2. 401147 重庆,重庆医科大学附属口腔医院:重庆市高校市级口腔生物医学工程重点实验室;
3. 401147 重庆,重庆医科大学附属口腔医院:口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室
2. Key Laboratory of Oral Biomedical Engineering of Chongqing Higher Education, Affiliated Stomatological Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, 401147, China;
3. Chongqing Key Laboratory of Oral Diseases and Biomedical Sciences, Affiliated Stomatological Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, 401147, China
随着对牙周炎发病机制的深入研究和牙周组织工程技术的不断发展,牙周治疗的重点已从阻止炎症进展转变为促进牙周支持组织的重建,其中牙槽骨的再生是决定牙齿功能的关键修复部分。牙周韧带组织来源的牙周膜干细胞﹙periodontal ligament stem cells,PDLSCs﹚因具有高度增殖、自我更新能力和多向分化潜能,成为牙周缺损修复和牙周组织再生最直接和最理想的种子细胞[1]。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)是诱导干细胞成骨分化能力较强的一类生长因子,其中BMP2、7、9是目前经验证作用最突出的亚型[2],其作用机制的研究也备受关注。有研究发现,BMPs可以激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)通路,而细胞外信号调节激酶5(extracellular signal-regulated kinase 5,ERK5)作为MAPKs家族的一个新成员,在细胞分化、 血管生成等方面也发挥了重要作用。因此,阐明BMPs与ERK5通路间的调控关系将为深入研究BMPs诱导牙周膜干细胞成骨分化的作用及机制提供新的理论依据。
本实验首先采用组织块酶消化法分离培养原代人PDLSCs,利用腺病毒载体介导的BMP2、BMP7和BMP9蛋白分别感染PDLSCs,比较、确认BMP9对细胞成骨分化的最强作用;然后检测BMP9作用于PDLSCs后对ERK5通路的激活情况和特异性抑制剂BIX02189预处理后BMP9-ERK5通路对PDLSCs成骨分化的影响,探讨ERK5参与BMP9诱导PDLSCs骨向分化的作用途径。
1 材料与方法 1.1 主要材料与试剂腺病毒载体:Ad-GFP、Ad-BMP2、Ad-BMP7、Ad-BMP9由美国芝加哥大学分子肿瘤实验室何通川教授惠赠。人牙周膜干细胞来源:征得患者本人及家属同意后,取10~15岁因正畸需要拔除的健康前磨牙。主要试剂:Ⅰ型胶原酶(Sigma公司),DMEM/F12培养基(HyClone公司),胎牛血清(Gibco公司),维生素C、β-磷酸甘油(Sigma公司),角蛋白抗体、波形蛋白抗 体、荧光兔二抗(中杉金桥公司),p-ERK5抗体(CST),抑制剂BIX02189(Selleck公司),碱性磷酸酶活性检测试剂盒、碱性磷酸酶显色试剂盒(碧云天公司),茜素红染液(Solarbio公司),qRT-PCR试剂盒(天根公司),BCA蛋白浓度测定试剂盒、Western blot相关试剂(碧云天公司)。
1.2 方法 1.2.1 人牙周膜干细胞的分离、培养牙齿拔除后立即放入预冷的含双抗的DMEM/F12培养基中,观察牙周膜组织附着是否完整,迅速转移入实验室生物安全柜内,用含2×双抗的生理盐水反复冲洗根面,直至完全去除根面血液,用手术刀片刮取根中1/3牙周膜组织放入1.5 mL离心管内,加入0.1%Ⅰ型胶原酶1 mL,置于37 ℃水浴箱30 min,每5 min振荡1次。离心,去除上清液后加入含有10%FBS的DMEM/F12培养液1 mL漂洗1次,离心后将组织块转移到铺有一层血清的细胞培养瓶内,倒置加入3 mL DMEM/F12完全培养液,置于孵箱(37 ℃,5%CO2)倒置培养过夜,后翻瓶正置培养。待细胞爬出组织块,每3天换液1次,直至细胞生长达80%~90%融合时,消化传代。
