质网途径诱导细胞凋亡[5]。然而EVO诱导SCLC凋亡的具体分子机制尚未完全阐明，需要进一步研究。
磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路参与增殖、凋亡、迁移等重要细胞活动的调节，其失调与多种恶性肿瘤的发生、发展及化疗耐药密切相关，已成为颇具研究价值的治疗靶点[6, 7, 8]。PI3K/AKT通路在SCLC的发生过程中起重要作用[9]，对该通路的抑制可有效影响SCLC细胞的存活、增殖及肿瘤生长[10]。此外SCLC中PI3K/AKT通路的异常及其相关基因突变在亚洲人群中具有可识别的特征，这可被视为该人群重要的治疗优势[11]。有研究表明EVO对黑色素瘤、胰腺癌发挥抗肿瘤作用，通过抑制PI3K/AKT通路诱导凋亡是其中重要的机制之一[12, 13]。EVO作用于SCLC细胞是否抑制了PI3K/AKT通路活性，以及PI3K/AKT通路的抑制是否进而诱导细胞凋亡尚不明确。因此，本研究以SCLC H1688和H446细胞为对象，验证PI3K/AKT通路在EVO诱导细胞凋亡中的作用。
1 材料与方法 1.1 细胞株、主要药物和试剂人小细胞肺癌细胞株NCI-H1688和NCI-H446分别购自中国医学科学院细胞库和中国科学院上海细胞库。吴茱萸碱(EVO)购自武汉远程科技发展有限公司，纯度99.13%。胰岛素样生长因子1 (IGF-1)购自北京博奥森生物技术有限公司。LY294002购自美国Selleck公司。胰蛋白酶、RPMI1640培养基、胎牛血清(FBS)购自赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司。一抗p-AKT(S308)购自美国Cell signal technology公司，一抗β-actin购自Thermo Fisher Scientific公司，一抗Bcl-2、Bax、Caspase-3、t-AKT和二抗辣根过氧化物酶山羊抗兔IgG购自北京博奥森生物技术有限公司。第10号染色体缺失的磷脂酶和张力蛋白类似物(PTEN)购自美国Bioworld Technology公司，Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物科技研究所。
1.2 方法 1.2.1 药物配制参照预实验情况及前期研究[5]结果,将EVO溶解于二甲基亚砜(DMSO)制成终浓度为40 mmol/L的储存液，-20 ℃避光分装保存备用，实验前以RPMI1640培养基稀释至所需浓度，DMSO终浓度小于0.025%。
1.2.2 细胞培养RPMI1640培养基加入10% FBS以及100 IU/mL青霉素、100 mg/mL链霉素，于含5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱中37 ℃恒温培养，选取处于对数生长期的H1688和H446细胞进行实验。
1.2.3 Western blot检测EVO作用H1688和H446细胞后p-AKT蛋白的表达将H1688和H446细胞以5×105/孔接种于6孔板内培养24 h，实验组加入不同浓度 (1、5、20 μmol/L)的EVO作用24 h或加入5 μmol/L 的EVO作用不同时间(3、6、12、24、48 h)，对照组加入与实验组等量的溶媒DMSO培养相应时间，收集细胞并加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，于冰上裂解细胞后离心取上清液提取总蛋白。测定各组蛋白浓度并调至一致，加入上样缓冲液后于SDS-PAGE凝胶中进行电泳分离，以半干法转移到PVDF膜上。5%脱脂牛奶封闭1 h，加入一抗p-AKT(1∶2 000)，β-actin(1∶2 000)，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜后加入二抗并室温孵育1 h，TBST再次洗膜后加入显影液，通过ChemiDoc XRS化学发光成像系统 (美国Bio-Rad公司)检测。使用Image J软件对图像进行灰度分析，计算目的蛋白与β-actin灰度比，进而得出各实验组蛋白与对照组的相对表达量。
