作为目前全球范围内对人类健康威胁最大的疾病之一，原发性肝癌(primary hepatocellular cellular carcinoma，PHC)又被简称为肝癌。其由肝细胞和(或)肝内胆管上皮细胞癌变导致^[1]。由于我国客观条件限制，多数肝癌患者在就诊时已经错过了最佳手术时机，导致部分患者无法彻底清除病灶，预后不良，严重影响生活质量，甚至威胁生命^[2]。近年来，随着国内外关于CIK细胞续灌输入治疗相关研究的不断进展，我国对原发性肝癌患者进行CIK细胞续灌输入治疗这一治疗方案正在逐渐普及^[3]。但关于CIK细胞续灌输入对于原发性肝癌治疗的具体机制仍不清楚。本研究选取2012年9月至2014年9月的54例原发性肝癌患者，以研究CIK细胞续灌输入治疗对原发性肝癌患者免疫功能的影响，并探讨其防止肝癌术后复发的有效性。现报告如下。

取重庆市西南医院2012年9月至2014年9月收治的资料齐全的原发性肝癌患者共54例进行研究。分期均为Ⅰ、Ⅱ期，Child-pugh分级均为A、B级。肿瘤 直径4~7 cm。卡氏评分(Karnofsky，KPS)＞90分。其中男性35例，女性19例，年龄44~79岁，平均51.2岁。 并确保54例患者在接受治疗前未使用免疫抑制剂与激素类药物。全部患者根据相应体征、临床症状、B超以及病理学检查明确诊断，并且行外科手术治疗切除肿瘤，清扫淋巴结，病理确认无转移。随机将所有患者分为治疗组与对照组。治疗组27例患者，接受CIK细胞续灌输入治疗；对照组27例，仅接受常规治疗。其中治疗组男性16例，女性11例，年龄45~77岁，平均50.9岁；对照组男性18例，女性9例，年龄范围44~79岁，平均51.4岁。两组患者一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，详见表 1。另取同时期我院体检中心的健康体检者16例为健康组。

IL-1α购自美国PeproTech公司，anti-CD3McAb购自美国R&D公司，rhIFN-γ购自上海克隆生物高技术公司，IL-2购自美国Chiron公司，无血清培养基购自美国GIBCO公司，检测T细胞亚群与DC细胞亚群的各类抗体均购自美国BD公司。Spectra6.1成分血采血机购自美国COBE公司，FACSCalibur流式细胞分析仪购自美国BD公司。使用软件包括：CellQuest、SimulSET、 MultiSET和FACSCOMP。

采取治疗组患者60 mL外周血，使用密度梯度离心法(density gradient centrifugation)分离得到1×10⁷~7×10⁷个单个核细胞( peripheral bloodmononuclear cell，PBMC)。 将细胞浓度使用 无血清培养基调整至1×10⁶/mL ~2×10⁶/mL，加IFN-γ在37 ℃、5%CO₂环境中于透气性培养瓶进行培养24 h。随后将小鼠抗人CD3单抗(100 ng/mL)、IL-2(1 000 U/mL)和IL-1α(1 000 U/mL)依次加入，每日观察细胞生长情况并继续培养。每2~3天补充一次新鲜含1%自体血浆和IL-2(500 U/mL)培养液。继续培养2周，质控合格后将CIK细胞收集、离心、洗涤，用含20%人血白蛋白的生理盐水进行重悬。

所有参与本研究CIK细胞培养、制备的人员均经过药品生产质量管理规范(GOOD MANUFACTURING PRACTICES，GMP)培训以及相应体检。制备操作过程与相应试剂、仪器亦符合临床规定的安全标准。在换液时，对CIK细胞制剂进行抽查，要求为：①CIK细胞存活率＞95%；②CIK门(CIK gate)中CD3⁺≥80%，CD8⁺D≥40%，CD3⁺CD56⁺≥30%；③未受外源真菌、细菌、病毒或其他微生物污染；④无血清蛋白、抗生素、抗体等添加成分。

于CIK细胞培养第14日开始，每次收集约5×10⁹CIK细胞，经过离心、洗涤、重悬后制成250 mL CIK细胞悬液，经静脉于1 h内回输入患者体内，隔日后再回输一次。2次为1疗程，共持续2个疗程。对照组患者不行CIK细胞续灌输注治疗。

所有患者(治疗组、对照组)与健康者均于治疗前抽取静脉抗凝血5 mL，进行相应的T细胞亚群(CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺)与DC细胞亚群测定(DC1：CD45⁺LIN^-CD123^-CD11C⁺；DC2：CD45⁺LIN^-CD11C^-CD123⁺)。治疗组患者于CIK细胞回输后的第14日重复测定。

对所有患者从症状、体征、生化指标、病毒学指标、免疫学指标以及影像学指标方面进行评价。并统计随访1年时(死亡患者则为死亡时)的复发率。

应用SPSS 20.0软件进行统计学处理。计量资料以x±s表示，采用独立样本t检验与配对样本t检验。计数资料以百分比(%)表示，采用χ²检验。

术前对本研究治疗组与健康组患者进行外周血T细胞亚群和DC细胞亚群的检验分析，结果显示治疗组患者外周血CD3⁺占外周血单个核细胞百分比水平高于健康组(P<0.05)，CD8⁺低于健康组(P<0.05)，CD4⁺/CD8⁺高于健康组(P<0.05)，DC1/DC2低于健康组(P<0.05)，差异有统计学意义。而两组间CD4⁺、DC1和DC2占外周血单个核细胞百分比水平差异无统计学意义(P>0.05)。详见表 2。