1.2.2 细胞免疫荧光染色鉴定hPDLSCs来源取第3代细胞接种于24孔板内爬片上,待细胞融合度达80%左右时去除培养液,1×PBS清洗3次,每次5 min,4%多聚甲醛固定30 min,1×PBS清洗3次,每次5 min,0.1% Triton-100孵育15 min,1×PBS清洗3次,每次5 min,1% BSA封闭30 min,滴加抗波形蛋白一抗或抗角蛋白一抗孵育,4 ℃过夜;PBS清洗后,加入兔二抗,37 ℃孵育1 h,DIPA染核5 min,自来水终止,抗淬灭剂封片,激光共聚焦显微镜下观察拍照。
1.2.3 细胞克隆形成实验取第3代细胞消化,吹打至单细胞悬液,接种400个细胞至6 cm细胞培养皿内,置于孵箱培养,每天观察细胞生长情况,以50个细胞为1个克隆形成单位,10~14 d取出培养皿,4%多聚甲醛固定30 min,漂洗后结晶紫染色30 min,PBS终止染色漂洗,于倒置显微镜下观察拍照。
1.2.4 碱性磷酸酶染色取第4代细胞,按照30%密度接种于24孔板,设GFP、BMP2、BMP7、BMP9 4组。待细胞贴壁后分别加入适量的Ad-GFP、Ad-BMP2、Ad-BMP7、Ad-BMP9,荧光感染率约为50%,8 h后换液,连续培养5 d或7 d时终止,PBS冲洗,4%多聚甲醛固定30 min,PBS冲洗,每孔加入250 μL BCIP/NBT染色工作液,室温避光孵育30 min。吸弃染液,用ddH2O洗涤2次终止显色反应,倒置显微镜成像拍照。取第5代细胞,按照相同方法接种细胞,设空白、GFP、BMP9、BMP9+2.5 μmol/L BIX02189和BMP9+10 μmol/L BIX02189 5组。待细胞贴壁后,按分组分别加入适量的Ad-BMP9和Ad-GFP,8 h后换液,加入2.5 μmol/L和10 μmol/L BIX02189,7 d后,同上方法进行碱性磷酸酶染色实验。
1.2.5 碱性磷酸酶活性检测铺板步骤和分组同碱性磷酸酶染色。Ad-GFP、Ad-BMP2、Ad-BMP7、Ad-BMP9感染细胞3、5 d或7 d时终止,每孔加入200 μL 0.2% Triton X-100裂解细胞,刮取裂解物至1.5 mL EP管中,离心12 000 r/min 5 min,取上清液置-80 ℃暂存,待所有时间段样本收集完毕,根据碱性磷酸酶检测试剂盒说明书进行定量检测。设立3个复孔,根据标准曲线及作用时间计算得出样本的碱性磷酸酶活性值。取第5代细胞,按照相同方法接种细胞,并加入适 量的Ad-BMP9和Ad-GFP,8 h后换液,加入2.5 μmol/L 和10 μmol/L BIX02189,7 d后,同上方法进行碱性磷酸酶活性检测。
1.2.6 茜素红染色实验铺板步骤和分组同碱性磷酸酶染色,荧光感染率约为30%的Ad-GFP、Ad-BMP2、Ad-BMP7、Ad-BMP9感染细胞8 h后换液(含10 mmol/L β-磷酸甘油和50 mg/L维生素C),连续培养21 d后,PBS冲洗,4%多聚甲醛固定30 min,PBS冲洗,每孔加入200 μL 0.2%茜素红染色室温孵育1 h,吸弃染液,用ddH2O洗涤2次终止显色反应,倒置显微镜成像拍照。取第5代细胞,按照相同方法接种细胞,并加入适量的Ad-BMP9和Ad-GFP,8 h后换液,加入2.5 μmol/L和10 μmol/L BIX02189,21 d后,同上方法进行茜素红染色实验。
1.2.7 qRT-PCR检测取第4代细胞按照30%密度接种于6 cm细胞培养皿中,设GFP、BMP2、BMP7、BMP9 4组。待细胞贴壁,分别加入适量的Ad-GFP、Ad-BMP2、Ad-BMP7、Ad-BMP9,荧光感染率为50%左右,8 h后换液,连续培养7 d,PBS冲洗,提取细胞总RNA,微量核酸蛋白检测仪测定样本浓度和纯度。按照qRT-PCR试剂盒说明书将mRNA逆转录为cDNA,Bio-rad CFX实时荧光定量PCR仪检测成骨相关基因OCN、OPN mRNA的表达,40个循环。以β-actin基因作为内参照,利用Bio-Rad CFX Manager软件分析得出基因相对表达量。取第5代细胞,按照相同方法接种细胞,设空白、GFP、BMP9、BMP9+2.5 μmol/L BIX02189和BMP9+10 μmol/L BIX02189 5组。待细胞贴壁后,按分组分别加入适量的Ad-BMP9和Ad-GFP,8 h后换液,加入2.5 μmol/L和10 μmol/L BIX02189,7 d后,同上方法进行成骨分化相关基因OCN、OPN、OSX、RUNX2 mRNA的检测。所用引物序列见表 1。
