2. 401147 重庆,重庆医科大学附属口腔医院修复科;
3. 401147 重庆,重庆医科大学附属口腔医院正畸科;
4. 401147 重庆,重庆医科大学附属口腔医院牙周科;
5. 401147 重庆,口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室;
6. 401147 重庆,重庆市高校市级口腔生物医学工程重点实验室
2. Department of Prosthodontic, Chongqing Medical University, Chongqing, 401147;
3. Department of Orthodontics, Chongqing Medical University, Chongqing, 401147;
4. Department of Periodontics, Chongqing Medical University, Chongqing, 401147;
5. Chongqing Key Laboratory of Oral Diseases and Biomedicine, Affiliated Hospital of Stomatology, Chongqing Medical University, Chongqing, 401147;
6. Key Laboratory of Oral Biomedical Engineering of Chongqing Higher Education, China
研究表明,内源性骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)成骨活性的减弱可以打破骨稳态,引发骨质疏松[1, 2]。黄酮类小分子化合物与雌激素具有类似的化学结构,能有效恢复骨质疏松动物的骨量[3],是骨质疏松研究领域的焦点。杨梅素作为一种黄酮类化合物,不仅具有优良的抗氧化活性[4, 5, 6, 7],在体外还能可以促进细胞成骨活性[8, 9],抑制破骨活性[10, 11],而目前尚少见其治疗骨质疏松的报道。本研究拟观察腹腔注射杨梅素能否减少去势大鼠的骨量丢失,探讨其对内源性BMMSCs的影响及其明确机制,以期为临床应用提供研究基础。
1 材料与方法 1.1 实验动物与试剂SPF级雌性SD大鼠12只,体质量约180 g[合格证号SCXK(渝2007-0001)]。杨梅素标准品(上海永叶生物,UV≥98%),茜素红(上海谱振生物),血清PINP Elisa试剂盒(上海研辉生物),ALP染色试剂盒、活性氧检测试剂盒(碧云天),Trizol reagent、RNA反转录试剂盒及大鼠β-actin、ALP和Osterix引物(TaKaRa公司)。
1.2 方法 1.2.1 模型建立及腹腔注射实验分为假手术组、OVX组和OVX+Myricetin组。术后1周,OVX+Myricetin组以85 mg/kg、2次/周腹腔注射杨梅素溶液,注射8周;假手术和OVX组以相同的频率注射等体积的甲醇。
1.2.2 皮下注射茜素红取材前10 d和前3 d,以30 mg/kg 的剂量分别皮下注射。
1.2.3 取材8周后取材,常规麻醉,心脏采血并分离血清。分离股骨,用于细胞学与组织学检测。
1.2.4 microCT扫描及茜素红荧光带检测取左侧股骨远心端2 cm,扫描重建;左侧股骨近心端树脂包埋,50 μm厚硬组织切片,荧光显微镜观察荧光条带。
1.2.5 HE染色常规脱钙,石蜡包埋,染色。
1.2.6 血清Ⅰ型前胶原氨基端前肽(Amino-terminal propeptideof typeⅠprocollagen,PINP)检测按操作说明,取10 μL血清检测,检测浓度×5获得终浓度。
1.2.7 BMMSCs成骨能力检测BMMSCs以1×105接种于12孔板,成骨诱导7 d后,ALP染色。同组复孔用于提取总RNA,检测成骨基因表达。
1.2.8 BMMSCs活性氧水平检测BMMSCs以4×104接种于24孔板,贴壁后,加入800 μmol/L的H2O2处理6 h,再加入10 nmol/L的杨梅素预处理18 h。按活性氧试剂盒操作说明染色,荧光显微镜下拍照。同组复孔用于提取总RNA,检测SOD基因表达。
1.2.9 real-time PCR检测TRIzol法提取BMMSCs总RNA,反转录,real-time PCR扩增。β-actin上游引物5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′(20 bp),下游引物5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′(21 bp)。 ALP上游引物5′-GCACAACATCAAGGACATCG-3′(20 bp),下游引物5′-AGGGAAGGGTCAGTCAGG-3′(18 bp)。Osterix 上游引物5′-GAGTAGGATTGTAGGATTGG-3′(20 bp),下游引物5′-TGCTTGAGGAAGTTCACTATGGC-3′(23 bp)。SOD上游引物5′-TGACCTGCCTTACGACTA-3′(18 bp),下游引物5′-CGACCTTGCTCCTTATTG-3′(18 bp)。
1.3 统计学分析采用SPSS17.0统计软件,数据以x±s表示,3组间比较采用单因素方差分析。
2 结果 2.1 成功建立骨质疏松模型OVX组的BV/TV、Tb.N和Tb.Th低于假手术组,而Tb.Sp高于假手术组(图 1、表 1);HE切片中,OVX组的骨小梁少于假手术组(图 2)。OVX组的血清PINP浓度低于假手术组(表 1)。OVX组的成骨速率低于假手术组(图 3、表 1)。
