淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)引起的神经细胞毒性被认为是诱导和促进阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)发生的关键所在,已成为AD防治的靶点[1, 2]。白藜芦醇(resveratrol,RSV)是一种重要得多酚类植物化学物,流行病学调查和大量实验研究表明,RSV能够显著抑制AD,有效预防AD的发生、发展[3]。然而,其具体的作用机制有待进一步的研究。新近研究发现,自噬在AD的发生发展中有重要的保护作用;而RSV能通过激活沉默信息调节因子(silent mating type information regulation 2 homolog 1,SIRT1)诱导细胞自噬,可能与其防治AD有关[4]。本研究通过体外试验,采用淀粉样蛋白25-35片段(Amyloid β-protein fragment 25-35,Aβ25-35)处理大鼠神经细胞株PC12细胞建立神经细胞损伤模型,利用自噬特异抑制剂(3-methyladenine,3-MA)或SIRT1选择性抑制剂(EX527)处理,以探讨SIRT1/自噬通路在RSV改善Aβ25-35诱导的神经细胞毒性中发挥的作用。
1 材料与方法 1.1 实验试剂大鼠肾上腺嗜铬瘤(PC12)细胞株购自中科院上海细胞所;高糖DMEM培养基、胰蛋白酶和胎牛血清(FBS)购自美国Hyclone公司;RSV、Aβ25-35、3-MA、EX527、和LC3抗体购自美国Sigma公司;P62抗体购自英国Abcam公司;SIRT1抗体购自美国Cell Signaling Technology公司;Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测试剂盒购自日本Dojindo公司。
1.2 细胞处理PC12细胞利用DMEM完全培养基(含FBS 10%)进行传代培养。实验分组和处理如下: Aβ25-35组:用30 μmol/L Aβ25-35处理24 h;RSV+Aβ25-35组:不同浓度(1、5、10、20 μmol/L)RSV处理2 h后,加入30 μmol/L Aβ25-35继续处理24 h;RSV+Aβ25-35+3-MA/EX527组:5 mmol/L 3-MA或2 μmol/LEX527 处理1 h后,加入20 μmol/L RSV2 h后,加入30 μmol/L Aβ25-35继续处理24 h;Aβ25-35+3-MA组:加入5 mmol/L 3-MA处理1 h后加入30 μmol/L Aβ25-35继续处理24 h;对照组加入0.1%DMSO培养24 h。
1.3 细胞增殖活力检测取对数生长期的PC12细胞,按照每孔1.5万个细胞的密度接种于96孔板中,每组设4个复孔。接种24 h后,按照1.2的分组依次加入相应的处理因素。培养结束后,依据CCK-8试剂盒说明书进行操作后,利用酶标仪检测每孔在450 nm处的光密度值[D(450)]。将对照组细胞增殖活力设为100%,其他各组细胞增殖活力=[处理组D(450)/空白组D(450)]×100%。
1.4 蛋白表达检测概述如下,待细胞处理终止后,利用RIPA裂解细胞,离心后搜集细胞总蛋白。采用Bradford测定各样本蛋白浓度,而后,每组取40 μg蛋白煮沸变性后上样,15%聚丙烯酰胺凝胶电泳,用湿转法进行转膜。而后,用含5%奶粉的TBS封闭2 h后,一抗(1 ∶1 000稀释)4 ℃孵育过夜。回收一抗,TBST洗膜10 min×3次,再加入二抗(1 ∶8 000稀释)22 ℃ 孵育2 h。回收二抗,并使用TBST洗膜10 min×3次,加入化学发光液,采用VILBER FUSION FX7成像系统自动曝光。
1.5 统计学处理计量资料以x±s表示,应用SPSS 13.0软件对数据进行单因素方差分析,P<0.05认为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 PC12细胞形态学观察如图 1所示,与对照组相比,Aβ25-35(30 μmol/L) 组细胞变圆、折光度降低,细胞数量明显减少,突触消失。而随RSV浓度增加,细胞数量增加,突触伸长,当RSV浓度为20 μmol/L时,细胞形态与对照组相近。
2.2 RSV对Aβ25-35诱导的PC12细胞增殖活力下降的影响如图 2所示,Aβ25-35处理组细胞增殖活力显著下降,为对照组的45.14%(P<0.05);而RSV干预后能显著抑制Aβ25-35诱导的细胞增殖活力下降,且随着RSV处理浓度的增加,细胞增殖活力增强(P<0.05)。当RSV浓度为20 μmol/L时,PC12细胞增殖活力与对照组接近。