治疗组接受术后CIK细胞续灌输入治疗后，外周血CD8⁺占外周血单个核细胞百分比水平较治疗前提高(26.39%±7.85% vs 29.14%±9.18%)，CD4⁺/CD8⁺则明显下降(1.74±0.54 vs 1.56±0.62)，DC1/DC2高于治疗前(1.15±1.13 vs 1.52±1.53)，差异有统计学意义(P<0.05)。而CD3⁺、CD4⁺、DC1、DC2则与治疗前相比差异无统计学意义(P>0.05)。详见表 3。

两组患者接受不同治疗后，进行随访并，记录死亡率和治疗后1年的复发率(死亡患者为死亡时)。治疗组共有3例患者肝癌复发，全部死亡，复发率为11.1%，死亡率11.1%；对照组共9例复发，其中5例死亡，复发率为33.3%，死亡率18.5%，两组间复发率差异有统计学意义(P<0.05)，但两组间的死亡率差异无统计学意义(P>0.05)。K-M曲线详见图 1。治疗组27例患者，有5例在CIK细胞回输后的6 h内出现37.3~38.0 ℃的低烧，且能在6 h内自行退烧。余无明显不良反应。

A：累计复发率曲线；B：生存率曲线 图 1 两组患者接受不同治疗后复发率、死亡率以及不良反应比较

图选项

原发性肝癌(primary hepatocellular carcinoma，PHC)是一种由肝细胞和(或)肝内胆管上皮细胞癌变导致的恶性肿瘤疾病，被简称为肝癌。根据文献报道，每年全世界直接或间接死于原发性肝癌的人数高达60万，而近年来，其也逐渐成为国内死亡率第二的肿瘤性疾病^[4]。并且伴随人口老龄化问题的加重，其死亡率仍有进一步上升的趋势。外科手术切除作为当前原发性肝癌的治疗首选方法，在对患者进行严格的手术指征选择的前提下，5年生存率能够达到70%^[5]，但由于我国客观条件限制，多数肝癌患者在就诊时已经错过了最佳手术时机，只能选择管肝动脉化疗栓塞(transcatheter arterial chemoembolization，TACE)、射频消融(radiofrequency ablation，RFA)、放化疗或肝移植(liver transplantation operation，LTO)中的一种或几种进行综合治疗，往往不能完全清除病灶，甚至对患者本身的免疫功能造成影响，治疗效果差强人意^{[6, 7, 8]}。

CIK细胞(cytokine induced killer，CIK)作为自体脐血或外周血来源的单个核细胞，是由细胞因子诱导的具有免疫活性的杀伤细胞。其最早在1991年被斯坦福大学的Schmidt-Wolf 等人发现并研制^[9]。因其是具有CD3⁺与CD56⁺双阳性、兼具自然杀伤细胞(nature kill cell，NK)的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)限制性杀伤与淋巴T细胞的高效杀瘤作用的细胞毒性杀伤细胞，并且体外扩增快，杀瘤效率高，抗瘤谱广泛，毒副作用少，对多重耐药性肿瘤细胞敏感性高，已作为继手术治疗、化学药物治疗、放射治疗之后对原发性肝癌的第4中治疗模式：生物治疗，并成为研究热点^[10]。

和刚等的研究发现^[11]，人体的主要免疫调节作用由辅助性T细胞(CD4⁺)与杀伤性T细胞(CD8⁺)相互作用形成，而CD4⁺/CD8⁺比值在一定程度上能够代表当前机体的免疫状态。施明等也认为^[4]，肿瘤细胞能够逃避免疫系统监视的能力是导致其较难根治的主要原因之一，而原发性肝癌患者的细胞免疫往往功能低下，这可能与肿瘤细胞免疫原性弱，使机体难以产生针对性的CD8⁺有关。因此，若要提高原发性肝癌的治疗效果，不仅要提升体内细胞毒作用效应细胞水平，还需要提升相应辅助性细胞水平。本研究结果显示，与健康患者相比，原发性肝癌患者的外周血CD8⁺和DC1/DC2均有不同程度降低，提示患者细胞免疫功能受限。在接受CIK细胞续灌输入治疗后，研究组患者以上指标均较治疗前有显著提升，这可能与CIK细胞中CD8⁺水平较高，且能分泌大量IL-2、IFN-γ、IL-12等Th1类细胞因子，对体内其他细胞因子的释放产生调节作用，进而产生一系列提升细胞免疫功能的反应有关^[12]。DC细胞作为目前发现的人体中抗原提呈功能最强的免疫细胞，对刺激、促进T细胞的增殖作用显著，在先天性免疫与获得性免疫中均扮演重要角色^[13]。本研究发现，经CIK细胞续灌输入治疗后，原发性肝癌患者DC1/DC2水平较治疗前显著改善，提示CIK细胞不仅能够增强机体针对癌细胞的细胞免疫功能，还能提升免疫监视功能水平，这可能与治疗组经CIK细胞续灌输入治疗后复发率较常规治疗明显降低有关，但两组间死亡率差异无统计学意义，是否与样本量过小有关，仍有待于进一步研究。

综上所述，原发性肝癌患者自身免疫环境发生变化。流式细胞术具有快速、准确、灵敏的优点，通过流式细胞术对原发性肝癌患者治疗前后的免疫功能进行评价，认为CIK细胞在提高患者免疫功能，降低肝癌复发率方面有一定效果，可以改善患者预后，值得临床推广。