1.2.4 Western blot检测EVO作用于IGF-1或LY294002预处理的H1688、H446细胞后p-AKT蛋白和凋亡相关蛋白的表达将H1688和H446细胞以5×105/孔接种于6孔板内培养24 h，将5 μmol/L 的 EVO(对照为相应量溶媒DMSO)分别加入到100 ng/mL 的IGF-1(对照相应量溶媒PBS)或10 μmol/L 的LY294002(对照为相应量DMSO)预处理的细胞中，分组情况为：对照组、EVO组、IGF-1(或LY29400)组、EVO + IGF-1(或LY294002)组，继续培养24 h后收集细胞提取总蛋白。参照1.2.3方法通过Western blot检测p-AKT蛋白。选取H1688细胞，参照上述方法处理，分为对照组、EVO组、IGF-1组、EVO+IGF-1组，提取蛋白后经Western blot检测凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax、Caspase-3)，使用Image J软件对图像进行灰度分析，并计算相对表达量。
1.2.5 流式细胞术检测EVO作用于IGF-1预处理的H1688细胞后细胞凋亡率参照1.2.4方法分组处理H1688细胞，分组情况为：对照组、EVO组、IGF-1组、EVO+IGF-1组，消化收集各组细胞后离心弃上清，以PBS缓冲液洗涤3次，并用Annexin V-FITC结合液重悬细胞，按试剂盒说明书先后加入Annexin V-FITC和PI室温避光孵育10 min，随即使用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。
1.2.6 RT-PCR和Western blot检测EVO作用于H1688细胞后t-AKT mRNA和蛋白水平的表达以及PTEN蛋白水平改变将H1688细胞以5×105/孔接种于6孔板内培养24 h，实验组加入不同浓度(1、5、20 μmol/L)的EVO作用24 h，对照组加入与实验组等量的溶媒DMSO培养相应时间。以试剂盒提取各组细胞总RNA，按反转录试剂盒说明书合成cDNA，以cDNA为模板进行t-AKT的PCR扩增，PCR反应的循环条件为94 ℃ 3 min进入循环；94 ℃ 30 s，40 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环；72 ℃ 5 min。扩增产物于琼脂糖凝胶中进行电泳，通过ChemiDoc XRS化学发光成像系统 (美国Bio-Rad公司)检测。根据NCBI数据库中基因序列设计引物，AKT正义链：5′-GCC-CACACGCTTACTGAGA-3′，反义链：5′-AGCCCG AAGT-CCGTTATCTT-3′，PCR反应产物308 bp。β-actin 正义链：5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′，反义链：5′-GCT-GTCACCTTCACCGTTCC-3′，PCR反应产物268 bp。参照1.2.3方法通过Western blot检测t-AKT蛋白表达水平。使用Image J软件对图像进行灰度分析，并计算相对表达量。
1.3 统计学分析实验均重复3次，数据以x±s表示，采用SPSS 13.0统计软件进行分析，多组间均数的比较采用方差分析，两组间均数比较采用t检验。
2 结果 2.1 在EVO作用下SCLC细胞中p-AKT蛋白的表达水平下降以1、5、20 μmol/L的EVO作用于H1688和H446细胞24 h后，检测各组细胞中p-AKT蛋白的相对表达量，相比于对照组均有下降，各组间差异有统计学意义(P<0.05，图 1)，并且呈浓度-效应依赖性。以5 μmol/L的EVO作用于H1688 和H446细胞3、6、12、24、48 h后，p-AKT蛋白相对表达量与对照组相比均有不同程度下降，各组间差异有统计学意义(P<0.05，图 2)，且表现出时间-效应依赖性。
 |
| A：Western blot检测p-AKT蛋白的表达；B：p-AKT蛋白相对表达量；1：对照(DMSO)组；2：1 μmol/L EVO组；3：5 μmol/L EVO组；4：20 μmol/L EVO组；a：P<0.05，b：P<0.01，与对照组比较 图 1 Western blot检测不同浓度EVO作用SCLC细胞24 h后p-AKT蛋白的表达 |
 |
| A：Western blot检测p-AKT蛋白的表达；B：p-AKT蛋白相对表达量；1：对照(DMSO)组；2：EVO作用3 h组；3：EVO作用6 h组；4：EVO作用12 h组；5：EVO作用24 h组；6：EVO作用48 h组；a：P<0.05，b：P<0.01，与对照组比较 图 2 Western blot 检测5 μmol/L EVO作用SCLC细胞不同时间后p-AKT蛋白的表达 |
以EVO (5 μmol/L)和 IGF-1 (100 ng/mL)作为干预因素分组处理H1688和H446细胞24 h后，各组间p-AKT 的表达差异具统计学意义(P<0.05)。EVO+ IGF-1组与EVO组相比，H1688和H446细胞中p-AKT蛋白的相对表达量均有显著上升(P<0.05)，见图 3。这提示EVO下调SCLC细胞中p-AKT表达的作用机制可能与抑制PI3K/AKT通路有关。