基因 | 引物序列(5′→3′) | 产物大小(bp) |
OCN | 正向:GAGTTGGCTGACCACATCG 反向:AAAGAAGGGTGCCTGGAGAG | 122 |
OPN | 正向:GCCGTGGGAAGGACAGTTAT 反向:GCTCATTGCTCTCATCATTGG | 114 |
OSX | 正向:GAGGTTCACTCGTTCGGATG 反向:TGGTGTTTGCTCAGGTGGT | 120 |
RUNX2 | 正向:GACGAGGCAAGAGTTTCACC 反向:GGTTCCCGAGGTCCATCTAC | 106 |
β-actin | 正向:CCTGGCACCCAGCACAAT 反向:GGGCCGGACTCGTCATAC | 200 |
取第4代细胞接种至10 cm 细胞培养皿中,密度为60%。设GFP、BMP9、 BMP9+DMSO、BMP9+2.5 μmol/L BIX02189、BMP9+5 μmol/L BIX02189和BMP9+10 μmol/L BIX02189 6组。待细胞贴壁后,加入一定浓度的抑制剂BIX02189 (2.5、5、10 μmol/L)预处理1 h,后分别加入适量的Ad-GFP或BMP9继续培养24 h,提取总蛋白质,BCA蛋白浓度测定试剂盒进行浓度测定。将所得蛋白样本进行电泳,转膜,封闭,加入p-ERK5一抗(1:1 000)或β-actin一抗(1:5 000),4 ℃过夜孵育,加入HRP标记的二抗(1:5 000),ECL化学发光法进行显色。
1.3 统计学分析采用SPSS 21.0统计软件对计量资料进行单因素方差分析。
2 结果 2.1 原代人牙周膜干细胞的培养及鉴定采用组织块酶消化法分离人牙周膜细胞,5~7 d即可观察到大量细胞从组织块周围爬出,细胞为成纤维细胞样,多呈长梭形,传代后呈漩涡状生长。细胞免疫荧光染色鉴定示抗波形蛋白表达阳性,抗角蛋白表达阴性,说明细胞来源于中胚层间充质细胞,而非上皮细胞。克隆形成能力检测示:细胞生长2周后显微镜下即可见克隆形成,克隆中心细胞密度较大,多呈圆形,结晶紫染色可见克隆成蓝色团(图 1)。
2.2 BMPs促进hPDLSCs细胞成骨分化ALP染色和活性检测结果显示:第5天和第7天时,与GFP组比较,BMP2、BMP7和BMP9组的ALP表达均明显增强,差异有统计学意义(P<0.05),且BMP9组高于BMP2和BMP7组,差异有统计学意义(P<0.05)。可见BMP9早期成骨ALP表达最强,BMP2次之,染色和活性结果一致(图 2A、B)。
qRT-PCR检测结果显示:与GFP组比较,BMP2、BMP7和BMP9组的细胞成骨分化相关基因OCN和OPN mRNA的表达均升高,差异有统计学意义(P<0.05),且BMP9组明显高于BMP2和BMP7组,差异有统计学意义(P<0.05,图 2C)。
茜素红染色显示:与GFP组比较,BMP2、BMP7和BMP9组的钙盐结节沉积均明显增多,其中BMP9的晚期成骨诱导作用最强(图 2D)。
通过对细胞早期成骨分化指标、晚期成骨分化指标和成骨分化相关基因的检测,说明BMP9促进hPDLSCs 成骨分化作用强于BMP2和BMP7,后续将以BMP9作为研究BMPs-ERK5通路的实验对象。
2.3 ERK5信号通路参与BMP9诱导人牙周膜干细胞成骨分化Ad-GFP或Ad-BMP9感染hPDLSCs,经ERK5特异性抑制剂BIX02189预处理hPDLSCs。Western blot检测结果显示:p-ERK5在Ad-BMP9组的表达较Ad-GFP组明显增强,且p-ERK5在BIX02189处理组的表达随着抑制剂剂量的增加而减低。说明BMP9可激活ERK5信号通路,BIX02189可有效抑制ERK5通路的磷酸化激活作用且呈剂量依赖性(图 3)。
碱性磷酸酶染色定性和活性定量结果显示:第7天时BMP9+10 μmol/L BIX02189组和BMP9+2.5 μmol/L BIX02189组ALP表达较BMP9组明显降低,且呈剂量依赖性(图 4A、B)。
qRT-PCR检测结果显示:BMP9+10 μmol/L BIX02189组和BMP9+2.5 μmol/L BIX02189组成骨分化相关基因OCN、OPN、OSX、RUNX2 mRNA表达水平较BMP9组明显降低,且呈剂量依赖性(图 4C)。
茜素红染色结果显示:第21天时BMP9+10 μmol/L BIX02189组和BMP9+2.5 μmol/L BIX02189组钙盐结节沉积较BMP9组明显减少,且呈剂量依赖性(图 4D)。
