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白藜芦醇通过上调SIRT1/自噬通路改善Aβ25-35对PC12细胞增殖的抑制作用
邓皓月, 糜漫天    
400038 重庆,第三军医大学军事预防医学院营养与食品卫生学教研室,营养与食品安全研究中心,重庆市营养与食品安全重点实验室,重庆市医学营养研究中心
摘要目的 探讨SIRT1/自噬通路在白藜芦醇改善Aβ25-35诱导的PC12细胞增殖活力下降中的作用。 方法 用不同浓度(1、5、10、20 μmol/L)白藜芦醇 (resveratrol, RSV) 单独或加入5 mmol/L自噬特异抑制剂(3-methyladenine, 3-MA)、2 μmol/L SIRT1选择性抑制剂(EX527)处理PC12细胞 2 h后,再加入30 μmol/L淀粉样蛋白25-35片段(Amyloid β-protein fragment 25-35, Aβ25-35 )处理24 h。采用CCK-8检测细胞增殖活力,电镜检测自噬体,Western blot检测自噬标志蛋白P62、LC3和SIRT1蛋白的表达水平。 结果 30 μmol/L Aβ25-35可显著降低PC12细胞的增殖活力,为对照组的45.14%(P<0.05)。RSV预处理可显著改善Aβ25-35 诱导的PC12细胞增殖活力下降(P<0.05),且随浓度增加,保护作用增强。同时,RSV可明显促进自噬体的形成,上调SIRT1、LC3-Ⅱ的表达和降低P62的表达,且随浓度增加,表达变化越显著;而加入3-MA和EX527处理能显著抑制RSV的上述效应。 结论 RSV可通过激活SIRT1/自噬通路改善Aβ25-35诱导的神经细胞毒性。
关键词自噬     SIRT1     白藜芦醇    神经细胞毒性    
Resveratrol attenuates Aβ25-35 induced neurotoxicity via activation of SIRT1/autophagy signaling pathway
Deng Haoyue, Mi Mantian     
Department of Nutrition and Food Hygiene Research Center for Nutrition and Food Safety, Chongqing Key Laboratory of Nutrition and Food Safety, Chongqing Center of Medical Nutrition, College of Military Preventive Medicine, Third Military Medical University, Chongqing, 400038, China
Corresponding anthor: Mi Mantian, Tel: 86-23-68772305, E-mail: mantianmi2012@163.com
Abstract: Objective To determine whether resveratrol (RSV) attenuates Aβ25-35 induced neurotoxicity through SIRT1/autophagy signaling pathway. Methods PC12 cells were treated with different concentrations (1, 5, 10 and 20 μmol/L) of RSV for 2 h in the presence or absence of 5 mmol/L 3-methyladenine (3-MA, specific inhibitor of autophagy ) or 2 μmol/L EX527 (selective inhibitor of SIRT1), following by treatment of 30 μmol/L amyloid β-protein fragment 25-35 (Aβ25-35 ) for 24 h. CCK-8 assay was used to detect the cell viability, and electron microscope was applied to detect autophagosome. The expressions of P62, LC3 and SIRT1 were detected by Western blotting. Results25-35 (30 μmol/L) remarkably decreased the viability of PC12 cells, which was 45.14% of the control group (P<0.05). Pretreatment with RSV significantly improved Aβ25-35 induced decrease of cell viability in a dose-dependent manner (P<0.05). Simultaneously, RSV promoted the formation of autophagosome, up-regulated the expressions of SIRT1 and LC3-Ⅱ and down-regulated the expression of P62 in a dose-dependent manner. However 3-MA and EX527 abolished the above effects of RSV. Conclusion RSV attenuates Aβ25-35 induced neurotoxicity through activation of SIRT1/autophagy signaling pathway.
Key words: autophagy     SIRT1     resveratrol     neurotoxicity    

淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)引起的神经细胞毒性被认为是诱导和促进阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)发生的关键所在,已成为AD防治的靶点[1, 2]。白藜芦醇(resveratrol,RSV)是一种重要得多酚类植物化学物,流行病学调查和大量实验研究表明,RSV能够显著抑制AD,有效预防AD的发生、发展[3]。然而,其具体的作用机制有待进一步的研究。新近研究发现,自噬在AD的发生发展中有重要的保护作用;而RSV能通过激活沉默信息调节因子(silent mating type information regulation 2 homolog 1,SIRT1)诱导细胞自噬,可能与其防治AD有关[4]。本研究通过体外试验,采用淀粉样蛋白25-35片段(Amyloid β-protein fragment 25-35,Aβ25-35)处理大鼠神经细胞株PC12细胞建立神经细胞损伤模型,利用自噬特异抑制剂(3-methyladenine,3-MA)或SIRT1选择性抑制剂(EX527)处理,以探讨SIRT1/自噬通路在RSV改善Aβ25-35诱导的神经细胞毒性中发挥的作用。