(n=4, x±s) | ||||||
组别 | BV/TV | Tb.N(/mm) | Tb.Th(mm) | Tb.Sp(mm) | PINP(ng/mL) | 成骨速率(μm/d) |
假手术组 | 0.42±0.02 | 3.54±0.13 | 0.072±0.003 | 0.047±0.013 | 5.818±0.974 | 3.319±0.346 |
OVX组 | 0.22±0.03a | 1.56±0.12a | 0.040±0.006a | 0.161±0.015a | 2.088±0.489a | 1.553±0.189* |
OVX+Myricetin组 | 0.31±0.02ab | 2.34±0.09ab | 0.059±0.002ab | 0.117±0.010ab | 3.565±0.527ab | 2.195±0.163ab |
a: P<0.05,与假手术组比较;b: P<0.05,与OVX组比较 |
OVX+Myricetin组的BV/TV、Tb.N参数高于OVX组,而Tb.Sp低于OVX组(图 1、表 1);HE切片中,OVX+Myricetin组的骨小梁多于OVX组(图 2)。 OVX+Myricetin组的血清PINP浓度高于OVX组(表 1)。 OVX+Myricetin组的成骨速率高于OVX组(图 3、表 1)。
2.3 杨梅素可以降低内源性ROS水平,并恢复内源性BMMSCs的成骨活性与假手术组相比,OVX组内源性BMMSCs的ROS水平升高,SOD表达降低。而与OVX组相比,OVX+Myricetin组的内源性ROS水平降低,SOD表达升高。OVX组内源性BMMSCs的ALP活性、成骨基因ALP和Osterix的表达量低于假手术组,而OVX+Myricetin组则高于OVX组。见图 4、图 5、表 2。
(n=4, x±s) | |||
组别 | SOD | ALP | Osterix |
假手术组 | 9.25±0.63 | 11.12±1.14 | 10.73±1.20 |
OVX组 | 3.03±0.80a | 2.90±0.80a | 4.27±0.92a |
OVX+Myricetin组 | 6.07±0.47ab | 5.92±0.63ab | 8.05±0.48ab |
a: P<0.05,与假手术组比较; b: P<0.05,与OVX组比较 |
我们在体外利用H2O2处理外源性BMMSCs模拟OVX大鼠内源性BMMSCs的状态。外源性BMMSCs用H2O2处理后,ROS水平高于未处理的BMMSCs,SOD表达降低;而加入杨梅素后ROS水平降低,SOD表达升高(图 6、图 7、表 3)。外源性BMMSCs用H2O2处理后,ALP活性、成骨基因ALP和osterix表达低于未处理的BMMSCs;加入杨梅素后ALP活性、成骨基因ALP和osterix表达升高。
(n=4, x±s) | |||
组别 | SOD | ALP | Osterix |
BMMSCs | 6.73±0.53 | 9.74±0.54 | 12.18±0.79 |
BMMSCs+H2O2 | 2.29±0.33a | 3.42±0.93a | 4.79±0.81a |
BMMSCs+H2O2+Myr | 6.40±0.36b | 8.43±1.01b | 7.68±0.69ab |
a: P<0.05,与假手术组比较;b: P<0.05,与OVX组比较 |
目前临床主流药物虽然能够在一定程度上治疗骨质疏松,但是仍然存在一些副作用或者应用缺陷[12, 13, 14],因此急需寻找到一种疗效与安全俱佳的药物。杨梅素不仅具有黄酮类化学结构,毒性也较其他黄酮类化合物低,并且有较好的抗氧化作用,具有成为骨质疏松治疗药物的潜质。
本实验成功建立了骨质疏松模型。通过microCT扫描及参数分析,明确腹腔注射杨梅素后,可以有效减少OVX大鼠的骨量丢失,改善骨小梁微结构;HE染色结果与microCT检测结果一致,从组织学上确认了杨梅素的疗效。血清PINP是较为公认的成骨活性指标,杨梅素注射后,血清PINP升高,说明杨梅素促进了OVX大鼠机体的成骨活性。茜素红荧光条带间距离反映两次注射间隔期间内的新骨形成情况,杨梅素注射后,OVX大鼠的荧光条带间距明显加宽,也同样说明杨梅素促进OVX大鼠的内源性成骨活性。杨梅素的抗氧化作用[5, 6, 7]和促进成骨作用已经明确,但是两者之间的上下游关系尚不明确。本研究发现,杨梅素降低ROS的同时,内源性BMMSCs的成骨活性增强。为了进一步确认这一现象,我们在体外利用H2O2处理外源性BMMSCs模拟OVX大鼠内源性BMMSCs的状态,也观察到了类似的现象。所以我们有理由推测杨梅素很可能是通过降低内源性BMMSCs的氧化应激水平,从而促进成骨,最后达到缓解骨质疏松的目的。但是,从结果中也可以看出虽然杨梅素可以有效恢复OVX大鼠的骨量,但是仍无法恢复到正常状态,提示需要对治疗策略进行优化,比如进一步探索给药剂量、频率及时间等,或者联合其他小分子化合物协同治疗,力求达到更好的疗效。
本研究初步表明,杨梅素减少骨量丢失,机制之一是通过降低内源性BMMSCs的ROS水平,促进内源性成骨活性,从而治疗骨质疏松。那么明确影响的靶细胞以及分子机制将是我们进一步研究的重点。机体的骨稳态是在成骨和破骨的动态平衡中维持的,成骨和破骨任何一方的改变都将影响到骨骼。已有研究表明,杨梅素在体外可以有效促进成骨细胞活性[8, 9],抑制破骨细胞活性[10, 11]。
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