2.3 RSV对PC12细胞自噬标志蛋白表达的影响采用Western blot检测结果显示,RSV预处理后加或不加Aβ25-35,RSV均可明显增加LC3-Ⅱ的表达,同时促进了P62的降解;且随着RSV处理浓度的增加,蛋白表达变化越显著(图 3)。
2.4 自噬在RSV改善Aβ25-35诱导的PC12细胞增殖活力下降中的作用如图 4所示,利用电镜检测细胞自噬体发现,与 Aβ25-35组比较,RSV可显著促进细胞自噬体的形成(图中红色箭头所示),而3-MA干预后,可显著抑制RSV的这一作用。Western blot法检测发现,RSV处理后可显著提高LC3-Ⅱ的表达,同时促进P62的降解;加入3-MA后,RSV引起的LC3-Ⅱ和P62的表达变化被明显抑制。最后,利用CCK-8法检测细胞增殖活力发现,3-MA处理抑制细胞自噬后,RSV对Aβ25-35诱导的PC12细胞增殖活力下降的改善作用被明显抑制(P<0.05,图 5)。
2.5 RSV对SIRT1蛋白表达的影响如图 6所示,利用Western blot检测不同处理组SIRT1蛋白表达发现,RSV单独或与Aβ25-35共同处理后,RSV均可促进SIRT1蛋白的表达,且随着RSV浓度的增加SIRT1的表达越强。
2.6 SIRT1在RSV诱导PC12细胞自噬中的作用如图 7所示,与Aβ25-35组比较,RSV+Aβ25-35组SIRT1、LC3-Ⅱ表达显著增加,P62表达显著减弱,而EX527处理后能显著抑制RSV诱导的SIRT1、LC3-Ⅱ和P62表达变化。利用CCK-8检测细胞增殖活力发现,EX527处理抑制细胞自噬后,RSV对Aβ25-35诱导的PC12细胞增殖活力下降的改善作用被明显抑制(P<0.05)。
3 讨论RSV是一种天然的多酚类化合物,主要存在于70多种不同植物的表皮和种子内,包括葡萄、浆果类、谷物、茶和花生等[3]。它主要以两种同分异构体形式存在,包括顺式和反式结构,其中,反式RSV是一种无毒的立体异构体,Orallo等[5]研究报道指出该类型具有益于健康效应。同时,Baur等[6]研究表明由于RSV在进入血液与葡萄糖苷形成结合物后,可轻松透过血脑屏障,故在预防阿尔茨海默病、帕金森病、脑缺血及亨廷顿舞蹈症等神经退行性病变疾病中具有重要作用。研究证实,RSV可抑制Aβ蛋白聚集并调节神经细胞的存活与凋亡,但其具体的作用机制尚不明确[7]。本研究通过体外构建AD细胞损伤模型,模拟AD发生时Aβ25-35对神经细胞的毒性作用;同时,以RSV作为干预因素,观察到RSV能显著改善Aβ25-35处理的神经细胞毒性,在此基础上进一步探讨RSV对Aβ25-35 诱导的神经细胞毒性的作用机制。
细胞自噬在多种疾病包括肿瘤、心血管疾病及AD等的发生、发展中有重要作用。本研究观察了SIRT1/自噬通路在RSV改善Aβ25-35诱导的神经细胞毒性中的作用。结果发现,RSV能够显著增加自噬体的形成、LC3-Ⅱ的表达,同时促进P62蛋白的降解。有研究表明RSV具有激活自噬的特性,可通过调控自噬发挥健康保护效应[4, 8]。我们的结果表明在Aβ25-35作用的条件下,RSV可显著诱导PC12细胞自噬的发生。同时,利用自噬的特异抑制剂3-MA处理PC12细胞[9],以进一步证实RSV通过诱导自噬实现对Aβ25-35诱导的神经细胞毒性的保护作用。结果显示,3-MA显著抑制了RSV处理引起的 PC12细胞自噬的发生,进而抑制了RSV对PC12细胞增殖活力的保护作用。提示,RSV可通过诱导细胞自噬保护PC12细胞。
SIRT1 是sirtuins 家族成员之一,具有显著的去乙酰化酶活性,在调节细胞氧化应激、炎症反应及细胞自噬,维持细胞稳态中有重要作用。研究已经证实,SIRT1在介导RSV的健康保护效应中起关键作用[6, 10]。本实验室前期研究也发现,RSV可通过SIRT1依赖性的激活自噬,从而抑制内皮细胞炎性损伤和肝细胞脂肪变性[11, 12]。本研究中我们发现RSV可浓度依赖性地增加PC12细胞SIRT1蛋白的表达;利用SIRT1特异抑制剂EX527干预后,发现RSV诱导的LC3-Ⅱ、P62的表达变化及其对神经细胞毒性的保护作用均受到明显地抑制。以上结果表明,SIRT1在RSV诱导细胞自噬改善Aβ25-35诱导的神经细胞毒性中有重要作用。
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