 |
| A：Western blot检测p-AKT蛋白的表达；B：p-AKT蛋白相对表达量；1：对照(溶媒)组；2：IGF-1(100 ng/mL)组；3：EVO(5 μmol/L)组；4：IGF-1 (100 ng/mL) + EVO (5 μmol/L)组；a：P<0.05，b：P<0.01，与EVO(5 μmol/L)组比较 图 3 Western blot检测EVO作用于IGF-1预处理的SCLC细胞24 h后p-AKT蛋白的表达 |
将PI3K特异性抑制剂LY294002(10 μmol/L)和EVO(5 μmol/L)单独并联合作用于H1688和H446细胞，各组间p-AKT的表达差异有统计学意义(P<0.05)。EVO组和LY294002组的H1688和H446细胞中p-AKT的相对表达量与对照组相比均有显著下降，差异具统计学意义(P<0.05)，而EVO组与LY294002组之间差异无统计学意义。在H1688细胞中，EVO＋LY294002组p-AKT的相对表达量与EVO组、LY294002组相比无明显降低，而在H446细胞中，EVO＋LY294002组p-AKT的相对表达量与EVO组、LY294002组相比有显著下降(P<0.05)。见图 4。说明EVO对SCLC细胞PI3K/AKT通路的抑制强度与PI3K特异性抑制剂LY294002相近，两者在H446细胞中表现出协同作用，而H1688细胞中无明显的协同作用。
 |
| A：Western blot检测p-AKT蛋白的表达；B：p-AKT蛋白相对表达量；1：对照(溶媒)组；2：LY294002(10 μmol/L)组；3：EVO(5 μmol/L)组；4：LY294002(10 μmol/L) + EVO(5 μmol/L)组；a：P<0.05，b：P<0.01，与对照组比较 图 4 Western blot检测EVO和LY294002作用于SCLC细胞24 h后p-AKT蛋白的表达 |
在5 μmol/L EVO作用下，H1688和H446细胞伪足回缩，部分变圆、漂浮，存活率明显下降，而IGF-1的加入可以减弱EVO的作用，使细胞存活率回升。见图 5。此外EVO可显著提高H1688细胞的凋亡率，抑制Bcl-2蛋白的表达，并促进Bax蛋白的表达以及Caspase-3蛋白的活化。而EVO (5 μmol/L) 加入到IGF-1 (100 ng/mL) 预处理的H1688细胞中作用24 h，与EVO单独作用的细胞相比，可发现细胞凋亡率显著下降(P<0.05)、Bcl-2蛋白的相对表达量增加(P<0.05)，Bax蛋白的相对 表达量下降 (P<0.01)，Bax/Bcl-2比值上升 (P<0.01)，活化Caspase-3蛋白的相对表达量下降 (P<0.01)。见图 6。
 |
| A：细胞形态学观察(光学显微镜×40)；B：MTT法检测细胞存活率 1：对照(溶媒)组；2：EVO(5 μmol/L)组；3：IGF-1 (100 ng/mL) +EVO (5 μmol/L)组 图 5 EVO作用于IGF-1预处理的SCLC细胞24 h后的细胞活性 |
 |
| 1：对照(溶媒)组；2：IGF-1(100 ng/mL)组；3：EVO(5 μmol/L)组；4： IGF-1 (100 ng/mL) + EVO (5 μmol/L)组 A：流式细胞术Annexin V-FITC/PI染色检测H1688细胞凋亡率；B：Western blot检测凋亡相关蛋白的表达；C：凋亡相关蛋白相对表达量 a：P<0.05，b：P<0.01，与EVO(5 μmol/L) 组比较 图 6 EVO作用于IGF-1预处理的SCLC细胞24 h后细胞凋亡率及凋亡相关蛋白的改变 |
以1、5、20 μmol/L的EVO作用于H1688细胞24 h后，与对照组相比，t-AKT的表达量在mRNA和蛋白的表达水平均无明显变化。见图 7。
 |
| M：DL2000 DNA Marker; 1：对照(溶媒DMSO)组；2：1 μmol/L EVO组；3：5 mol/L EVO组；4：20 μmol/L EVO组 A：RT-PCR检测AKT mRNA的表达；B：Western blot检测t-AKT蛋白的表达；C：AKT mRNA和t-AKT蛋白相对表达量 图 7 RT-PCR和Western blot检测不同浓度EVO作用H1688细胞24 h后t-AKT mRNA和蛋白的表达水平 |
