5-FU作为结肠癌、头颈部肿瘤等实体肿瘤的常用化疗药物,其治疗作用不可替代[1, 2],但临床上仍有50%以上的患者对5-FU化疗不敏感[3]。现在许多证据已表明肿瘤微环境在调控肿瘤发生发展过程中起重要作用,主要表现为影响肿瘤的恶性程度及化疗敏感性[4, 5]。巨噬细胞是肿瘤微环境的重要组成成分[6, 7],它对肿瘤的恶性进展起促进作用[8, 9, 10],然而其对化疗敏感性的影响目前尚不清楚。近年来研究发现,代谢重编程是肿瘤发生过程中最显著的生物学特性之一[11],且肿瘤微环境对其有调控作用[12, 13]。巨噬细胞的脂代谢异常与多种肿瘤的恶性表型有关[14],但它在恶性肿瘤中的具体作用及对5-FU化疗敏感性的影响仍知之甚少。我们的前期实验证实,结肠癌巨噬细胞中脂质分解代谢显著增强,提示巨噬细胞的功能活性依赖于旺盛的能量代谢。我们猜测:干预巨噬细胞的物质能量代谢,可能会影响5-FU对巨噬细胞的杀伤作用。 研究表明脂肪分解代谢的关键基因CGI-58 参与调节线粒体功能[15],并在结肠癌巨噬细胞中的表达显著升高[16]。综上,我们推测:CGI-58可抵抗5-FU对巨噬细胞的杀伤作用,其机制可能为CGI-58会促进 脂肪分解和线粒体的有氧氧化作用。本研究以CGI-58 敲低的巨噬细胞为研究对象,来探索CGI-58对5-FU化疗敏感性的影响和作用机制。
1 材料与方法 1.1 主要材料与仪器巨噬细胞系RAW264.7(PLKO)和CGI-58敲低(knockdown)的巨噬细胞系(CGI-58 KD)(由本实验室冻存),恒温恒湿CO2培养箱(美国Thermo Forma公司),低速冷冻离心机(美国Beckman公司),高速冷冻离心机(日立公司,TGL-16G-A),Western blot制胶、电泳、转膜、GelDoc2000凝胶成像系统、显色曝光装置(Bio-rad),紫外分光光度计(Beckman),微孔板读数仪(Biotech),光学显微镜(日本Olympus公司),金属浴 加热装置(Fisher Sci),多功能酶标读数仪(美国Thermo Scientific公司),Calibur流式细胞仪(美国BD公司)均由第三军医大学西南医院中心实验室提供,Seahorse生物能量代谢监测仪(XFe96 Extracellular Flux Analyzer,Seahorse Bioscience,U.S.)由第三军医大学高原医学实验室提供。
1.2 主要试剂DMEM 高糖型培养基(美国 HyClone公司),胎牛血清(fetal bovine serum ,FBS,HyClone)0.25%胰蛋白酶(美国HyClone公司),DMSO(美国BIOSHARP公司),5-FU(#F6627,Sigma);RIPA 蛋白提取试剂盒、PIERCE BCA蛋白浓度测定试剂盒等Western相关试剂均由上海碧云天生物工程公司提供,Cleaved Caspase-3抗体(Goat pAb,Santa Cruz);CCK-8细胞增殖试剂盒(C0037,Beyotime,China),细胞凋亡试剂盒Annexin V-FITC (AO2001-02A-H,Sungene Biotech,China),细胞周期试剂盒(C1052,Beyotime,China),2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate (DCFDA) (#D6883,Sigma),活性氧(ROS)抑制剂N-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine,NAC)(#A7250,Sigma)。
1.3 实验方法 1.3.1 细胞培养将巨噬细胞(PLKO)和CGI-58敲低的巨噬细胞(CGI-58 KD)接种于常规培养基[DMEM培养基+10%(体积比)FBS+1%(体积比)青、链霉素(100 U/mL,100μg/mL)],5% CO2、37℃恒温恒湿培养。