通过对细胞早晚期成骨分化指标和成骨分化相关基因的检测,说明抑制ERK5信号通路可降低BMP9诱导hPDLSCs细胞的成骨分化作用。
3 讨论目前,公认的已分离出5种牙源性干细胞[3],其中牙周韧带组织来源的牙周膜干细胞因具有成骨样、脂肪样、神经细胞样或成软骨样多向分化潜能[4]和克隆形成能力,而成为牙周组织再生最直接和最理想的种子细胞。
在干细胞成骨研究领域,骨形态发生蛋白(BMPs)是目前发现的唯一能单独诱导成骨和成软骨分化的一类生长因子,已鉴定出20余种亚型,除BMP1外均属于转化生长因子(transforming growth factor-β,TGF-β)超家族成员。其中人重组骨形态发生蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein 2,rhBMP2)和rhBMP7已被美国FDA批准用于临床脊柱融合术和骨折治疗[5]。随着对BMPs蛋白的深入研究,发现BMP9诱导骨髓间充质干细胞成骨分化作用强于BMP2和BMP7[6]。本研究比较BMP2、BMP7和BMP9对牙周膜干细胞的成骨诱导作用,结果显示Ad-BMP9组的早期和晚期成骨均比Ad-BMP2和Ad-BMP7组有明显增强,证实BMP9诱导牙周膜干细胞成骨分化的作用最强,表明其在骨生成方面将有着良好的研究意义和应用前景,因此,后续实验皆用BMP9作为研究BMPs-ERK5信号通路的蛋白代表。
经典的BMPs信号通路是通过Smad途径调控靶基因的转录表达,近年来非经典途径及与其他通路的串话调控也逐渐引起研究者的关注,如MAPKs、Wnt、Notch、Growth hormone(GH)通路[7]等。MAPKs信号途径是刺激信号从细胞表面到核内的重要传递者,包括P38MAPK、ERK1/2/5、JNK等[8]。ERK5作为MAPKs家族的一个新成员,为丝/苏氨酸蛋白激酶,被磷酸化激活后从胞浆转位至胞核,与转录因子MEF结合增强其转录活性,可调控细胞的生长、分化、抗凋亡、血管生成等生物学功能。在细胞骨代谢方面,有研究提出MERK1/ERK1可能对骨生成起着正向调节作用[9],而MERK2/ERK2起着负向调节作用[10],ERK5的激活可能有助于破骨前体细胞的分化[11]。但BMP9与ERK5信号通路间的作用关系对牙周膜干细胞成骨分化的影响尚不清楚。本研究结果显示:BMP9诱导hPDLSCs细胞24 h后可引起p-ERK5表达明显增强,说明BMP9在hPDLSCs中可促进ERK5的磷酸化,从而激活ERK5信号通路发挥下游调控作用。当采用ERK5的特异性阻断剂BIX02189干预后,发现ERK5的磷酸化水平成剂量依赖性的降低,同时,BMP9诱导hPDLSCs成骨分化的早期和晚期成骨标志均随着BIX02189的剂量增加而减低。
本研究进一步探讨了BIX02189干预下,BMP9对hPDLSCs成骨分化相关基因的影响。Runx2是与果蝇蛋白Runt同源的成骨相关转录因子,可与成骨特异顺式作用元件结合,调节OCN、OPN、BSP和Ⅰ型胶原基因的转录和表达,是间充质干细胞向成骨细胞分化的必要和充分条件[12]。OSX是近年发现的成骨细胞分化和骨形成过程中所必需的另一个重要的转录因子,位于Runx2的下游,在成骨细胞终末分化成熟过程中发挥重要作用[13]。OPN是一种酸性糖蛋白,与成骨过程密切相关,连接基质与矿化,是骨组织形成的早期标志。OCN是骨基质中重要的胶原蛋白,与组织的成熟有关[14]。本研究结果显示,BMP9刺激能明显增强OSX和Runx2两个重要转录因子mRNA的表达,同时OCN和OPN mRNA表达也增强,而抑制ERK5通路后表达均急剧下降,提示ERK5信号通路参与BMP9的成骨分化诱导过程。Lee 等[15]提出OSX作为Runx2的下游基因,BMP2对OSX的诱导作用又不依赖于Runx2的存在,因此,在BMP9和ERK5协调作用过程中对OSX 和 Runx2的转录调控机制可能是决定细胞成骨分化的重要一环,值得我们深入研究。
有研究报道ERK5基因敲除小鼠表现为胚胎外血管和心血管发育迟缓[16],ERK5可调节胚胎的血管生成[17],因此,BMP9激活ERK5通路是否通过促进成血管作用从而增强细胞成骨分化和成熟还有待于进一步研究。
综上所述,本研究结果表明:BMP9具有很强的促进hPDLSCs成骨分化作用,同时ERK5信号转导途径在这一过程中发挥了正向调节作用,为牙周膜干细胞分化调控研究提供了新的理论依据。
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