以1、5、20 μmol/L的EVO作用于H1688细胞24 h后，检测PTEN蛋白的相对表达量，结果显示5 μmol/L和20 μmol/L的EVO组与对照组相比明显增加(P<0.05)，并表现出剂量-效应依赖性。见图 8。
 |
| 1：对照(溶媒DMSO)组；2：1 μmol/L EVO组；3：5 mol/L EVO组；4：20 μmol/L EVO组；A：Western blot检测PTEN蛋白的表达；B：PTEN蛋白相对表达量；a：P<0.05，b：P<0.01，与对照组比较 图 8 Western blot检测不同浓度EVO作用H1688细胞24 h后PTEN蛋白的表达 |
PI3K/AKT信号通路的异常激活在恶性肿瘤中广泛存在，是重要的肿瘤细胞存活途径[14]。在该信号转导通路中AKT蛋白处于中心位置，经磷酸化激活形成p-AKT后可进一步磷酸化多种下游蛋白，进而调控肿瘤细胞的存活、增殖和凋亡等[15]。AKT蛋白的磷酸化水平(即p-AKT蛋白水平)可以反映PI3K/AKT通路的激活情况。本研究发现EVO作用于H1688和H446细胞后p-AKT蛋白水平显著降低，且表现出剂量依赖性和时间依赖性。有研究[12, 13]显示EVO通过抑制PI3K/AKT通路在黑色素瘤细胞和胰腺癌细胞中诱导凋亡。这提示PI3K/AKT通路可能是EVO诱导SCLC细胞凋亡的重要途径之一。
有研究[16]证实PI3K/AKT通路激活剂IGF-1具有体外激活PI3K/AKT通路的作用，促进AKT蛋白磷酸化进而调控下游效应分子的活性。为进一步探究EVO引起的p-AKT蛋白下调是否通过PI3K/AKT通路介导，使用IGF-1进行验证。结果显示IGF-1可以明显减弱EVO诱导的SCLC H1688和H446细胞p-AKT 蛋白下调，提示EVO下调p-AKT蛋白的作用与抑制PI3K/AKT通路有关。LY294002作为一种PI3K高特异性抑制剂，具有抑制PI3K/AKT通路活性的作用[17]。为考查EVO抑制PI3K/AKT通路的作用强度，将LY294002和(或)EVO加入到SCLC细胞中检测p-AKT蛋白水平，结果表明EVO抑制PI3K/AKT通路的作用效果接近于高效抑制剂LY294002，而且在H446细胞中二者表现出明显的协同效应。然而尽管EVO在H1688细胞中的抑制作用更明显，但与LY294002的协同作用并不显著，这一现象的原因尚需进一步研究。
本课题组前期研究[5]结果表明EVO可显著抑制SCLC H1688和H446细胞活性，上调Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12等凋亡相关蛋白，促进Bax并抑制Bcl-2 mRNA的表达，进而诱导凋亡。为进一步证实EVO抑制PI3K/AKT通路与其诱导凋亡之间的关系，选择EVO抑制PI3K/AKT通路作用更明显的H1688细胞为研究对象，以EVO作用于IGF-1预处理的H1688细胞。结果显示与EVO单独作用相比，IGF-1 加入可明显降低细胞凋亡率、凋亡执行因子Caspase-3的表达，而反映凋亡抑制情况的Bcl-2/Bax比明显升高。提示IGF-1可明显减弱EVO诱导SCLC细胞凋亡的作用，表明PI3K/AKT通路在EVO诱导SCLC细胞凋亡中发挥重要作用。此外，IGF-1处理组与对照组相比，H1688细胞中p-AKT的表达仅有小幅度的上调，这与IGF-1逆转EVO作用时表现出的显著效果并不相符。可能的原因是：H1688细胞本身已存在PI3K/AKT通路的异常激活，已经有很高的p-AKT表达水平，有研究[18]发现SCLC细胞中IGF-1的分泌及其与IGF-1R的结合水平很高，因而在此基础上施加外源性IGF-1，对本已处于高位的p-AKT水平的上调幅度有限。
为进一步探究EVO抑制PI3K/AKT通路的机制，将不同浓度的EVO作用于H1688细胞，检测t-AKT蛋白以及AKT mRNA的表达水平，结果表明EVO对t-AKT 蛋白及AKT mRNA的表达无明显影响。提示EVO下调p-AKT是通过抑制AKT的磷酸化，而非抑制AKT的表达实现的。PTEN是一种通过PI3K/AKT通路起作用的肿瘤抑制基因。PTEN蛋白可促进磷脂酰肌醇-1,4,5-三磷酸(PIP3)转化为磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2)，进而抑制AKT蛋白的磷酸化，发挥负性调控PI3K/AKT通路活性的作用[19]。本研究发现不同浓度的EVO作用于H1688细胞后，PTEN蛋白的表达水平发生剂量依赖性升高。这表明通过上调PTEN蛋白表达间接抑制PI3K/AKT通路是EVO诱导H1688细胞凋亡的可能机制之一，该作用机制有待进一步研究验证。此外，有研究[20]证明PTEN基因异常是SCLC进展的重要驱动因素，在啮齿类动物模型中PTEN异常可通过肿瘤抑制基因Rb和P53的缺失加速SCLC的进展，而且这一独特效应未见于其它类型肿瘤。这表明EVO上调PTEN的作用在SCLC治疗中具有潜在应用优势。在我们前期研究[5]也发现相比于NSCLC细胞(H460和A549)EVO对SCLC细胞(H1688和H446)的活性抑制更明显，该现象可以通过EVO上调PTEN表达的作用得以部分解释。