1.3.2 CCK-8 细胞增殖实验在96孔板中接种对数生长期的贴壁PLKO和CGI-58 KD细胞,同一培养条件分别培养0、24、48、72h,每孔100μL的培养基中含2 000个细胞,每组5个复孔。37℃培育12h后加入5-FU溶液(用DMSO溶解成浓度为0.5μmol/L),每隔24小时换液。每孔加入100μL的CCK-8试剂混合液(10% DMEM 4 mL+400μL CCK-8试剂)继续培育80 min,终止培养,在酶标仪上选择波长450 nm处测定各孔光密度值[D(450)]。绘制生长曲线,实验重复3次。
1.3.3 细胞周期实验收集5-FU处理24h的对数生长期PLKO和CGI-58 KD贴壁细胞,细胞数量控制在10×105个之内,PBS洗涤2次,75%的冰乙醇-20℃固定1h,染色,用流式细胞仪检测细胞周期,Cell Quest软件进行分析,实验重复3次。
1.3.4 细胞凋亡Annexin V-FITC法收集5-FU处理24h的对数生长期PLKO和CGI-58 KD贴壁细胞,细胞数达1×105/mL,PBS洗涤1次,100μL标记液常温避光孵育15 min,PBS再洗涤1次,荧光(SA-FLOUS)溶液4℃避光孵育20 min后送流式细胞仪分析数据,实验重复3次。
1.3.5 Western blot检测取5-FU处理24h后的对数生长期PLKO和CGI-58 KD贴壁细胞,按总蛋白提取试剂盒及PIERCE BCA 蛋白定量试剂盒说明分别提取细胞总蛋白并进行浓度测定。SDS-PAGE电泳分离蛋白,250 mA恒流转膜2.5h,5% BSA溶液室温封 闭1h,加一抗(cleaved Caspase-3,封闭液 1:1 000~1:5 000 稀释)4℃孵育过夜,加二抗(封闭液 1:5000 稀释)室温孵育1h,PBST洗3次,10 min/次,将ECL显影液均匀滴在膜上,暗室孵育1 min后置于 GelDoc2000凝胶成像系统上分析处理,实验重复 3次。
1.3.6 线粒体功能检测(Seahorse Assays)细胞线粒体氧耗率(OCRs)采用 XF Cell Mito Stress Test Kit 试剂盒 (Cat.#:101706100,Seahorse Bioscience,U.S.),于XFe96 Extracellular Flux Analyzer (Seahorse Bioscience,U.S.) 检测仪检测。
1.3.7 AMP:ATP比率检测参考第三军医大学中心实验室操作标准执行。
1.3.8 PLKO和CGI-58 KD细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)产物测定用96孔板培养对数期PLKO和CGI-58 KD贴壁细胞,在培养基中加入可穿透细胞膜、对活性氧敏感的探针2′,7′-dichlorofluorescin diacetate (DCFDA,50μmol/L),在 37℃ 的微孔板荧光计数仪内动态检测(每次30 min,持续 6.5h)微孔板底部的荧光强度(激发光 488 nm,吸收光535 nm),实验重复3次。
1.3.9 活性氧(ROS)抑制剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)对巨噬细胞(PLKO)与CGI-58敲低的巨噬细胞(CGI-58 KD)的ROS的影响用96孔板培养对数期PLKO和CGI-58 KD贴壁细胞,饥饿2h,加入NAC(10 mmol/L)处理24h后进行ROS的测定(方法参照1.3.8)。
1.3.10 CCK-8和Western blot分别检测活性氧抑制剂NAC对5-FU诱导的PLKO与CGI-58 KD细胞增殖能力和凋亡的影响取对数生长期的贴壁PLKO和CGI-58KD细胞,加5-FU(0.5μmol/L)和NAC(10 mmol/L)处理24h后进行CCK-8检测(方法参照1.3.2)和Western blot检测(方法参照1.3.5)。
1.4 统计学分析计量数据以x±s表示,采用 SPSS18.0统计软件进行分析,多个样本均数比较采用方差齐性检验,组间比较采用方差分析和t检验。