1 材料与方法 1.1 实验试剂

大鼠肾上腺嗜铬瘤(PC12)细胞株购自中科院上海细胞所;高糖DMEM培养基、胰蛋白酶和胎牛血清(FBS)购自美国Hyclone公司;RSV、Aβ25-35、3-MA、EX527、和LC3抗体购自美国Sigma公司;P62抗体购自英国Abcam公司;SIRT1抗体购自美国Cell Signaling Technology公司;Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测试剂盒购自日本Dojindo公司。

1.2 细胞处理

PC12细胞利用DMEM完全培养基(含FBS 10%)进行传代培养。实验分组和处理如下: Aβ25-35组:用30 μmol/L Aβ25-35处理24 h;RSV+Aβ25-35组:不同浓度(1、5、10、20 μmol/L)RSV处理2 h后,加入30 μmol/L Aβ25-35继续处理24 h;RSV+Aβ25-35+3-MA/EX527组:5 mmol/L 3-MA或2 μmol/LEX527 处理1 h后,加入20 μmol/L RSV2 h后,加入30 μmol/L Aβ25-35继续处理24 h;Aβ25-35+3-MA组:加入5 mmol/L 3-MA处理1 h后加入30 μmol/L Aβ25-35继续处理24 h;对照组加入0.1%DMSO培养24 h。

1.3 细胞增殖活力检测

取对数生长期的PC12细胞,按照每孔1.5万个细胞的密度接种于96孔板中,每组设4个复孔。接种24 h后,按照1.2的分组依次加入相应的处理因素。培养结束后,依据CCK-8试剂盒说明书进行操作后,利用酶标仪检测每孔在450 nm处的光密度值[D(450)]。将对照组细胞增殖活力设为100%,其他各组细胞增殖活力=[处理组D(450)/空白组D(450)]×100%。

1.4 蛋白表达检测

概述如下,待细胞处理终止后,利用RIPA裂解细胞,离心后搜集细胞总蛋白。采用Bradford测定各样本蛋白浓度,而后,每组取40 μg蛋白煮沸变性后上样,15%聚丙烯酰胺凝胶电泳,用湿转法进行转膜。而后,用含5%奶粉的TBS封闭2 h后,一抗(1 ∶1 000稀释)4 ℃孵育过夜。回收一抗,TBST洗膜10 min×3次,再加入二抗(1 ∶8 000稀释)22 ℃ 孵育2 h。回收二抗,并使用TBST洗膜10 min×3次,加入化学发光液,采用VILBER FUSION FX7成像系统自动曝光。

1.5 统计学处理

计量资料以x±s表示,应用SPSS 13.0软件对数据进行单因素方差分析,P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 PC12细胞形态学观察

图 1所示,与对照组相比,Aβ25-35(30 μmol/L) 组细胞变圆、折光度降低,细胞数量明显减少,突触消失。而随RSV浓度增加,细胞数量增加,突触伸长,当RSV浓度为20 μmol/L时,细胞形态与对照组相近。

A:Aβ25-35(30 μmol/L)组; B:RSV(5 μmol/L)+Aβ25-35 (30 μmol/L)组; C: RSV(10 μmol/L)+Aβ25-35(30 μmol/L)组; D: RSV(20 μmol/L) +Aβ25-35(30 μmol/L)组 图 1 倒置显微镜观察各组PC12 细胞形态变化 (×400)
2.2 RSV对Aβ25-35诱导的PC12细胞增殖活力下降的影响

图 2所示,Aβ25-35处理组细胞增殖活力显著下降,为对照组的45.14%(P<0.05);而RSV干预后能显著抑制Aβ25-35诱导的细胞增殖活力下降,且随着RSV处理浓度的增加,细胞增殖活力增强(P<0.05)。当RSV浓度为20 μmol/L时,PC12细胞增殖活力与对照组接近。

a:P<0.05,与对照组比较;b:P<0.05,与Aβ25-35(30 μmol/L) 处理组比较 图 2 RSV对Aβ25-35诱导的PC12细胞增殖活力下降的影响
2.3 RSV对PC12细胞自噬标志蛋白表达的影响

采用Western blot检测结果显示,RSV预处理后加或不加Aβ25-35,RSV均可明显增加LC3-Ⅱ的表达,同时促进了P62的降解;且随着RSV处理浓度的增加,蛋白表达变化越显著(图 3)。

A:RSV预处理;B:RSV预处理后加Aβ25-35 图 3 RSV对PC12细胞自噬标志蛋白表达的影响
2.4 自噬在RSV改善Aβ25-35诱导的PC12细胞增殖活力下降中的作用

图 4所示,利用电镜检测细胞自噬体发现,与 Aβ25-35组比较,RSV可显著促进细胞自噬体的形成(图中红色箭头所示),而3-MA干预后,可显著抑制RSV的这一作用。Western blot法检测发现,RSV处理后可显著提高LC3-Ⅱ的表达,同时促进P62的降解;加入3-MA后,RSV引起的LC3-Ⅱ和P62的表达变化被明显抑制。最后,利用CCK-8法检测细胞增殖活力发现,3-MA处理抑制细胞自噬后,RSV对Aβ25-35诱导的PC12细胞增殖活力下降的改善作用被明显抑制(P<0.05,图 5)。