非小细胞肺癌的靶向治疗已获得成功应用，酪氨酸激酶抑制剂可有效改善上皮生长因子受体突变型患者的预后[21]。然而有临床意义的SCLC药物治疗基因靶点尚未被发现，以PI3K/AKT/mTOR通路为目标的靶向治疗药物被寄予厚望[11]。但是PI3K/AKT通路同时参与正常细胞功能，单一靶点的靶向治疗即便有效也可能带来广泛的副作用。EVO虽然通过下调PI3K/AKT通路活性有效抑制SCLC H1688和H446细胞生长，但对人胚肺成纤维细胞WI38并未表现出明显细胞毒性[4]，这表明EVO具有副作用小的应用优势。此外PI3K/AKT通路异常激活与化疗耐药及放疗抵抗有密切关系[22, 23]，已有研究[24, 25, 26]证实EVO可有效逆转包括肺癌在内的多种肿瘤细胞耐药，这为SCLC综合治疗中EVO与化疗、放疗联合应用提供了理论基础。
综上所述，本研究结果显示EVO能够有效抑制SCLC H1688和H446细胞PI3K/AKT信号转导通路的活性，降低p-AKT蛋白的水平，进而调控下游凋亡相关蛋白的表达，诱导SCLC细胞凋亡，而上调SCLC细胞中PTEN的表达可能是EVO抑制PI3K/AKT通路的重要机制之一。进一步阐明了EVO诱导SCLC细胞凋亡的机制，表明相比于NSCLC等其它肿瘤，在SCLC中EVO具有潜在的应用优势，有望成为SCLC综合治疗中有效的辅助用药。很多关于EVO抗肿瘤活性及机制的研究已见诸多报道[4, 5, 12, 13, 24, 25, 26]，与以往研究不同的是，本研究将着重于EVO诱导SCLC细胞凋亡的机制，在干预措施上设定了不同的药物剂量和作用时间，并通过使用PI3K/AKT通路激动剂和抑制剂进行验证，同时检测了该通路的上游调控因子和下游效应蛋白的变化。然而，EVO在体内实验中对SCLC的作用机制是否与体外实验一致，体内实验中药物的安全性，以及EVO作用下SCLC中PI3K/AKT信号通路与其他通路间发生的交互作用，有待进一步研究验证。
| [1] | Kalemkerian G P, Akerley W, Bogner P, et al. Small cell lung cancer[J]. J Natl Compr Canc Netw, 2013, 11(1): 78-98. |
| [2] | William W N Jr, Glisson B S. Novel strategies for the treatment of small-cell lung carcinoma[J]. Nat Rev Clin Oncol, 2011, 8(10): 611-619. DOI: 10.1038/nrclinonc.2011.90 |
| [3] | D'Angelo S P, Pietanza M C. The molecular pathogenesis of small cell lung cancer[J]. Cancer Biol Ther, 2010, 10(1): 1-10. DOI: 10.4161/cbt.10.1.12045 |
| [4] | Zou Y, Qin X, Xiong H, et al. Apoptosis of human non-small-cell lung cancer A549 cells triggered by evodiamine through MTDH-dependent signaling pathway[J]. Tumour Biol, 2015, 36(7): 5187-5193. DOI: 10.1007/s13277-015-3174-z |
| [5] | Fang C, Zhang J, Qi D, et al. Evodiamine induces G2/M arrest and apoptosis via mitochondrial and endoplasmic reticulum pathways in H446 and H1688 human small-cell lung cancer cells[J]. PLoS One, 2014, 9(2): e115204. DOI: 10.1371/journal.pone.0115204 |