2 结果 2.1 CGI-58缺失促进5-FU对巨噬细胞的杀伤作用采用CCK-8法检测各组细胞的活力,结果显示,与对照组相比,5-FU处理24h后的PLKO和CGI-58KD细胞增殖活力降低,CGI-58KD+5-FU组细胞活力明显降低(P<0.01,图 1),提示CGI-58缺失会促进5-FU对巨噬细胞的杀伤作用。
2.2 CGI-58缺失对5-FU诱导的巨噬细胞周期阻滞无显著影响通过流式细胞术检测各组细胞的细胞周期,发现经5-FU处理24h后的PLKO和CGI-58KD两组细胞的G1期细胞比例无明显差别(P>0.05,图 2),这表明CGI-58缺失对5-FU诱导的巨噬细胞周期阻滞无显著影响。
2.3 CGI-58缺失促进5-FU诱导的巨噬细胞凋亡通过流式细胞术检测各组细胞的细胞凋亡,发现经5-FU处理24h后,CGI-58KD组的细胞凋亡率明显高于PLKO组(P<0.01,图 3);通过Western blot检测
细胞凋亡蛋白cleaved Caspase-3的表达,发现与对照组相比,5-FU组cleaved Caspase-3明显高表达,而且CGI-58 KD+5-FU组cleaved Caspase-3的表达水平明显高于PLKO+5-FU组(P<0.01,图 4),表明CGI-58缺失促进了5-FU诱导的巨噬细胞凋亡。
Seahorse Assays检测PLKO与CGI-58 KD细胞的线粒体功能,发现与PLKO组相比,CGI-58KD组其ATP生成减少(P<0.05,图 5A),基础耗氧率OCR明显降低(P<0.01,图 5B),ROS表达增加(P<0.01,图 5C),表明CGI-58缺失会损伤线粒体功能: OCR降低,ATP 减少,ROS增加。
2.5 抗氧化剂NAC处理可拮抗巨噬细胞CGI-58缺失诱导的ROS增加、5-FU杀伤作用及cleaved Caspase-3表达水平通过Seahorse Assays检测在NAC阻断下PLKO与CGI-58 KD的ROS表达量,发现NAC干预后CGI-58KD与PLKO的ROS表达量基本一致(P>0.05,图 6A);CCK-8检测了NAC阻断下的PLKO、CGI-58 KD与PLKO+5-FU、CGI-58 KD+5-FU 4组细胞的增殖活力,发现NAC干预后5-FU诱导24h后的PLKO与CGI-58 KD的增殖活力无明显差别(P>0.05,表 1);Western blot检测了上述4组细胞的凋亡蛋白cleaved Caspase-3的表达水平,发现NAC干预后5-FU诱导24h 后的PLKO与CGI-58 KD的cleaved Caspase-3 的表达水平无统计学差异(图 6B)。这说明增强线粒体功能或者清除ROS可消除CGI-58缺失诱导的巨噬细胞凋亡增加。
组别 | 0h | 24h | 48h | 72h |
PLKO组 | 0.36±0.02 | 0.51±0.02 | 0.90±0.09 | 1.52±0.15 |
CGI-58 KD组 | 0.38±0.04 | 0.52±0.05 | 0.92±0.10 | 1.65±0.20 |
PLKO+5-FU组 | 0.34±0.02 | 0.35±0.03a | 0.56±0.05a | 0.98±0.08a |
CGI-58 KD+5-FU组 | 0.36±0.04 | 0.38±0.05b | 0.42±0.04b | 0.56±0.06b |
PLKO+5-FU+NAC组 | 0.36±0.02 | 0.54±0.02 | 0.82±0.09 | 1.32±0.15 |
CGI-58 KD+5-FU+ NAC组 | 0.32±0.04 | 0.48±0.05 | 0.78±0.10 | 1.25±0.20 |
a:P<0.01,与PLKO+5-FU+NAC组比较;b:P<0.01,与CGI-58KD+5-FU+NAC组比较 |