A:Aβ25-35(30 μmol/L)组; B: RSV(20 μmol/L)+Aβ25-35(30 μmol/L)组; C:RSV(20 μmol/L)+Aβ25-35(30 μmol/L)+3-MA(5 mmol/L)组 图 4 电镜检测PC12细胞自噬体的形成(箭头示自噬体)
图 5 Western blot 检测自噬在RSV改善Aβ25-35诱导的PC12细胞增殖活力下降中的作用
2.5 RSV对SIRT1蛋白表达的影响

图 6所示,利用Western blot检测不同处理组SIRT1蛋白表达发现,RSV单独或与Aβ25-35共同处理后,RSV均可促进SIRT1蛋白的表达,且随着RSV浓度的增加SIRT1的表达越强。

A:RSV单独处理; B:RSV与Aβ25-35共同处理 图 6 RSV对SIRT1蛋白表达的影响
2.6 SIRT1在RSV诱导PC12细胞自噬中的作用

图 7所示,与Aβ25-35组比较,RSV+Aβ25-35组SIRT1、LC3-Ⅱ表达显著增加,P62表达显著减弱,而EX527处理后能显著抑制RSV诱导的SIRT1、LC3-Ⅱ和P62表达变化。利用CCK-8检测细胞增殖活力发现,EX527处理抑制细胞自噬后,RSV对Aβ25-35诱导的PC12细胞增殖活力下降的改善作用被明显抑制(P<0.05)。

图 7 Western blot 检测SIRT1在RSV诱导PC12细胞自噬中的作用
3 讨论

RSV是一种天然的多酚类化合物,主要存在于70多种不同植物的表皮和种子内,包括葡萄、浆果类、谷物、茶和花生等[3]。它主要以两种同分异构体形式存在,包括顺式和反式结构,其中,反式RSV是一种无毒的立体异构体,Orallo等[5]研究报道指出该类型具有益于健康效应。同时,Baur等[6]研究表明由于RSV在进入血液与葡萄糖苷形成结合物后,可轻松透过血脑屏障,故在预防阿尔茨海默病、帕金森病、脑缺血及亨廷顿舞蹈症等神经退行性病变疾病中具有重要作用。研究证实,RSV可抑制Aβ蛋白聚集并调节神经细胞的存活与凋亡,但其具体的作用机制尚不明确[7]。本研究通过体外构建AD细胞损伤模型,模拟AD发生时Aβ25-35对神经细胞的毒性作用;同时,以RSV作为干预因素,观察到RSV能显著改善Aβ25-35处理的神经细胞毒性,在此基础上进一步探讨RSV对Aβ25-35 诱导的神经细胞毒性的作用机制。

细胞自噬在多种疾病包括肿瘤、心血管疾病及AD等的发生、发展中有重要作用。本研究观察了SIRT1/自噬通路在RSV改善Aβ25-35诱导的神经细胞毒性中的作用。结果发现,RSV能够显著增加自噬体的形成、LC3-Ⅱ的表达,同时促进P62蛋白的降解。有研究表明RSV具有激活自噬的特性,可通过调控自噬发挥健康保护效应[4, 8]。我们的结果表明在Aβ25-35作用的条件下,RSV可显著诱导PC12细胞自噬的发生。同时,利用自噬的特异抑制剂3-MA处理PC12细胞[9],以进一步证实RSV通过诱导自噬实现对Aβ25-35诱导的神经细胞毒性的保护作用。结果显示,3-MA显著抑制了RSV处理引起的 PC12细胞自噬的发生,进而抑制了RSV对PC12细胞增殖活力的保护作用。提示,RSV可通过诱导细胞自噬保护PC12细胞。

SIRT1 是sirtuins 家族成员之一,具有显著的去乙酰化酶活性,在调节细胞氧化应激、炎症反应及细胞自噬,维持细胞稳态中有重要作用。研究已经证实,SIRT1在介导RSV的健康保护效应中起关键作用[6, 10]。本实验室前期研究也发现,RSV可通过SIRT1依赖性的激活自噬,从而抑制内皮细胞炎性损伤和肝细胞脂肪变性[11, 12]。本研究中我们发现RSV可浓度依赖性地增加PC12细胞SIRT1蛋白的表达;利用SIRT1特异抑制剂EX527干预后,发现RSV诱导的LC3-Ⅱ、P62的表达变化及其对神经细胞毒性的保护作用均受到明显地抑制。以上结果表明,SIRT1在RSV诱导细胞自噬改善Aβ25-35诱导的神经细胞毒性中有重要作用。

参考文献
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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201507141
中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准,
由第三军医大学主管、主办

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邓皓月,糜漫天
Deng Haoyue, Mi Mantian
白藜芦醇通过上调SIRT1/自噬通路改善Aβ25-35对PC12细胞增殖的抑制作用
Resveratrol attenuates Aβ25-35 induced neurotoxicity via activation of SIRT1/autophagy signaling pathway
第三军医大学学报, 2016, 38(6): 619-622
J Third Mil Med Univ, 2016, 38(6): 619-622.
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201507141

文章历史

收稿:2015-07-23
修回:2015-09-21

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