| [6] | 韩娇艳, 朱方强, 徐祥, 等. 川芎嗪通过Akt信号通路影响前列腺癌PC3细胞的增殖和凋亡[J]. 第三军医大学学报, 2013, 35(2): 105-108. |
| [7] | 张小丽, 高建, 贾茜, 等. 肝癌干细胞样细胞的分离及其耐药性受PI3K/Akt通路调节[J]. 第三军医大学学报, 2013, 35(2): 99-104. |
| [8] | 毛蜀, 何密斯, 刘桂元, 等. 姜黄素对髓母细胞瘤PI3K/Akt信号通路的作用[J]. 第三军医大学学报, 2013, 35(6): 518-522. |
| [9] | Wakuda K, Kenmotsu H, Serizawa M, et al. Molecular profiling of small cell lung cancer in a Japanese cohort[J]. Lung Cancer, 2014, 84(2): 139-144. DOI: 10.1016/j.lungcan.2014.02.013 |
| [10] | Wojtalla A, Fischer B, Kotelevets N, et al. Targeting the phosphoinositide 3-kinase p110-α isoform impairs cell proliferation, survival, and tumor growth in small cell lung cancer[J]. Clin Cancer Res, 2013, 19(1): 96-105. DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-12-1138 |
| [11] | Umemura S, Mimaki S, Makinoshima H, et al. Therapeutic priority of the PI3K/AKT/mTOR pathway in small cell lung cancers as revealed by a comprehensive genomic analysis[J]. J Thorac Oncol, 2014, 9(9): 1324-1331. DOI: 10.1097/JTO.0000000000000250 |
| [12] | Wang C, Li S, Wang M. Evodiamine-induced human melanoma A375-S2 cell death was mediated by PI3K/Akt/caspase and Fas-L/NF-κB signaling pathways and augmented by ubiquitin-proteasome inhibition[J]. Toxicol In Vitro, 2010, 24(3): 898-904. DOI: 10.1016/j.tiv.2009.11.019 |
| [13] | Wei W T, Chen H, Wang Z H, et al. Enhanced antitumor efficacy of gemcitabine by evodiamine on pancreatic cancer via regulating PI3K/Akt pathway[J]. Int J Biol Sci, 2012, 8(1): 1-14. DOI: 10.7150/ijbs.8.1 |
| [14] | Stegeman H, Span P N, Kaanders J H, et al. Improving chemoradiation efficacy by PI3-K/AKT inhibition[J]. Cancer Treat Rev, 2014, 40(10): 1182-1191. DOI: 10.1016/j.ctrv.2014.09.005 |
| [15] | Vivanco I, Sawyers C L. The phosphatidylinositol 3-Kinase-AKT pathway in human cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2002, 2(7): 489-501. DOI: 10.1038/nrc839 |
| [16] | Ma Y, Xia H, Liu Y, et al. Silencing miR-21 sensitizes non-small cell lung cancer A549 cells to ionizing radiation through Inhibition of PI3K/Akt[J]. Biomed Res Int, 2014, 2014: 617868. DOI: 10.1155/2014/617868 |