5-FU作为肿瘤治疗的重要基础化疗药物,其主要机制是通过体内相关代谢酶作用转化为活性代谢产物——磷酸脱氧核糖氟尿嘧啶核苷(FdUMP),后者与胸苷酸合成酶(TS)结合使游离的TS 减少,从而抑制脱氧鸟苷酸(dUMP)生成脱氧胸苷酸(dTMP),导致DNA 合成减少,同时FdUMP 通过伪代谢物形式掺入 RNA 分子中,影响 RNA及蛋白质的合成及功能,从而导致肿瘤细胞死亡[17],但其疗效常受耐药性的限制。因此,增强肿瘤对5-FU的敏感性,提高抗癌药物疗效已成为肿瘤临床治疗亟待解决的关键问题。目前国内外研究肿瘤对 5-Fu的耐药机制主要有TS、TK(胸苷酸合成酶)、DPD、叶酸代谢相关酶的活性改变,P-gp(P糖蛋白)、Livin基因、HSP27(热休克蛋白)的高表达,DNA修复机制异常,信号传导异常,肿瘤血管生成及近期研究较热的肿瘤干细胞等[18, 19],但在巨噬细胞和脂质代谢方面的机制研究甚少。我们知道肿瘤微环境通过多种特异因子、信号机制影响肿瘤的生物学特性,所以对肿瘤微环境进行调控可以作为肿瘤预防和化疗的新靶点。近年来的研究表明,肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)介导的炎性微环境在肿瘤恶性进展中起重要作用,如促进肿瘤发生发展、血管生成、增殖、定植与转移等,但TAMs具体活化机制尚不清楚,以往研究都聚焦在肿瘤细胞或其他间质细胞旁分泌的炎性因子对TAMs激活的影响,而近年研究认为间质细胞的代谢重编程在调节肿瘤生物学中起非常重要的作用[20, 21, 22],其中巨噬细胞自身代谢改变和激活与肿瘤的发生发展密切相关[23, 24]。目前TAMs对5-FU等化疗药物的反应作用和敏感性的研究尚无报道。在前期实验中,我们发现结肠癌TAMs中脂质分解代谢显著增强,提示TAMs的功能活性依赖旺盛的能量代谢,于是我们猜测:干预巨噬细胞的物质能量代谢,可能会影响5-FU对巨噬细胞的杀伤敏感性。CGI-58是一种新发现的促进脂肪分解的激动剂,广泛表达于人体各个组织器官[25, 26, 27],在调控脂肪代谢方面发挥至关重要的作用[16, 28],同时又是调节线粒体功能的重要因子[16, 25]。我们前期研究发现脂肪分解代谢的关键基因CGI-58在结肠癌TAMs中显著升高[16]。这表明结肠癌TAMs发生代谢重编程后脂质沉积可能与CGI-58功能缺失有关。本研究以CGI-58为切入点,从TAMs和脂代谢的角度寻找5-FU对巨噬细胞的影响和作用,旨在阐明5-FU对CGI-58特异性敲低的巨噬细胞的杀伤作用和机制,这对于探索肿瘤的化疗抵抗有重要意义。
本实验发现CGI-58缺失后可以明显增强5-FU对巨噬细胞的杀伤作用,主要是通过促进5-FU对巨噬细胞的凋亡来体现的,而与5-FU对巨噬细胞的周期无关。进一步研究发现CGI-58缺失后会损伤巨噬细胞的线粒体功能,使其基础耗氧率OCR降低,ATP生成减少而活性氧ROS生成增多。这些研究结果证实了我们的猜想:巨噬细胞中CGI-58缺失后使TAMs更容易抵抗5-FU的杀伤作用,而CGI-58缺失增强5-FU对巨噬细胞的杀伤作用是通过增加ROS的产生来实现的,这一点可能是引起肿瘤对5-FU等药物产生化疗抵抗的重要原因。
本研究通过探讨5-FU对CGI-58敲低的巨噬细胞的影响,发现TAMs可以引起肿瘤继发性耐药,线粒体脂质分解代谢可以影响肿瘤化疗敏感性,巨噬细胞CGI-58缺失后,可以增强5-FU诱导的巨噬细胞凋亡,解析了5-FU如何对巨噬细胞产生杀伤作用,揭示了CGI-58缺失后可增强巨噬细胞对5-FU的化疗敏感性进而抑制肿瘤的发生发展,此研究结果不仅为接下来的研究工作奠定了实验基础,也为临床上研究5-FU的化疗耐药提供了新的依据,并且对于寻找肿瘤的有效防治策略有重要的指导意义。
我们下一步需要在肿瘤细胞系,体内动物实验和临床上验证上述结论,明确巨噬细胞特异性敲低CGI-58是否可以作为化学预防和治疗癌症的潜在分子靶点,进一步深入研究CGI-58是否对5-FU以外的其他化疗药物如奥沙利铂、伊立替康等诱导的巨噬细胞同样有抵抗作用,除CGI-58外脂质分解代谢的其他酶和基因如MGLL、ATGL等是否也有同样作用,为改进5-FU等化疗药物的疗效,提高肿瘤患者的生存率,改善预后提供新的治疗途径和理论基础。我们相信随着各种研究的不断深入,正确认识并调控巨噬细胞中CGI-58等基因将对肿瘤的临床治疗产生极其重要而深远的影响。
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