| [17] | 张靖, 马虎, 韩静, 等. ABCG2在非小细胞肺癌厄洛替尼耐药中的作用[J]. 第三军医大学学报, 2014, 36(10): 987-991. |
| [18] | Zinn R L, Gardner E E, Marchionni L, et al. ERK phosphorylation is predictive of resistance to IGF-1R inhibition in small cell lung cancer[J]. Mol Cancer Ther, 2013, 12(6): 1131-1139. DOI: 10.1158/1535-7163.MCT-12-0618 |
| [19] | Cui M, Augert A, Rongione M, et al. PTEN is a potent suppressor of small cell lung cancer[J]. Mol Cancer Res, 2014, 12(5): 654-659. DOI: 10.1158/1541-7786.MCR-13-0554 |
| [20] | McFadden D G, Papagiannakopoulos T, Taylor-Weiner A, et al. Genetic and clonal dissection of murine small cell lung carcinoma progression by genome sequencing[J]. Cell, 2014, 156(6): 1298-1311. DOI: 10.1016/j.cell.2014.02.031 |
| [21] | Maemondo M, Inoue A, Kobayashi K, et al. Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR[J]. N Engl J Med, 2010, 362(25): 2380-2388.DOI: 10.1056/NEJMoa0909530 |
| [22] | Holland W S, Chinn D C, Lara P N Jr, et al. Effects of AKT inhibition on HGF-mediated erlotinib resistance in non-small cell lung cancer cell lines[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2015, 141(4): 615-626. DOI: 10.1007/s00432-014-1855-4 |
| [23] | Willers H, Azzoli C G, Santivasi W L, et al. Basic mechanisms of therapeutic resistance to radiation and chemotherapy in lung cancer[J]. Cancer J, 2013, 19(3): 200-207. DOI: 10.1097/PPO.0b013e318292e4e3 |
| [24] | 农丽, 伍钢, 戴晓芳, 等. 吴茱萸碱逆转人肺癌细胞株A549/DDP耐药机理的实验研究[J]. 临床肿瘤学杂志, 2010, 15(6): 487-492. DOI: 10.3969/j.issn.1009-0460.2010.06.002 |
| [25] | Khan M, Bi Y, Qazi J I, et al. Evodiamine sensitizes U87 glioblastoma cells to TRAIL via the death receptor pathway[J]. Mol Med Rep, 2015, 11(1): 257-262.DOI: 10.3892/mmr.2014.2705 |
| [26] | Pan X, Hartley J M, Hartley J A, et al. Evodiamine, a dual catalytic inhibitor of type Ⅰ and Ⅱ topoisomerases, exhibits enhanced inhibition against camptothecin resistant cells[J]. Phytomedicine, 2012, 19(7): 618-624. DOI: 10.1016/j.phymed.2012.02.003 |